黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因的克隆和序列测定

黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因的克隆和序列测定

王字玲　邓健蓓　韩　骅　陈梅红　苏成芝

(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室　西安710033)

摘　要　目的:克隆黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因.方法:从培养的可分泌人黑色素瘤特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞HB8760提取总RNA,反转录成c DNA,用合成的一对寡核苷酸引物从中扩增了抗体可变区基因,并克隆入pU C19,挑选出阳性克隆后进行了核苷酸序列分析.结果:所克隆基因分别长360bp和330bp,编码120个和110个氨基酸,含三个CDR区和四个FR区,并含有维持抗体结构所必需的两个半胱氨酸.计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性.结论:所克隆基因可编码小鼠抗体可变区.

关键词　黑色素瘤　单克隆抗体　基因　克隆　核苷酸序列

中图号　Q78

Am p lificati on,clon ing and sequencing of the variab le regi on genes of a hum an m elanom a sp ecific m onoclonal an tibody

W ang Z iling,D eng J ianbei,H an H ua,Chen M eihong,S u Cheng z h i

D ep artm en t of B i ochem istry and M o lecu lar B i o logy,Fou rth M ilitary M edical U n iversity, X i’an710033

Abstract　Objective:C lon ing of the variab le regi on genes of a hum an m elanom a specific monoclonal an ti-body.M ethods:To tal RNA w as iso lated from a cu ltu red hyb ridom a cell line HB8760w h ich secretes hum an m elanom a specific monoclonal an tibody,and fo llow ed by reverse tran scri p ti on in to c DNA.T hen PCR w as u sed to amp lify the i m m unoglobu lin variab le regi on genes of the an tibody.T he PCR p roduct w as cloned in to pU C19p las m id and sequenced.Results:T he cloned genes con sist of360bp and330bp respectively and en2 code120and110am ino acids.T here are th ree CDR s,fou r FR s and the charicteristic cystein residues w ith in the genes.T he genes are homo logues to the mou se Ig genes pub lished in E M BL gene bank1995.Conclu2 sion s:T he data indicate that the cloned genes encode the variab le regi on of the mou se an tibody.

Keywords　m elanom a　an tibody　gene　nucleo tide sequence

单克隆抗体技术是生物技术发展的一个里程碑.单克隆抗体在生物学基础研究和疾病的诊断、治疗和预防等方面显示出重要的作用和应用前景. L evy等[1]建立了一株人黑色素瘤特异性单克隆抗体XMMM E2001(商品名HB8760).该抗体可特异结合携有黑色素瘤相关抗原的肿瘤细胞,而不与对照的成淋巴细胞系或缺乏黑色素瘤相关抗原的瘤细胞结合[1],这对黑色素瘤的诊断及治疗有重要意义.但由于该抗体为鼠源性,在临床应用中存在诸多问题,而基因工程抗体则有免疫原性低,不被细胞受体结合,在体内成象定位检查时本底低,图象清晰,能进入实体瘤周围微循环,在治疗实体

王字玲,女,29岁,博士生瘤时比完整抗体分子效能高等优点[2],我们从HB8760中克隆了这一抗体的轻、重链可变区基因,并测定了其核苷酸序列,为其进一步应用打下基础.

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　细胞系　小鼠杂交瘤细胞系HB8760为本校免疫学教研室保存并培养,该细胞可分泌抗人黑色素瘤特异性小鼠IgG2a.

1.1.2　克隆载体及菌种　为本室保存.所用试剂除特殊提到外均为德国Boeh ringer M annhei m公司和华美公司产品.

1.2　方法

1.2.1　RNA的提取　按文献[5]进行.将从107细胞所提取的胞浆总RNA溶解于50Λl水中,紫外定量.

1.2.2　反转录　取10Λg胞浆总RNA在20Λl 体积中用美国P rom ega公司反转录试剂盒进行.反应液于-20℃保存.

1.2.3　PCR　反应及其产物克隆根据已发表的抗体可变区序列的保守性,合成了针对重链和轻链可变区的通用引物[9],PCR引物如下:

V h21(正向)GT GAA T TCA T GCA GGT GCA2 GCT GT T GGA GTCT GG,V h22(反向)A T G2 TCGA CT GA GGA GA CGGT GA CCA GGGT GCC, VL21(正向)GT GAA T TCA T GGA CA T T G2 T GA T GA CCCA GTCTCC,VL22(反向)CA2 GTCGA CT TA CGT T T GA TCTCCA GCT T GGT2 CCC.

在M J R ESEA RCH公司的PCR反应仪上进行.取10Λl PCR产物经EcoR I和SalI消化,低熔点琼脂糖凝胶回收扩增的片段,克隆入pU C19中,酶切选出含插段的克隆.

1.2.4　核苷酸序列分析　双脱氧链终止法,用美国Pharm acia公司的T7Sequencing k it进行.

2　结果

2.1　HB8760可变区基因的扩增　用通用引物扩增HB8760的c DNA分别得到一条约360bp和330bp的片段(F ig1).

图1　HB8760可变区基因的扩增

F ig1　Amp lificati on of variab le regi on genes of HB8760 V H:H eavy chain variable regi on gene;VL:L igh t chain variable regi on gene;M:M o lecular w eigh t m arker.

2.2　扩增片段的克隆　PCR产物经酶切后克隆入pU C19中,并转化JM109,得到约100个白色克隆,随机挑选8个,经酶切鉴定均含插段.

2.3　核苷酸序列测定　挑选一个含插段的阳性克隆大量提取质粒,经FPL C纯化后测序,核苷酸序列结果见F ig2.其特点为:①序列两端含PCR引物及正确的酶切位点.重、轻链分别为360bp和330bp,与PCR结果相同.②重、轻链基因分别编码120个和110个氨基酸,含三个CDR区和四个FR区,并含有维持抗体结构所必需的两个半胱氨酸.③序列经计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性.

V H:

A T G CA G GT G CA G CT G T T G GA G TCT GGG GCA GA G CT T GT G AA G CCA GGG

GCC TCA GTC AA G T T G TCC T GC A CA GCT TCT GGC T TC AA C A T T AAA GA C

A CC TA T A T G CA C T GG GT G AA G CA G A GG CCT GAA CA G GGC CT G GA G T GG

A T T GGA A GG A T T GA T CCT GCG AA T GGT AA T A CT AAA TA T GA C CCG AA G

T TC CA G GGC AA G GCC A CT A TA A CA GCA GA C A CA TCC TCC AA C A CA GCC

TA C CT G CA G CTC A GC A GC CT G A CA TCT GA G GA C A CT GCC GTC TA T TA C

T GT GCT A GA TA C TA T A GG TA C CCT TA C TA T GCT A T G GA C TA C T GG GGC

CAA GGC A CC A CG GTC A CC GTC TCC TCA GTC GA C

VL:

A T G GA C A T T GT G A T G A CC CA G TCT CCA GCC A TC CT G TCT GT G A CT CCA

GGA GAA A CG GTC A GT CT T TCC T GT A GG GCC A GC CA G A CT A T T TA C AA G

AA C CTA CA C T GG TA T CAA CA G AAA TCA CA T CGG TCT CCA A GG CT T CTC

A TC AA G TA T GGT TCT GA T TCC A TC TCT GGG A TC CCC TCC A GG T TC A CT

GGC A GT GGA TCA GGG A CA GA T TA C A CT CTC AA T A TC AA C A GT T T G AA G

CCC GAA GA T GAA GGA A TA TA T TA C T GT CT T CAA GGT TA C A GT A CA CCT

T GG A CG T TC GGT GGA GGG A CC AA G CT G GA G A TC AAA CGT TA G

图2　HB8760轻、重链可变区基因的核苷酸序列

F ig2　N ucleo tide sequence of V H and VL gene of HB8760