苯酚

苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。

再以比色法测定。

1．浓硫酸：分析纯，95.5%
2．80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3．6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。

（每次测定均需现配）
4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。

5．15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

6．5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

7．6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

8．6mol/L 盐酸
1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml 水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2．样品含量测定：
①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。

最后一次将残渣一起到入离心管。

注意：总的溶液不要超出10毫升。

（既不要超出离心管的容量）。

②离心，转速3000转/分钟，共三次。

第一次15分钟，取上清液。

后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。

最后滤液保持18毫升左右。

（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。

因为其脂肪含量大容易夹带残渣。

）
③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。

④定容取样。

水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。

定容至25毫升的容量瓶中。

吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。

每次测定取双样对照。

以标准曲线计算多糖含量。

DEAE-纤维素柱：
英文名称：DEAE cellulose DE-23
CAS号：9000-11-7
功能团：二乙氨乙基
正常PH范围：2～9.5
小离子电量：0.88～1.08meg/dg(dg=dry gram，千克重)
蛋白容积：425mg/dg（蛋白体积是指0.01M ph8.5磷酸缓冲液—牛血清白蛋白）
蛋白容积/柱体积：60mg/ml
每升所需的离子交换剂㎏柱床体积：0.19（离子交换剂重量的数字考虑到溶胀，容易去除及使用过程中离子离子交换剩余颗粒）
填料密度：0.15dg/ml（填料密度的状态为0.05M PH7.5磷酸缓冲液）
性状：干燥纤维状
用途：用于柱色谱分析，用以分离提纯多糖、肽、核苷酸、酶、血清组分和病毒等，阴离子交换填料
保存：RT
2.1.2 DEAE-纤维素吸附葬芦多糖能力的测定
通过重复上样的方法，测定DEAE-纤维素对葵芦多糖的吸附能力。

具体操作如下:
(1)样品:100 mg/ml的黎芦多糖水溶液;
(2)层析柱:DEAE-纤维素柱(1.0X12.8 cm);
(3)上样方法:每次上样1 ml，重复多次上样;
(4)洗脱溶液:40 ml的H20;
(5)洗脱流速:1 ml/min;
(6)收集方法:每试管收集4 ml;
(7)结果处理:用间经基联苯法测定洗脱液中糖醛酸含量;当洗脱液中出现糖醛酸时，说明超出了DEAE-纤维素对葵芦多糖的吸附能力。

根据上样量和洗脱液有无糖醛酸可以计算出DEAE-纤维素吸附葵芦多糖的能力。

2.1.3藜芦多糖的线性梯度洗脱
根据多糖的线性洗脱可以选定适合多糖的离子交换浓度。

具体方法如下:取20 mg的黎芦多糖溶于1 ml水中，10000 rpm离心3min，上清用DEAE-纤维素柱(1.0X12.8 cm)分析;首先用40 ml的H20洗脱，再用320 ml0~1.0 M NaCI溶液进行线性梯度洗脱;洗脱流速为1 ml/min，每试管收集4 ml;分别用苯酚一硫酸法、间经基联苯法检测洗脱液中总糖和糖醛酸分布。

2.1.4藜芦多糖的分步梯度洗脱
根据藜芦多糖在DEAE-纤维素柱上线性洗脱结果，选择葵芦多糖分步梯度洗脱浓度对黎芦多糖进行分步洗脱，检测选定的分步梯度浓度是合理的。

取20 mg的黎芦多糖样品溶于1 ml的水中，10000 rpm ( 3~)离心，用DEAE-纤维素柱((1.0X12.8 cm)对上清进行分步梯度洗脱;依次用40 ml的0, 0.08, 0.14,0.20. 0.27 M的NaCI溶液进行洗脱;洗脱流速为1 ml/min，每试管收集4 ml;分别用苯酚一硫酸法检、间羟基联苯法检测总糖和糖醛酸分布。

2.1.4黎芦多糖的分步梯度洗脱
根据葵芦多糖在DEAE-纤维素柱上线性洗脱结果，选择葵芦多糖分步梯度洗脱浓度对黎芦多糖进行分步洗脱，检测选定的分步梯度浓度是合理的。

取20 mg的黎芦多糖样品溶于1 ml的水中，10000 rpm ( 3~)离心，用DEAE纤维素柱((1.0X12.8 cm)对上清进行分步梯度洗脱;依次用40 ml的0, 0.08, 0.14,0.20. 0.27 M的NaCI溶液进行洗脱;洗脱流速为1 ml/min，每试管收集4 ml;分别用苯酚一硫酸法检、间羟基联苯法检测总糖和糖醛酸分布。

2.1.5藜芦多糖的离子交换柱层析制备
(一)VP的离子交换层析分离制备
用离子交换层析柱将VP分离为不带电荷的中性糖和带负电荷的酸性糖组分。

将30 g的VP溶解于600 ml蒸馏水中，用1L的DEAE-纤维素柱(8.0X20 cm)对其进行分离。

依次用H20 ( 2 L)和0.5 M NaCI溶液((2 L)洗脱;洗脱流速为12.5ml/min，每试管收集150 ml;分别用苯酚一硫酸法、间羟基联苯法检测洗脱液中的总糖和糖醛酸分布。

以洗脱体积为横坐标，以A490和A525为纵坐标绘制洗脱曲线。

分别收集不同的洗脱峰，蒸馏水透析后冷冻干燥，获得水洗脱组分VPN和0.5 M NaCI 溶液洗脱组分VPA。

(二)VPA的分步分离梯度洗脱制备
根据VPA中电荷的均一性，用离子交换层析柱对其进行分级，具体操作如下: 将4.3 g的VPA溶于100 ml蒸馏水中，用500 ml的DEAD纤维素柱((5.5X25 cm)对其进行分步洗脱;用NaCI溶液(0, 0.08, 0.14, 0.20和0.27 M)进行洗脱;洗脱流速为6 ml/min，每试管收集80 ml;分别用苯酚一硫酸法、间羟基联苯法检测洗脱液中的总糖和糖醛酸分布。

以洗脱体积为横坐标，以A430和A525为纵坐标绘制洗脱曲线。

分别收集不同的洗脱峰，透析除
盐后冷冻千燥，制得相应的洗脱级分:VPA 1、VPA-2. VPA-3和VPA-4 。