4基因工程-载体
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基因工程载体
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基因诊断
利用基因工程载体携带特定的检测基因或标记物， 对疾病相关基因进行快速、灵敏的检测和诊断。
应用领域与前景
农业生产
通过基因工程载体将优良性状基因导入农作物或家畜家禽的 基因组中，改良品种性状，提高产量和品质。
前景
随着科学技术的不断进步和创新，基因工程载体的研究和应 用将更加深入和广泛。未来，基因工程载体有望在个性化医 疗、精准农业、生物安全等领域发挥更大的作用，为人类健 康和生活质量的提高做出更大的贡献。
人工染色体载体
概念
人工染色体载体是一种基于天然染色体结构设计的基因工程载体，可模拟天然染色体的功 能和特性。
优点
人工染色体载体具有较大的容量，可容纳多个外源基因和调控元件。此外，人工染色体载 体还具有稳定的遗传特性和较低的免疫原性，可实现外源基因的长期稳定表达和遗传。
缺点
人工染色体载体的构建和操作相对复杂，技术难度较大，且成本较高。目前主要应用于基 础研究和临床试验阶段。
潜在生态风险分析
基因污染
基因工程载体可能通过水平基因转移等方式，将外源基因 导入非目标生物体内，造成基因污染。
生态平衡破坏
外源基因的导入可能对目标生物及其相关生物种群的生态 平衡产生不良影响，如改变种间竞争关系、影响食物链等。
生物多样性减少
基因工程载体的广泛应用可能导致生物多样性减少，特别 是对一些濒危物种和生态系统的影响更为显著。
人类健康影响评估
食品安全问题
基因工程载体在食品生产中的应用，如转基因作物，可能对人体健 康产生潜在风险，如引发过敏反应、产生毒素等。
医药安全问题
基因治疗等医疗手段的应用，可能存在潜在的安全隐患，如基因编 辑的脱靶效应、基因治疗的副作用等。
基因工程载体
二、噬菌体载体 （一）、λ噬菌体载体
1、λ噬菌体载体的特征
λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长48502bp， 两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端），称 为cos位点。λ 噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其 裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中 插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ 噬菌体 可作为基因载体的依据 。
第一节
微生物基因工程载体
克隆载体（cloning vecto载体（expression vector）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子， 更要有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细 胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
四、酵母菌载体
多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为 2μ 质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主 复制功能区域（ARS片段）。 根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、 附加型和稳定型等类型。
共同的特点：
①含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵 母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
重组体的筛选
. .. . . . . .
涂布有Tet的培养基
.. .. . .
涂布有Amp的培养基
3、pUC系列质粒载体
（1）特点 具有更小的分子 量（2686bp）和 更高的拷贝数。 具有多克隆位点
可用组化方法鉴别：
含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因 （LacZ′），它编码β -半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸 ， 可以和β -半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补， 即α —互补 ，恢复分解乳糖的能力。 X-gal也是β -半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴 氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β -半乳糖苷酶时， X-gal不被分解，菌落呈白色。 当外源基因插入到pUC质 粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能 再和缺陷型受体菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶，因此， 菌落呈白色。 反之，非重组体为蓝色菌落。 可通过插入失活法进行筛选
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
基因工程载体名词解释
基因工程载体是指能将分离或合成的基因导入细胞DNA分子，并在其中得以维持的DNA分子。
这些载体通常具有特定的结构和功能，以便能够将基因导入细胞并保持其稳定性和表达。
基因工程载体的类型包括质粒DNA、病毒DNA和科斯质粒等。
其中，质粒是一种小型环状DNA分子，可以自我复制，并能够在细菌细胞中稳定存在。
病毒DNA则是一种感染细胞的病毒，其基因组可以插入外源基因并携带其进入细胞。
科斯质粒则是一种人工合成的质粒，具有特定的结构和功能，以便能够将基因导入细胞并维持其稳定性和表达。
在基因工程操作中，载体被用来将外源基因导入受体细胞，并在其中表达。
通过使用载体，研究人员可以更容易地操作和调控基因的表达，从而更好地了解基因的功能和作用机制，为疾病治疗、药物研发等提供重要的支持。
第四章 基因工程的质粒载体
（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物 使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构 转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能 够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复， 所以就出现这两种构型之间的平衡状态。
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
基因工程中常用载体及其主要特点
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
基因工程第五章-载体
cccDNA在较高高的温度和PH值条件下才会变性，（较线 性和开放环结构的DNA），如果变性，由于团在一起，条 件恢复后，会很快复性，形成cccDNA，线性和环状的变 性后，复性会形成杂乱的大分子团状结构，从而从体系中 沉淀下来。
3. 质粒DNA的分子量和拷贝数：
按质粒的分子量大小，可分为量大类： 3――7kb，拷贝数多； 70－150kb，含有与质粒功能有关的更多基因，可自我传 递（可编码一套控制质粒DNA转移的基因，所以可从一 个细胞转到另一个细胞），如果一个细胞含有这种质粒， 他可以带动小质粒进行传递转移。这种质粒的拷贝数低。
质粒的拷贝数：分子的多与寡是决定产量的重要因素。
pBR322 拷贝数大于25个 ColE1 15个 产量0.23ug/ml 0.11 ug/ml
基因克隆尽量选择松弛型质粒，如果是严紧型要进行质粒 复制子改造。
质粒的大小：通常质粒越大，拷贝数也越少，所以我们 在进行基因重组时，首先要选择分子量小的质粒，其次 质粒分子量大的要使外源基因的片断长度合适，不要过 大。
பைடு நூலகம் 2、pUC质粒载体：
pUC质粒载体：是由美国加利福尼亚大学的专家构建 的。是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个带 有多克隆位点的LacZ’基因，而发展成为具有双功能 检测特性的质粒载体。
最常用的克隆载体，优点： 具有更小的相对分子量和更高的拷贝数。 在构建pUC质粒载体时仅留下pBR322的复制起始起 始位点和AMP抗性基因，分子大大减小，他的拷贝数 可以达到500－700个/个细胞。 适合组织化学法检测重组子。有利于检测 具有多克隆位点，便于片断的插入。
沉淀出来。
第一步：（1）在5m1含相应抗生素的LB培养基中接种 一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。（2）将1.5m1 培养物倒入Eppendorf管中，用微量离心机于4℃以 12000rpm离心30秒。 （3）吸去培养液，使细菌沉淀 尽可能干燥。（4）将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的 溶液I中（溶液Ⅰ：50mmol／L 葡萄糖， 25mmol／L Tris· (pH 8．0)， 10mmol／L CI EDTA(pH 8．0，溶菌酶4－5mg，酶作用环境由缓冲 液提供)。剧烈振荡。须使细菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分 散，将两个微量离心管的管底部互相接触，室温静止5 －30min，细胞壁降解。
第三章基因工程载体
3个会导致Ampr基因失活
9个导致Tetr基因失活
氨苄青霉素和四环素抗性 24个单一克隆位点。
pBR322的优点
① 双抗生素抗性选择标记
抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重 组体质粒的有效方法，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。 获得重组载体的寄主细胞 在Aplasmid ）:在整个细胞
周期中随时可以复制，每个细胞中有许多拷贝, 一般10-60 拷贝，如Col E1质粒。
氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体
复制的氯霉素存在时，松弛型质粒可继续扩增， 其拷贝数可达2000-3000个，称氯霉素扩增效应
严紧型复制质粒 （stringent plasmid ）：
plasmid 接合型质粒（自我转移的 质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。
Non
Conjugative plasmid 非接合型质粒
（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配 对和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发 的转移到另一个细胞。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、 严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
① colicin E1基因的结构 cea imm 免疫基因 kil 溶菌基因
结构基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物 ③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
克隆位点
EcoR I
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1 失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但 仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。
外源DNA
Colicin E1
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程是一种用于改变和改造生物体遗传基因的技术，它是利用分子生物学技术提高生物性状的一种新技术。
在基因工程中，需要使用一种材料将外源基因投入细胞中，这种材料就是载体。
基因工程中常用的载体有以下三种：
1. 质粒载体. 质粒载体是一种比较常见的基因工程载体，具有较强的稳定性，它是一种质粒DNA，也称为质粒DNA，不是单链DNA，它是由细菌质粒的DNA结合其它分子，形成质粒DNA的结构，具有可复制性能，可以在细菌或动物细胞中复制，具有较强的稳定性。
2. 杆状病毒载体. 杆状病毒载体是一种比较常见的基因工程载体，它由病毒的全基因组和其它分子形成，用来转移外源基因到细胞中，可以把外源基因转移到细胞核或任何其它的地方，可以实现基因工程的目的。
3. 化合物载体. 化合物载体是一种新型的载体，它是由多种不同的分子组成的，可以将外源基因转移到细胞核或其它位置，并且可以把这些基因在细胞中表达出来，从而实现基因工程的目的。
第4章 基因工程载体
的转化细胞，细胞内含有的DNA分子一定不是重组子。一种
理想的质粒克隆载体应该具有两种选择标记基因，并且在选 择标记基因内有合适的克隆位点。常用的选择标记基因主要 是抗生素的抗性基因[如四环素抗性（Tetr或Tcr）、氨苄青霉 素抗性（Ampr或Apr）、卡那霉素抗性（Kanr或Kmr）、氯 霉素抗性（Cmlr或Cmr）、链霉素抗性（Strr或Smr）等]和β半乳糖甘酶基因。
（5）基因工程所应用的质粒通常为非传递性的松弛型质粒，
安全可控，不至于对操作者和环境带来不必要的危害。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
三、常用的质粒载体
1. pBR322质粒载体 1977年，F. Bolivar和R. L. Rodriguez 构建了一个典型的用
于基因克隆的通用质粒载体—pBR322质粒载体。目前使用
白质分子，内部的核酸一般是双链线性DNA分子，也有的是
双链环形DNA、单链线性DNA、单链环形DNA以及单链 RNA等多种形式。不同种噬菌体之间，其核酸的分子量相差 可达上百倍。而且有些噬菌体的DNA碱基并不是标准的A、T、 C、G四种碱基组成。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
溶源性噬菌体的生命周期（引自吴乃虎，1998）
导致Ampr基因的失活。这种因DNA插入而导致基因失活的现
象，称之为插入失活效应。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
大肠杆菌pBR322质粒载体的结构图
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
pUC质粒载体
1987年，美国加利福尼亚大学（University of California）的 科学家J. Messing 和J. Viria在pBR322质粒框架基础上构建
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
基因工程载体
第三章基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒（cosmid）载体基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。
（2）有选择性标记。
（3）有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA（cccDNA）②开环DNA（open circular,ocDNA）③线形DNA（linear,lDNA）（二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
Col质粒：细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
基因工程(基因工程的基本条件-载体系统)
(二)质粒载体(Plasmid)
1. 质粒的一般生物学特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而 自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；
质粒常见于原核细菌和真菌中； 绝大多数的质粒是DNA型的； 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分
子结构，即cccDNA； 质粒DNA的分子量范围：1-300 kb。
D-DNA ocDNA cccDNA
但变性的线性染色体DNA分子复性时不准确，也不迅 速，因此彼此聚集形成网状结构,通过离心分离便与变 性的蛋白质及RNA一起沉淀下来，而仍滞留在上清液中 的质粒DNA则可用酒精等沉淀收集。
沸水浴法 用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 沸水浴40秒钟； 离心，用无菌牙签挑去沉淀物； 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA；
λ噬菌体生物学特性：溶原状态
➢λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也 可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上， 并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态； ➢整合主要由λ-DNA上的cI和int两基因的产物所激 活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞 本身的性质； ➢人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质， 使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态；
4363 bp
ROI
➢用于基因克隆
ROP Origin of Replication Hind II
Sal I Bal I
pUC18/19：
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
➢分子量2686bp； GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
基因工程的载体和受体情况讲解
但这种对应关系不是绝对的，若细胞生长环境中存在蛋白质合成抑制剂（氯霉 素、壮观霉素等）时，细胞的染色体DNA的复制受阻，而质粒仍可扩增，使其 数量可达数千拷贝。
（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质
（3）质粒的可转移性
据此，革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： ✓接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F质粒。 ✓非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R质粒的一些成员。
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质 粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。
R因子（resistance factor）
✓最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现 还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和 Staphylococcus中。
✓R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子 （resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（rdeterminant）。RTF为分子量约为11×106 Dalton，控制质粒拷 贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106 Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。
基因工程的载体和受 体情况讲解
一、用于基因克隆的载体
1.载体的概念
（1）携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 （2）能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞， 具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩 增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 （3）实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞。
（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质
（3）质粒的可转移性
据此，革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： ✓接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F质粒。 ✓非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R质粒的一些成员。
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质 粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。
R因子（resistance factor）
✓最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现 还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和 Staphylococcus中。
✓R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子 （resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（rdeterminant）。RTF为分子量约为11×106 Dalton，控制质粒拷 贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106 Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。
基因工程的载体和受 体情况讲解
一、用于基因克隆的载体
1.载体的概念
（1）携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 （2）能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞， 具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩 增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 （3）实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞。
Ch04基因工程的常用载体-噬菌体和病毒载体
4. M13载体的构建 （1）选定克隆区域 1）M13基因间隔区（intergenic region, IG区） 514 nt (5501-6014)
4
M13 6.4 Kb
2）酶切位点 IG区内有两个 BsuI(HaeIII)（GG↓CC）位点 其余8个BsuI位点分布在其它部位
基因4
M13 IG区序列
第四章 基因工程载体
邢万金 内蒙古大学生命科学学院生物学系
第二节 噬菌体载体
一、单链噬菌体载体
单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13、f1、fd 等噬菌体 pIII(5) pVIII(2700) pVII
pVI(5) +DNA
M13丝状噬菌体
pIX(5)
1. M13单链噬菌体DNA的基因组织
（3）常用的 pBluescript 载体 pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-） SK：表示lacZ′ 的转录方向是沿MCS上的 SacI → KpnI KS：反向（ KpnI → SacI ，MCS相反） +（f1+）：单链复制起始方向背离 lacZ′， 能回收lacZ′ 的编码链（+） -（f1-）：能回收lacZ′ 的非编码链（-）
5. 对M13mp1载体的改进 M3mp2：在LacZα中引入单一酶切位点EcoRI M3mp1的LacZα的第6氨基酸有个EcoRI星号位点： ATGACCATGATTACGGATCCA TACTGGTACTAATGCCTAAGT O
O N N CH3 NH2
CH3 Eco RI* H2 N-Met Thr Met Ile Thr Asn Ser------N-甲基-N-亚硝基脲 l M13mp 2 ATGACCATGATTACGAATTCA 5 ′ ATGACCATGATTACGAATTCA5′ATGACCATGATTACGGATTCA----7250 bp GT TACTGGTACTAATGCTTAA 3 ′ TACTGGTACTAAhr Asp Ser------4
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4．质粒是基因工程的常用载体，下列关于它的说法正确的是( D )
A．具有环状结构的染色体，能够携带目的基因 DNA B．含蛋白质，从而能完成生命活动 C．是 RNA，能够指导蛋白质的合成 D．能够自我复制，从而保持连续性
—CTTAAG—
—G —CTTAA
EcoR I切点
AATTC— G—
碱基互补配对
(2)DNA 连接酶是基因操作的“分子缝合针”，其作用是把基于________
能力而黏合在一起但存在的切口封闭，进而才可能形成有意义的__重__组__D_N_A。 (某些)病毒
(3)逆转录酶也常被用于基因工程，其存在于________(生物)中，催化以
___m_R_N_A__为模板合成 DNA 的过程。
某些生化表型基因
在质粒作为载体时其上必须有至少一个标记基因存在。 即：限制酶切割位点不能破坏全部标记基因
a,b,c为酶切位点， a,c为限制酶Ⅰ切割位点；b为限制酶Ⅱ切割位点， （限制酶Ⅰ能切开限制酶Ⅱ的序列，限制酶Ⅱ不能切
开限制酶Ⅰ的序列） 选限制酶Ⅱ
则应选那种限制酶？ 含有该质粒的细胞将来在什么培养基上能存活？ 在什么培养基不能存活？
B．①④⑥
C．①③⑥⑦
D．②③⑥⑦
类型二 质粒结构和功能 例 2►目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基 础重新组建的人工质粒，pBR322 质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下 图所示。
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_筛___选__(_鉴__别___)目___的__基___因__是_______ _____________________________________否__导___入__受__体___细__胞__________。
3．下表所示为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，
A 正确的是( )
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ
↓ GGATCC
KpnⅠ
↓ GGTACC
EcoRⅠ HindⅡ
↓ AATTC
↓ GTYRAC
Sau3AⅠ SmaⅠ
↓ GATC
↓ CCCGGG
—GAATTC— —CTTAAG—
（2）
—G —CTTAA
目的基因
AATTC—……—G G—……—CTTAA
AATTC— G—
(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无 ampR 和 tetR 的大肠杆菌，将大肠 杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到 培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得 到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二
(3)pBR322 分子中另有单个的 BamH Ⅰ限制酶作用位点，现将经 BamHⅠ处
理后的质粒与用另一种限制酶 BglⅡ处理得到的目的基因，通过 DNA 连接酶作
用恢复磷___酸__二__酯_键，成功获得了重组质粒，说明__________________________。 两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏 性末端相同（或互补）
习题处理：
1．以下有关基因工程的叙述，正确的是( D )
A．基因工程是细胞水平上的生物工程 分子 B．基因工程的产物对人类都是有益的 C．基因工程产生的变异属于人工诱变 基因重组 D．基因工程育种的优点之一是目的性强 定向
2．下列关于限制酶的说法，不正确的是( A )
A．限制酶广泛存在于各种生物中，微生物中很少分布 微生物 B．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 C．不同的限制酶切割 DNA 的位点不同 D．限制酶的作用是用来提取目的基因
作业：
1.整理课堂笔记。 2.作业本纠错整理讲过题。 （抄题） 3.将图片题做作业本。 （不抄题，只写答案和解析）
(2)pBR322 分子中有单个 EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列 —GAATTC—，并只能在 G 和 A 之间切割。若在某目的基因的两侧各有 1 个 EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶 EcoR Ⅰ切割后所形成的黏性末 端____如__下__所__示_：________________________________________________。
中的菌落表现型是__能__抗__氨___苄__青___霉__素__，___但__不___能__抗__四___环__素_，图三结果显示， 多数大肠杆菌导入的是______p_B__R_3__2_2_质___粒_________________________。
抗氨苄青霉素，在氨苄青霉 素培养基能活
不抗四环素，死了
1. 种类：质粒、 λ噬菌体 的衍生物、动植物病毒等。
2. 常用载体一质粒
（1） 本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细
菌 拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链
环状DNA分子。
（2）作用
① 作为运输工具，将目的基因导入受体细胞 。 ② 质粒携带 目的基因在受体细胞内大量复制。
（3） 质粒作为载体所具备的条件及原因
条件
原因
稳定并能 自我复制或 能使目的基因稳定存在 且 整合到染色体DNA上 数量可扩增
有一个至多个限制酶切割
位点
可携带多个或多种外源基因
作用 便于重组DNA的
具有特殊的 标记基因
鉴定和选择
无毒害作用
对受体细胞无毒害作用， 避免受体细胞受到损伤
抗四环素抗性基因
标记基因
抗性基因 抗氨苄青霉素抗性基因
在含氨苄青霉素的培养基能存活
在含四环素的培养基不能存活
常用作载体的质粒通常不是天然 质粒而是人工改造的质粒。
课堂练习：
例21．. 质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是( C )
①能自主复制 ②不能自主复制 ③结构很小 ④蛋白质 ⑤环状 RNA
⑥环状 DNA ⑦能“友好”地“借居”
A．①③⑤⑦
进入课堂后，先观看视频可以 在QQ看，也可以看直播。
导课
1.1.3基因进入受体细胞的载体
[学习目标] 了解载体。
[核心素养] 科学思维：模拟重组DNA分子操作工 具的使用方法，说出它们在基因工程中的作用。
[教学重点] 1.质粒的相关知识。 2.基因工程中载体要具备的条件。
[教学难点] 1.载体的特点和作用。 2.识记标记基因的作用。