核酸浓度
紫外吸收法测定核酸含量
思考题
1．干扰本实验的物质有哪些？ 2. 设计排除这些干扰的实验。
0.024──每毫升溶液内含1μ gRNA的A值；
1mL待测样品液中核酸（微克）
核酸％ ＝
1mL待测样品液中制品的毫克数
在本实验中，1项
1. 紫外分光光度计使用前要预热。
2. 比色皿应成套使用，注意保护,不能拿在光面上。
3. 离心机使用前必须将离心管平衡，对称放置。调速必须 从低到高，离心完等转子完全停下后，再打开盖子，然 后将转速打到最低。
4.测定A280的值。求出A260/A280.判断RNA的纯度。 RNA=A260/A280=2.0
二、计算公式
ΔA260
RNA浓度 =
xN
0.024 x L
式中， ΔA260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释 液在260nm波长处A值；
L ──比色杯的厚度，1cm；
N ——为稀释倍数；
实验十六 紫外吸收法测定核酸含量
目的要求 学习紫外线（UV）吸收法 测定核酸浓度 的原理。
实验原理
核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有 吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸 的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升 溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值） （表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以 计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅 速，并对被测样品无损，用量也少。
试剂和器材
• 试剂：
• 材料
• 钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取 3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼 酸铵溶于96.4mL蒸馏水中， 即成0.25%钼酸铵－2.5%过 氯酸溶液。
酵母RNA干粉。
请节约使用。 每八个同学用一份， 即50 ml/8人
紫外分光光度计检测核酸浓度和纯净度
紫外分光光度计检测核酸浓度和纯净度
A260是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值范围是0.1到1.0，如果不在次范围建议稀释或浓缩样品；样品吸光度小于0.05,检查是否存在操作因素，正常情况下，DNA样品的吸光度一定大于0.1，样品中出现杂质或者不错纯净会使吸光度减小。
A280是蛋白和酚类最高吸收峰的吸收波长。
因此A260/A280的比值可以对核酸纯度进行评估，一般情况下，纯净的DNA的A260/A280比值为1.8,纯净的RNA为2.0. 如果比值较低，表明样品中存在蛋白或者酚类物质的污染，需要纯化样品，特别说明A260/A280=1.5时，相当于50%蛋白质/DNA溶液。
A230 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，A260/A230比值可以对核酸样品纯度进行评估，纯净的DNA或者RNA的A260/A230比值为2.5。
如果比值小于2.0，说明样品存在碳水化合物、盐类、有机物的污染，需要纯化样品。
特别说明，A230产生负值主要是由于在很低的DNA浓度
A320/A340 检测吸光值用于检测样品溶液的浊度和其他干扰因子。
纯净的样品改值为0.00,如果不是，说明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
a260测定核酸浓度原理
a260测定核酸浓度原理
A260测定核酸浓度的原理基于核酸在260nm波长下的强烈吸收特性。
在DNA和RNA分子的结构中，存在芳香碱基（例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶/尿嘧啶），这些碱基在260nm波长下有强烈的吸收。
因此，当光通过核酸溶液时，会在260nm处被吸收，其吸收度（吸光度）可以用来测定核酸的浓度。
通过比尔-兰伯特定律，可以将吸光度与核酸浓度联系起来。
具体来说，当光程为一个吸收单位（A260=1）时，双链DNA的浓度约为5μg/ml，单链RNA的浓度约为4μg/ml。
因此，通过测定溶液在260nm处的吸光度（A260值），可以计算出核酸的浓度。
以上内容仅供参考，建议查阅核酸相关的书籍获取更多信息。
DNA拷贝数的计算方法
DNA拷贝数的计算方法1 A260 吸光度值= ds DNA 50 ug/ml= ss DNA 33 ug/ml= ss RNA 40 ug/ml核酸浓度=（OD260）×（dilution factor）×（33/40/50）= ng/ul平均分子量（MW）代表克/摩尔，单位道尔顿（dolton），即1dolton=1g/mol1摩尔=6.02×1023平均分子量（MW）:dsDNA=(碱基数) x (660 道尔顿/碱基)ssDNA=(碱基数) x (330 道尔顿/碱基)ssRNA=(碱基数) x (340 道尔顿/碱基)拷贝数计算公式:(6.02 x 1023次拷贝数/摩尔) x (浓度g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml.(6.02 x 1023次拷贝数/摩尔) x (浓度g/ml) / (DNA长度×660) = copies/ml.(6.02 x 1023次拷贝数/摩尔) x (ng/ul×10-9) / (DNA长度×660) = copies/ul.例：3000 碱基质粒，浓度100 ng/ml ，MW = 3000 bp x 660 dalton/bp = 1.98 x 106 daltons，1 mol = 1.98 x 106g.(6.02 x 10的23次拷贝数/摩尔) x (1x10的-7次克/微升) / (1.98 x 10的6次克/摩尔) = 3 x 1010次copies/ml.梯度配制方法：低浓度使用胎盘DNA 20ng/ul；高浓度使用灭菌水配制，20ng 基因组DNA所包含的拷贝数：6.02×3 x 1023 x20ng/2.91 x109 x660=6289个拷贝数。
核酸以及核苷酸的基本换算
(1.4) 核酸末端浓度： 环状 DNA： pmol ends = pmol DNA ′ number of cuts ′ 2 线性 DNA： pmol ends = pmol DNA ′ (number of cuts ′ 2 + 2)
1 pmol 1,000bp DNA = 0.66 mg 1 pmol pUC18/19 DNA (2,688bp) = 1.77 mg 1 pmol pBR322 DNA (4,361bp) = 2.88 mg 1 pmol SV40 DNA (5,243bp) = 3.46 mg 1 pmol FX174 DNA (5,386bp) = 3.54 mg 1 pmol M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 4.78 mg 1 pmol l phage DNA (48,502bp) = 32.01 mg
(2.3) 双链 DNA 与寡核苷酸的熔点 短于 25bp 的双链寡核苷酸： Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C) 长于 25bp 的双链寡核苷酸： Tm = 81.5 + 16.6 ( lg[J+] ) + 0.41 (%GC) – (600/N) – 0.63 (%Formamide) N —— 引物的长度(以碱基数计算) J+ —— 单价阳离子浓度
核酸以及核苷酸的基本换算
1．核酸的换算： (1.1) 摩尔数与质量： 1 mg 1,000bp DNA = 1.52 pmol 1 mg pUC18/19 DNA (2,688bp) = 0.57 pmol 1 mg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol 1 mg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol 1 mg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28 pmol 1 mg M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 0.21 pmol 1 mg l phage DNA (48,502bp) = 0.03 pmol
核酸浓度检测实验报告
一、实验目的本实验旨在掌握核酸浓度检测的原理和方法，通过学习并操作核酸浓度检测实验，了解核酸浓度的定量测定，以及相关仪器的使用方法。
二、实验原理核酸浓度检测是通过测定溶液中核酸的量来反映样品中核酸的含量。
本实验采用比色法进行核酸浓度检测，其原理如下：1. 核酸分子中含有一定比例的磷，因此通过测定核酸中磷的含量，可以推算出核酸的浓度。
2. 将核酸溶液中的磷元素转化为无机磷，使其与钼酸铵反应生成磷钼酸铵。
3. 在还原剂的作用下，磷钼酸铵中的钼元素被还原成钼蓝，其颜色深浅与磷含量成正比。
4. 通过比色法测定钼蓝的吸光度，从而计算出核酸的浓度。
三、实验器材与试剂1. 实验器材：核酸样品、克氏烧瓶、容量瓶、吸管、试管、722型分光光度计、电炉、水浴锅。
2. 实验试剂：标准磷溶液、定磷试剂（17%硫酸、钼酸铵）。
四、实验步骤1. 准备工作：将核酸样品用蒸馏水稀释至一定浓度，取适量溶液于克氏烧瓶中。
2. 消化：向克氏烧瓶中加入适量的17%硫酸和钼酸铵，混合均匀，置于电炉上加热至沸腾，保持沸腾状态约5分钟。
3. 冷却：将消化后的溶液冷却至室温。
4. 定容：将消化后的溶液转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。
5. 比色：用722型分光光度计测定定容后的溶液在660nm处的吸光度。
6. 计算结果：根据标准曲线计算核酸浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：将已知浓度的标准磷溶液进行比色，绘制标准曲线。
2. 样品浓度计算：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线中查找对应的核酸浓度。
3. 结果分析：比较实验结果与理论值，分析误差产生的原因。
六、实验结论通过本实验，掌握了核酸浓度检测的原理和方法，成功进行了核酸浓度测定。
实验结果表明，本实验方法准确可靠，可用于实际样品的核酸浓度检测。
七、注意事项1. 实验过程中，注意操作规范，防止污染。
2. 样品处理过程中，避免强酸、强碱等对核酸的破坏。
3. 消化过程中，注意控制加热温度和时间，避免过度加热。
核酸纯度检测实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握核酸纯度检测的原理和方法。
2. 熟悉紫外分光光度法在核酸纯度检测中的应用。
3. 了解核酸纯度检测的重要性及其在分子生物学研究中的应用。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，其纯度直接影响到后续实验结果的准确性。
核酸纯度检测主要依据核酸、蛋白质和杂质的紫外吸收特性。
在紫外光谱范围内，核酸的最大吸收峰通常位于260nm，蛋白质的最大吸收峰位于280nm。
通过测定核酸样品在260nm和280nm处的光密度值（OD值），可以计算出核酸的浓度和纯度。
三、实验材料1. 试剂：核酸提取试剂盒、超纯水、无RNA酶DNase、RNase、10×TE缓冲液、酚/氯仿/异戊醇溶液、无水乙醇、75%乙醇、SDS、NaCl等。
2. 仪器：紫外分光光度计、高速离心机、微量移液器、Eppendorf管等。
四、实验方法1. 核酸提取：按照核酸提取试剂盒说明书进行操作，提取DNA或RNA。
2. 核酸纯度检测：（1）核酸样品的制备：取适量提取的核酸，用无RNA酶DNase或RNase处理，去除杂质。
（2）核酸浓度测定：取适量处理后的核酸样品，用超纯水稀释至合适浓度。
将稀释后的核酸样品在260nm和280nm处测定光密度值。
（3）核酸纯度计算：根据核酸浓度和光密度值，计算核酸纯度。
公式如下：纯度（%）=（OD260/OD280）× 100%五、实验结果与分析1. 核酸浓度测定结果：实验结果显示，所提取的核酸样品在260nm处的OD值为0.6，在280nm处的OD值为0.4。
2. 核酸纯度计算结果：根据公式计算，核酸纯度为（0.6/0.4）× 100% = 150%。
3. 结果分析：实验结果显示，所提取的核酸样品纯度较高，符合实验要求。
这表明实验过程中操作规范，核酸提取效果较好。
六、实验结论1. 本实验采用紫外分光光度法对核酸纯度进行了检测，结果表明该方法操作简便、快速，适用于实验室常规核酸纯度检测。
核酸浓度、纯度的检测DNA的电泳检测
实 验 四、 核酸浓度、纯度的检测
DNA的电泳检测
实 验 目的
0.6%
1Kb
1%
0.6Kb
1.4%
0.2Kb
2%
0.15Kb琼脂糖凝胶浓度二甲来自青迁移率：与 之相当的DNA大小
1%
2Kb
1.4%
1.6Kb
4、载样缓冲液(Loading Buffer) 注：指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液， 其作用是： 增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加 样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指示带,可预测核酸电泳的速度 和位置 使样品呈色，使加样操作更方便 5、荧光染料(GoldView，GV) GoldView (GV) 是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核 酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在 100ml琼脂糖胶溶液中加入5µl GoldView即可。在紫外透射光
DNA电泳速率与电荷效应无关（随着碱基数的增加，DNA 分子量增加，电荷数也增加，这样荷质比基本维持一个常
数）。
琼脂糖凝胶作为一种固体支持基质,主要利用DNA分子在
电场中的泳动时的分子筛效应来达到分离混合物的目的。
在恒电场的一定电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于
由DNA分子的大小与构型。
③ 胶液的制备：称取0.2g琼脂糖,置于100ml锥形瓶中,加入 20ml 0.5×TBE稀释缓冲液,用保鲜膜封口（避免水蒸气 过度散失），然后在上面用枪头扎个小孔（加热过程中 可以放出少量水汽，以免瓶内压力过大）， 放入微波炉 里加热至琼脂糖全部熔化（1-2min, 液体变透明）,取出 摇匀（烫手！）,此为1%琼脂糖凝胶液。待胶冷却到60 度左右，加入DNA染料Goldview 2 ul，混匀； ④ 倒胶：将胶液缓慢倒入胶板内，注意：倒胶时的温度不 可太低,否则凝固不均匀；速度也不可太快,否则容易出现 气泡。 ⑤ 待胶完全凝固后（10min）,拨出梳子,注意不要损伤凝胶, 然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过凝 胶的上表面。
NanoDrop2000 核酸浓度检测仪标准操作规程作业指导书
NanoDrop2000 核酸浓度检测仪标准操作规程作业指导书1、将仪器的电源线插好，打开电脑。
2、打开ND-2000软件，出现以下界面：3、点Nucleic Acid（核酸定量），仪器提示检测光路是否正常。
4、按照提示放下上探头，按OK。
仪器自检，通过后可继续使用；不能通过时，仪器会报错。
5、点Blank键，仪器以溶剂（例如水）为空白对照，进行调零。
6、将加样表面和上探头的溶剂都用滤纸或脱脂棉吸去，加入2ulDNA样品于加样表面上，放下上探头。
在软件右边的Sample Type（样品类型）中选择样品类型，点Measure（测量），仪器开始定量检测。
7、这时出现一个窗口，让你选择数据文件的存放位置，如下图：8、测量完成后如下图：9、测量蛋白时，选择Protein 280（蛋白定量）；测量细胞液时，选择Cell Cultures（细胞生长）。
操作同DNA定量。
注意事项1、加样量一般为2ul，但当样品较粘稠时，2ul比较难加，可适当提高样品量。
但样品不可过量，需保证样品不从加样台上流下。
2、注意仪器放置环境，防潮、防霉、避免强光直射。
全血基因组提取试剂盒操作程序1.用途：可从全血样品中快速提取基因组DNA，实现平行样本的高通量处理，可用于疾病监测及法医鉴定等领域。
2.试剂：西安天隆公司提供的全血DNA基因核酸提取试剂。
3.适用样本类型：全血，羊水等。
全血样本保存：可立即进行提取，4℃保存不超过24小时，长期保存需置于-20℃。
使用方法：4.Proteinase K 配制：每支Proteinase K干粉中加入300ul Wash Buffer Ⅲ，使其完全溶解，即可使用。
-20℃保存，反复冻融不得超过6次。
5.加样：以下列表格，在96孔板中加入试剂：运行程序：运行完成后，取出96孔板，在第1及第7列中加入20ul Magnetic Beads（使用前混匀）和300ulBinding Buffer，放回仪器中按一下程序运行：程序运行完成后，将第6列及第12列洗脱液转移至已灭菌的离心管中，-20℃保存。
浓度换算公式
核酸、核苷酸的基本换算核酸、核苷酸的基本换算1．核酸的换算：(1)摩尔数与质量：1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol1 μg pUC18/19 DNA (2,688bp) = 0.57 pmol1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28 pmol1 μg M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 0.21 pmol1 μg l phage DNA (48,502bp) = 0.03 pmol1 pmol 1,000bp DNA = 0.66 μg1 pmol pUC18/19 DNA (2,688bp) = 1.77 μg1 pmol pBR322 DNA (4,361bp) = 2.88 μg1 pmol SV40 DNA (5,243bp) = 3.46 μg1 pmol FX174 DNA (5,386bp) = 3.54 μg1 pmol M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 4.78 μg1 pmol l phage DNA (48,502bp) = 32.01 μg(2)光吸收值与浓度：1 OD260 dsDNA = 50 μg/ml = 0.15 mmol/L1 OD260 ssDNA = 33 μg/ml = 0.10 mmol/L1 OD260 ssRNA = 40 μg/ml = 0.12 mmol/L1 mmol/L dsDNA = 6.7 OD2601 mmol/L ssDNA = 10.0 OD2601 mmol/L ssRNA = 8.3 OD260 (3)分子量：1个脱氧核糖核酸碱基的平均分子量为333 Daltons1个核糖核酸碱基的平均分子量为340 Daltons(4)核酸末端浓度：环状DNApmol ends = pmol DNA × number of cuts ×2线性DNApmol ends = pmol DNA×(number of cuts ×2 + 2)1 μg 1,000 bp DNA = 3.04 pmol ends1 μg pUC18/19 DNA (2,688 bp) = 1.14 pmol ends1 μg pBR322 DNA (4,361 bp) = 0.7 pmol ends1 μg SV40 DNA (5,243 bp) = 0.58 pmol ends1 μg FX174 DNA (5,386 bp) = 0.56 pmol ends1 μg M13mp18/19 DNA (7.250 bp) = 0.42 pmol ends1 μg l phage DNA (48,502 bp) = 0.06 pmol ends2．核苷酸的换算：(1)分子量：MW (Da) = 333 × N (number of bases)(2)浓度：C (μmol/L or pmol/ml) = OD260 / (0.01 × N)C (ng/ml) = OD260? MW / (0.01 × N)MW -- molecular weightN -- number of basesOD260 -- absorbance at 260 nm(3)双链DNA与寡核苷酸的熔点短于25bp的双链寡核苷酸Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)长于25bp的双链寡核苷酸Tm = 81.5 + 16.6 ( lg[J+] ) + 0.41 (%GC) - (600/N) - 0.63(%formamide)N -- 引物的长度(以碱基数计算)J+ -- 单价阳离子浓度(4)DNA与表达蛋白之间分子量换算1 kb DNA = 333 amino acid ≈3.7 × 104 Da10,000 Da Protein ≈ 270 bp DNA30,000 Da Protein≈ 810 bp DNA50,000 Da Protein ≈2701 bp DNA100,000 Da Protein ≈ 27 kb DNADNA电泳基本参数1．琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中DNA迁移率（线性DNA分离建议凝胶浓度）分离范围(bp) 琼脂糖浓度分离范围(bp) PAGE浓度1,000～30,000 0.5% 100～1,000 3.5%800～12,000 0.7% 80～500 5.0%500～10,000 1.0% 60～400 8.0%400～7,000 1.2% 40～200 12.0%200～4,000 1.5% 5～100 20.0%50～2,000 2.0%2．变性、非变性PAGE胶中染料迁移率PAGE浓度溴酚蓝二甲苯青（相当核苷酸片段大小，bp）3.5% 100 4605.0% 65 2608.0% 45 16012.0% 20 7015.0% 15 6020.0% 12 45。
核算中质量与浓度的换算
核算中质量与浓度的换算光度计测量的转换:双链DNA (ds DNA)：A260 = OD260 = 1 相当于50 µ50 µg/ml g/ml 溶液溶液单链DNA(ss DNA)：A260 = OD260 = 1相当于33 µ33 µg/ml g/ml 溶液溶液RNA ：A260 = OD260 = 1相当于40 µ40 µg/ml g/ml 溶液溶液参考文献：Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536.核酸分子量计算方程式：吸光度(A)＝摩尔消光系数×浓度×长度 500 bp 的双链DNA ＝325,000 Daltons500 nt*的单链DNA ＝162,500 Daltons *nt = nucleotidedNMP 的平均分子量＝325 Daltons （总的也就是腺苷三磷酸 dNMP ，d 是脱氧的意思,N 是核苷总称(包括ATCG)，M 代表1，P 磷酸基团合起来就是脱氧核苷酸 2’-deoxynucleoside-5’-monophosphate ） 寡聚体定量：寡聚体-寡聚体，是一种由数量较少的单体以共价键重复的连接而成的短多聚体，常是指氨基酸、糖、核苷酸的短多聚体。
其单体的数目一般在20以下，常为2～10个monomerie unit ( mer) ：单体单元，相当于nt 或者BP 都可以。
通常用于双链核酸中的单位，100 mer DNA 相当于每一条链有100nt ，那么整条链就是100bp20-mer ，A260 = 1的贮存液含有5 nmol 寡聚体：5 nmol = 33 µ5 nmol = 33 µg/(20×g/(20×g/(20×325) 325) 40-mer ，A260 = 1的贮存液含有5 nmol 寡聚体：2.5 nmol = 33 µ2.5 nmol = 33 µg/(40×g/(40×g/(40×325) 325) pmol 为单位的引物转换为µg 为单位的引物：为单位的引物：（X pmoles×长度bp×bp×325325）/ 1,000,000 例：10pmoles 的25-mer ，则为，则为（10pmol×10pmol×25bp×25bp×25bp×325325）/ 1,000,000 = 0.081 µ/ 1,000,000 = 0.081 µg primer g primer µg 为单位的引物转换为pmol 为单位的引物：为单位的引物：（X pmoles×X pmoles×1,000,0001,000,000）/（长度bp ×bp ×325325） 例：0.1µ0.1µg g 的20-mer ，则为，则为（0.1µ0.1µg×g×g×1,000,0001,000,000）/（20bp×20bp×325325）= 15.4 pmoles primer pcr 扩增反应引物浓度的计算：引物毫摩尔浓度（mM ）= pmoles/µ= pmoles/µll 例1：100µ100µl PCR l PCR 反应体系中有20pmol 的引物的引物= 0.20 mM 例2：引物为24bp ，并溶解于0.1ml µ0.1ml µl H2O l H2O 中；中；10µ10µl l 溶液稀释至1.0ml 测定其A260为：A260 = OD260 = 0.76；则贮存液在260nm （A260）的吸光度为76；0.1ml 的贮存液含有7.6个单位的A260；引物碱基组成为：A=6, C=6, G=6, T=6；260nm 引物的摩尔消光系数引物的摩尔消光系数= a(16,000) + b(12,000) + c(7,000) + d(9,600) 注：a 、b 、c 、d 分别是分别是 A's 、G's 、C's 、T's 的碱基个数；的碱基个数；PCR 引物的摩尔消光系数= 6(16,000) + 6(12,000) + 6(7,000) + 6(9,600) = 267,600 则PCR 引物贮存液的摩尔浓度为：76/267,600 = 284 mM核酸数据(Nucleic Acid Data)Kd 是kilodaltons 的缩写，既千道尔顿。
核酸浓度测定
核酸的定量与纯度的测定在分子生物学实验中，核酸提取需要进行其纯度和浓度的测定。
目前实验室常用的测定方法主要有分光光度法、荧光染料法、PCR法和杂交定量法等。
分光光度法分光光度法主要包括紫外分光光度法、定糖定磷法及基于酶催化的核酸定量方法等。
（1）紫外分光光度法紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm 处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。
因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA，单链DNA浓度约为33µg / ml，RNA约为40μg/ml，寡核苷酸约为35μg/ml。
如用1cm光径，用H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。
A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。
假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或分类物质的污染，需要纯化样品。
比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。
A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。
若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。
A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。
假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
实验步骤1、将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中pH8.0，10mmo1/L的Tris缓冲液，内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。
生工DNA浓度换算
核酸以及核苷酸的基本换算2010-11-6 7:47:541．核酸的换算：(1.1) 摩尔数与质量：1 mg 1,000bp DNA = 1.52 pmol1 mg pUC18/19 DNA (2,688bp) = 0.57 pmol1 mg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol1 mg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol1 mg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28 pmol1 mg M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 0.21 pmol1 mg l phage DNA (48,502bp) = 0.03 pmol1 pmol 1,000bp DNA = 0.66 mg1 pmol pUC18/19 DNA (2,688bp) = 1.77 mg1 pmol pBR322 DNA (4,361bp) = 2.88 mg1 pmol SV40 DNA (5,243bp) = 3.46 mg1 pmol FX174 DNA (5,386bp) = 3.54 mg1 pmol M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 4.78 mg1 pmol l phage DNA (48,502bp) = 32.01 mg(1.2) 光吸收值与浓度：1 OD260 dsDNA = 50 mg/ml = 0.15 mmol/L1 OD260 ssDNA = 33 mg/ml = 0.10 mmol/L1 OD260 ssRNA = 40 mg/ml = 0.12 mmol/L1 mmol/L dsDNA = 6.7 OD2601 mmol/L ssDNA = 10.0 OD2601 mmol/L ssRNA = 8.3 OD260(1.3) 分子量：1个脱氧核糖核酸碱基的平均分子量为333 Daltons1个核糖核酸碱基的平均分子量为340 Daltons(1.4) 核酸末端浓度：环状DNA：pmol ends = pmol DNA ′ number of cuts ′ 2线性DNA：pmol ends = pmol DNA ′ (number of cuts ′ 2 + 2)1 mg 1,000bp DNA = 3.04 pmol ends1 mg pUC18/19 DNA (2,688bp) = 1.14 pmol ends1 mg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.7 pmol ends1 mg SV40 DNA (5,243bp) = 0.58 pmol ends1 mg FX174 DNA (5,386bp) = 0.56 pmol ends1 mg M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 0.42 pmol ends1 mg l phage DNA (48,502bp) = 0.06 pmol ends2．核苷酸的换算：(2.1) 分子量：MW (Da) = 333 ′ N (number of bases)(2.2) 浓度：C (mmol/L or pmol/ml) = OD260 / (0.01 ′ N)C (ng/ml) = OD260 ′ MW / (0.01 ′ N)MW —— molecular weightN —— number of basesOD260 —— absorbance at 260 nm(2.3) 双链DNA与寡核苷酸的熔点短于25bp的双链寡核苷酸：Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)长于25bp的双链寡核苷酸：Tm = 81.5 + 16.6 ( lg[J+] ) + 0.41 (%GC)– (600/N) – 0.63 (%Formamide)N ——引物的长度(以碱基数计算)J+ ——单价阳离子浓度(2.4) DNA与表达蛋白之间分子量换算1 kb DNA = 333 amino acid ≈ 3.7 ′ 104 Da10,000 Da Protein ≈ 270 bp DNA30,000 Da Protein ≈ 810 bp DNA50,000 Da Protein ≈ 2701 bp DNA100,000 Da Protei n ≈ 27 kb DNA。
RNA浓度的OD比值说明
RNA浓度的OD比值说明OD260/OD280=1.9~2.0 说明RNA居多，纯度已经很高了。
纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存一般来说OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度，OD230代表其他杂质（多糖等）的吸光度。
A代表吸光值，而OD是光密度值，一个意思。
当A260读数处在0.1-0.5 之间，A200 到A320之间的数值构成一条光滑的曲线时，少量苯酚（30 ul/ml）残留会使A230，A260，A280均变大（差不多增加一倍），但A260/A280和A260/A230均在2左右。
少量异硫氰酸胍（132 uM）残留使A230变大，但A260，A280几乎不变，所以A260/A280仍在2左右，而A260/A230大大低于2。
大量异硫氰酸胍（2.4 M）残留使A230，A260，A280均变大，根本就没有办法测定了。
PEG（6.25%）残留使A230，A260，A280均变大，但对A230，A260影响更大，所以A260/A280比2大不少，而A260/A230仍在2左右。
核酸抽提中常用的试剂，如Phenol，GuanidineIsothiocyanate，PEG都能使A260和A280的值变大，但是却可能使二者的比值与高纯度核酸的比值一致。
因为A260值几乎是峰值，所以有必要在其两边各取一个：A280和A230。
干净的核酸A260/A230应该在2左右。
如果有在230 nm 处的强吸收提示污染有酚盐离子等有机化合物解决办法：1. 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。
减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。
加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。
如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。
核酸生物化学实验技术实验
核酸生物化学实验步骤（一）酵母中RNA的提取及紫外分光光度法测定核酸浓度1．稀碱法提取酵母中RNA实验原理：基于核酸不溶于乙醇。
先用稀碱将酵母细胞裂解，采用酸中和，通过离心去除菌体细胞的大碎片，采用乙醇可将上清液中的RNA沉淀出来。
该方法提取的核酸分子为变性失活的RNA。
操作方法：（1）称取2 g干酵母粉，放入100 mL烧杯中，加入20 mL 的1%氢氧化钠水溶液，搅拌30 min （玻璃棒手动充分搅拌）。
（2）30 min后，向（1）中加入少量乙酸调节pH至中性（切忌调节pH低于3，RNA的等电点2-2.5），试纸检查。
（3）将（2）全部转移至离心管中，3800 rpm离心10 min（最大装液量离心管体积的三分之二，等分两个离心管进行离心）。
弃沉淀（主要是细胞壁等碎片），留上清（含有RNA）。
（4）将上清液转移至干净的100 mL烧杯中，加入15 mL 95%的乙醇，充分混匀，静置10 min。
（此时，大部分RNA沉积于烧杯底部，转移时需要搅动，以免丢失RNA。
因此该步骤也可将上清液直接转移到离心管，静置10 min是必要的）（5）将（4）转移至离心管，3800 rpm离心5 min（一次离心管装不下，分两次离心），弃掉上清液，用95%乙醇重悬，离心洗涤2次，每次95%乙醇用量5 mL。
（6）将洗涤后的样品转移至干净的表面皿（已称重）上，95℃水浴蒸汽干燥（约10 min左右），称重计算干酵母中RNA含量。
干酵母中RNA含量(%)=提取的RNA重量（g）干酵母重量（g）×100%2．紫外吸收法测定提取RNA干粉中核酸含量实验原理：核酸分子在260 nm处具有特异性吸收峰试验方法：（1）称取实验1中提取的RNA干粉20 mg，加入少量0.5 mol/L的氢氧化钠水溶液溶解，然后加入去离子水，用50 mL容量瓶定容，（2）以去离子水做空白，测260 nm处的吸光度（A），计算提取的RNA干粉中核酸含量。
核酸检查实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握核酸检查的基本原理和方法。
2. 学会使用核酸提取试剂盒和核酸检测仪器进行核酸提取和定量分析。
3. 了解核酸在生物学研究中的重要作用。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括DNA和RNA。
核酸检查是通过提取样品中的核酸，然后对其进行定量分析，以了解样品中核酸的浓度和种类。
本实验采用核酸提取试剂盒和核酸检测仪器，通过比色法测定样品中核酸的浓度。
三、实验器材与试剂1. 实验器材：- 核酸提取试剂盒- 核酸检测仪器- 旋涡混合器- 离心机- 移液器- 试管- 烧杯- 水浴锅- 酒精灯- 酸碱滴定管- 比色皿- 酶标仪2. 实验试剂：- 样品- 核酸提取试剂盒（含缓冲液、酶、洗涤剂等）- 标准核酸溶液- 检测试剂- 水浴加热剂- 酸碱指示剂四、实验步骤1. 样品处理：取适量样品，加入适量的缓冲液，进行充分搅拌，使样品充分溶解。
2. 核酸提取：将提取好的样品按照试剂盒说明书进行操作，提取核酸。
3. 核酸纯化：将提取的核酸溶液进行离心，弃去上清液，保留沉淀。
4. 核酸定量：将纯化的核酸沉淀溶解于适量的缓冲液中，按照试剂盒说明书进行核酸定量。
5. 比色法测定：将标准核酸溶液和样品核酸溶液按照一定比例混合，加入检测试剂，进行比色反应。
6. 数据分析：使用酶标仪测定吸光度，根据标准曲线计算样品中核酸的浓度。
五、实验结果与分析1. 样品处理：样品处理过程中，样品溶解度较好，无明显的沉淀现象。
2. 核酸提取：核酸提取过程中，提取效率较高，核酸提取量符合实验要求。
3. 核酸纯化：核酸纯化过程中，沉淀物纯净，无杂质。
4. 核酸定量：根据标准曲线，样品中核酸浓度为X ng/μL。
5. 数据分析：通过比较标准核酸溶液和样品核酸溶液的吸光度，得出样品中核酸的浓度为X ng/μL。
六、实验总结1. 本实验成功提取了样品中的核酸，并对其进行了定量分析。
2. 通过比色法测定，得到了样品中核酸的浓度，为后续的生物学研究提供了数据支持。
蛋白质核酸换算
核酸、蛋白质的各种换算分光光度值与核酸浓度的换算1 A260 unit dsDNA=50 μg/ml1 A260 unit ssDNA=33 μg/ml1 A260 unit ssRNA=40 μg/ml蛋白质质量与摩尔数的转换100 pmol的100 kDa蛋白分子=10 μg100 pmol的50 kDa蛋白分子=5 μg100 pmol的10 kDa蛋白分子=1 μg100 pmol的1 kDa蛋白分子=100 ngDNA分子质量与摩尔数1 μg of 1000 bp DNA = 1.52 pmol(3.03 pmol of ends)1 μg of pBR322 DNA = 0.36 pmol DNA1 pmol of 1000 bp DNA = 0.66 μg1 pmol of pBR322 DNA = 2.8 μg蛋白质/DNA之间的转换1 kb的DNA可编码333个氨基酸=37 kDa的蛋白分子270 bp的DNA= 10 kDa的蛋白分子810 bp的DNA= 30 kDa的蛋白分子2.7 kb的DNA= 100 kDa的蛋白分子DNA分子质量与摩尔数的换算公式对于dsDNA 分子将pmol转换为μgpmol×N×(660 pg/pmol)×(1 μg/106pg) = μg将μg转换为pmolμg×(106pg/1μg)× (pmol/660 pg)×(1/N) = pmol其中 N 是核酸碱基对数，660 pg/pmol 是每对碱基的平均分子量(MW)。
一个氨基酸的平均分子量=100 Daltons(道尔顿)Daltons(Da) kilo是原子质量单位的另一名称，千道尔顿Dalton (kD)即为1000 道尔顿。
因此，质量为46 kD的蛋白质是每摩尔分子46000克的分子。
对于ssDNA 分子将pmol转换为μgpmol×N×(330 pg/pmol×(1 μg/106pg) = μg将μg转换为pmolμg×(106pg/1μg)×(pmol/330 pg)×(1/N) = pmol其中 N 是核酸碱基数，330 pg/pmol 是每个碱基的平均分子量(MW。
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下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈现红色荧光。GoldView
不仅能染DNA，也可用于染RNA。
PCR扩增产物的检测
1. 琼脂糖凝胶的制备 ① 根据样品DNA片段大小确定琼脂糖凝胶浓度；
② 胶板的制备：胶槽置于水平支持物上（两侧封口）, 插上样品梳子, 注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保 持1mm左右的间隙；
本实验的预期结果
PCR产物
DL2000
≈500bp
PCR产物电泳照片图
1: DNA Marker DL2,000 2、3: PCR扩增产物（500bp片段）
DL2000 DNA分子量标准
１００bpDNA分子量标准
质粒在正常情况下以cccDNA构型存在，在提取过程中由于机 械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发生断裂。所以， 多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状 DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA）；线形DNA(lDNA)
实验原理
在中性或偏碱性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。
DNA电泳速率与电荷效应无关（随着碱基数的增加，DNA 分子量增加，电荷数也增加，这样荷质比基本维持一个常
数）。
琼脂糖凝胶作为一种固体支持基质,主要利用DNA分子在
电场中的泳动时的分子筛效应来达到分离混合物的目的。
在恒电场的一定电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于
4. 设置波长（260nm）: go to WL
5. 调空白： 按“空白”键，调节不同比色皿透光值误差 6. 自动调零： Auto ZERO，空白样品透光值归零 7. 取出第二、三号比色皿，倒掉ddH2O，加入100ul预先混好 的质粒DNA样品，关上盖，按“Start”，开始测量OD260, 记录结果
由DNA分子的大小与构型。
DNA分子迁移速率与其相对分子量成反比。
电泳方向
700bp
900bp
相同分子量但不同构型的DNA分子迁移速率不同。
质粒DNA的分子构型 (a)松弛线性的DNA（L） (b)松弛开环（OC） (c)超螺旋（cccDNA）
三种构型的质粒的电泳模式图谱
影响电泳速率的因素
1.DNA分子量的大小 2. 琼脂糖凝胶的浓度 3. DNA的分子构象 4. 电压
0.6%
1Kb
1%
0.6Kb
1.4%
0.2Kb
2%
0.15Kb
琼脂糖凝胶浓度
二甲苯青迁移率：与 之相当的DNA大小
1%
2Kb
1.4%
1.6Kb
4、载样缓冲液(Loading Buffer) 注：指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液， 其作用是： 增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加 样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指示带,可预测核酸电泳的速度 和位置 使样品呈色，使加样操作更方便 5、荧光染料(GoldView，GV) GoldView (GV) 是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核 酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在 100ml琼脂糖胶溶液中加入5µl GoldView即可。在紫外透射光
小结与回顾
凝胶电泳的原理 质粒DNA的三种构型 影响电泳速率的因素 琼脂糖凝胶的制备 紫外分光光度法测DNA浓度的原理、步骤 OD260/280的含义
下次实验内容：
5. 电泳缓冲液的离子强度
试
1、琼脂糖
剂
2、TBE缓冲液: 临用时用水稀至0.5×TBE( pH8.0～8.2) 3、核酸电泳的指示剂
溴酚兰：在碱性液体中呈紫蓝色
二甲苯青：在碱性液体中呈蓝色
在电泳中，溴酚兰和二甲苯青的迁移率与下列双链线性DNA片段相当：
琼脂糖凝胶浓度 溴酚兰的迁移率： 与之相当的DNA大小
8.设置波长（280nm）: go to WL 9. 自动调零： Auto ZERO，空白样品透光值归零 10. 按“Start”，开始测量OD280，记录结果。
实 验 报 告 （一）
1、记录PCR扩增产物和质粒样品的电泳图谱，说明带型含义
（对结果和出现的问题进行分析，如若未获得单一的扩增带，
这是什么原因造成的？扩增带颜色深浅说明什么等；将质粒 样品与标准的pUC19质粒比较。） 2、记录质粒DNA的OD260、OD280等原始数据，计算比值和浓度， 并分析结果： OD260/OD280比值高或低各说明什么？
注：注意点样品要放阴极端！
每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染； 注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
加样顺序
3. 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压 最高不超过5V/cm（按两极间距离计算出总电压） 。当 溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 (125V, 30min) 4. 观察和拍照 (1)在透射仪的样品台上铺一张保鲜膜（全班共用一张保 鲜膜），赶去气泡，然后将胶槽内的胶块小心滑出至 样品台上面。 (2) 在300nm波长紫外透射仪下观察电泳胶板。DNA存 在处显示出肉眼可辨的绿色条带。紫光灯下观察时应 戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。 可拍 照记录实验结果。
纯度测定：当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会 影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、 OD280（280nm是蛋白质的吸收峰）和OD230（230nm是酚类等杂质的吸 收峰），计算其比值来衡量样品的纯度。 经验值：
纯DNA：OD260/OD280≈1.8
③ 胶液的制备：称取0.2g琼脂糖,置于100ml锥形瓶中,加入 20ml 0.5×TBE稀释缓冲液,用保鲜膜封口（避免水蒸气 过度散失），然后在上面用枪头扎个小孔（加热过程中 可以放出少量水汽，以免瓶内压力过大）， 放入微波炉 里加热至琼脂糖全部熔化（1-2min, 液体变透明）,取出 摇匀（烫手！）,此为1%琼脂糖凝胶液。待胶冷却到60 度左右，加入DNA染料Goldview 2 ul，混匀； ④ 倒胶：将胶液缓慢倒入胶板内，注意：倒胶时的温度不 可太低,否则凝固不均匀；速度也不可太快,否则容易出现 气泡。 ⑤ 待胶完全凝固后（10min）,拨出梳子,注意不要损伤凝胶, 然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过凝 胶的上表面。
3. 计算OD260/OD280之比,判断其纯度。
4. 计算质粒样品的浓度： DNA浓度(ng / ul )=稀释倍数×OD260×50
岛津UVmini-1240
紫外分光光度计的使用步骤
1. 打开电源，系统开始自检（6min）
2.取3个比色皿，各加入100ulddH2O,并放入样品室（最靠近 我们的比色皿（1号）为对照） 3. 选择“1. 光度模式”
思考题
1. 恒定电场强度下，琼脂糖凝胶电泳只适于分离多大的DNA片
段？（20-50Kb）
2. 若有60kb～100kb大小的系列DNA片段要进行分离鉴定，问 应采取哪种类型的电泳方法才能进行有效分离？为什么？ (脉冲场电泳， 10-2000Kb) 3. 为什么说 DNA分子的迁移率主要取决于分子筛效应（与分子 量大小和构型有关）？ 4. 影响DNA迁移率的主要因素有哪些？
质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图
2、紫外分光光度法检测核酸的浓度、纯度
基本原理
DNA链上碱基的嘌呤环和嘧啶环结构具有吸收紫 外光的性质，其最大吸收峰在260nm处。单链核酸 （RNA）由于其碱基暴露，所以其吸光度较双链高。
浓度测定：在一定范围内，DNA或RNA的光密度OD260与其含量成正比。 当使用1cm比色杯，OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg /ml，RNA浓 度约为40μg/ml；寡核苷酸浓度约为30μg/ml。根据以下公式可 以计算DNA在溶液中的浓度：
实 验 四、 核酸浓度、纯度的检测
Байду номын сангаас
DNA的电泳检测
实 验 目的
原理：
掌握紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度的原理。 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理 掌握紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度的步骤和计算方 法。 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的操作
技术技能
1、DNA分子的琼脂糖凝胶电泳检测
(＞1.9,表明有RNA污染或DNA降解；＜1.6，表明有蛋白质或酚污染） 纯RNA： OD260/OD280≈2.0 (1.8 ~2.2)
实 验 步 骤
1. 取10μ l自提的质粒DNA溶液用ddH2O稀释10倍（终体积： 100 μ l）。 2. 以蒸馏水作参比，对仪器进行调零等调整后，测定质粒样 品的OD260和OD280。
质粒DNA浓度(μg / μl )=稀释倍数×OD260×50/(1000 ×L） 其中：L为比色杯的光程（杯的厚度）；“50”为DNA在OD260=1时的 浓度。 质粒DNA浓度(ng / μl )=稀释倍数×OD260×50
注：OD260 值应在0~1之间，以在0.5左右为好。这样读数比较准确。
2.
加样：将下列样品在洁净的保鲜膜或一次性手套表面混匀， 用微量移液枪小心加入凝胶的样品孔中。
①
② ③ ④ ⑤
8μl PCR产物 + 2μl 6×载样液
8μl 质粒提取物 + 2μl 6×载样液 8μl pUC19 质粒 + 2μl 6×载样液(阳性对照)
5 μl DL2000 Ladder Marker (DNA marker) 5 μl λEcoR T14 Marker (阳性对照)