工业催化作业 卤醇脱卤酶的研究综述1

多功能生物催化剂
――卤醇脱卤酶的研究综述
摘要:
光学纯的环氧化物及β-取代醇是一类高价值中间体,在手性药物及精细化工合成领域具有十分重要的应用前景。

卤醇脱卤酶是一类通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物的脱卤酶,可以高效高选择地催化环氧化物和邻卤醇之间的转化,因而可以用来合成具有光学纯的环氧化物及β-取代醇等化合物。

本文着重介绍了卤醇脱卤酶的催化机理及其应用研究进展,并对研究的发展方向提出了一些设想。

关键词:
卤醇脱卤酶; 生物催化; 亲核试剂; 光学纯环氧化物与β-取代醇
1 .卤醇脱卤酶研究概述及发展现状
有机卤化合物已成为当今重要环境污染物之一,主要是由于工业排废以及人工合成卤化物在化工合成以及农业上的广泛应用造成的。

在自然界中,大部分异生质卤化物自降解能力很差,同时许多化合物被疑是致癌或高诱变物质。

因此,应用微生物降解有机卤化物已引起人们广泛的关注。

从1968年Castro等[1]首次发现以2,3-二溴丙醇作为唯一碳源而生存的黄杆菌(Flavobateriumsp。

) 菌株至今,人们相继筛选到多种可以降解邻卤醇的微生物[2-8]。

其中包括从淡水沉淀物中分离的放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)菌株AD1和节杆菌(Arthrobactersp?)菌株AD2以及从土壤中获得的棒状杆菌(Corynebacteriumsp。

) 菌株N-1074等。

它们降解有机卤化物的途径虽然存在明显差异,但是卤醇脱卤酶作为关键酶之一, 催化碳卤键的断裂存在于所有的代谢途径中。

卤醇脱卤酶也叫卤醇-卤化氢裂解酶,通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢,是微生物降解此类化合物的关键酶之一。

大部分已知的卤醇脱卤酶都已经被克隆并在大肠杆菌中进行重组表达,并根据其序列同源性分为HheA、HheB、HheC3类。

相关的研究表明,卤醇脱卤酶与依赖NAD(P)H的短链脱氢酶/还原酶家族(SDR)具有一定的序列相似性,同时蛋白质三级结构的研究进一步揭示卤醇脱卤酶与SDR 家族成员有一定的进化相关性[9]。

SDR是一类依赖于NAD(H)或NADP(H)并在功能上具有多样性的一组酶类,主要催化醇、糖类、类固醇和一些异生质的氧化还原反应[10-11]。

由于辅酶结合位点在卤醇脱卤酶中被卤离子结合位点取代,因而卤醇脱卤酶是一类不需要辅酶参与的脱卤酶。

同SDR家族一样,在卤醇脱卤酶中严格保守的丝氨酸、酪氨酸和精氨酸在催化过程
中起着关键作用。

其催化机制(图1)为:保守的丝氨酸通过与底物羟基氧原子之间形成氢键,稳定了底物的结合;精氨酸可用以降低酪氨酸的pKa值;酪氨酸从底物的羟基中夺取一个质子,然后以底物上的氧原子作为亲核试剂,进攻邻位卤素取代的碳原子,进而释放卤离子,形成环氧化物[9,12]。

卤醇脱卤酶备受关注的另一个原因是其在生物催化领域的应用,可以用来合成具有光学纯的高价值中间体。

这些化合物在手性药物、手性农药以及各类手性合成的合成领域中具有传统化学合成法所无法比拟的优越性。

其中光学纯的环氧化物以及用来合成该类化合物的前体邻卤醇在有机合成中具有特别重要的应用价值。

因为环氧化物环具有非常活泼的化学特性,易与亲核试剂发生反应生成一类重要的手性合成单元―――不对称醇类。

因此,多种合成光学纯环氧化物的生物学方法已被广泛研究,其中包括人们熟知的脂肪酶、环氧化物水解酶等。

卤醇脱卤酶催化邻卤醇生成环氧化物将成为高效合成光学纯的环氧化物的主要方法之一。

本文将重点介绍卤醇脱卤酶在催化合成环氧化物、短链β-取代醇以及叔醇类化合物方面的研究进展。

2 .卤醇脱卤酶的应用研究及发展特点技术优势
卤醇脱卤酶的催化特性显示这是一类具有广阔应用前景的多功能生物催化剂。

主要体现在催化邻卤醇与环氧化物之间的转化反应不依赖于辅助因子;卤醇脱卤酶不但可以催化碳-卤键的断裂进行脱卤反应,而且可以高选择性地催化接受除了卤离子以外的一系列非自然亲核试剂,如N-3、NO-2、CN-等所介导的环氧化物开环反应,用以生成一系列光学纯的β-取代醇[13-14]。

尤其在催化CN-介导的环氧化物开环反应中,不但可以合成一类具有光学纯的高价值中间体β-羟基腈,而且生成了新的C―C键。

因此,除了已知的转醛酶、转酮酶和羟基腈裂解酶外,卤醇脱卤酶也可以作为化学合成中的一种工具酶用于C―C键的合成中。

2.1 高选择催化邻卤醇的脱卤反应
卤醇脱卤酶在催化由邻卤醇合成环氧化物方面具有很高的立体选择性,因而通过动力学拆分可以直接合成具有光学活性的环氧化物和卤代醇类。

其中光学纯的邻卤代醇是合成光学纯的环氧化物的前体,环氧化物环具有极其活跃的反应特性,易于和卤素、碳、氮、氧或硫等亲核试剂反应,因此可以制备很多相关的衍生物。

尤其是具有光学活性的C3环氧化物及其衍生物,如表氯醇、缩水甘油2,3-二氯-1-丙醇和3-氯-1,2-丙二醇等,由于它们都具有甘油的骨架,因而在手性化合物合成方面极具潜力。

例如缩水甘油衍生物与胺的转化是制备多种β-阻断剂中非常重要的一步[15]。

目前,应用单加氧酶和环氧化物水解酶来合成光学纯的环氧化物也有相关报道。

来源于放射形土壤杆菌(A?radiobacter)菌株AD1的卤醇脱卤酶HheC可以高选择性地催化不同的芳香族邻卤醇的转化,生成相应的R型环氧化物和S型邻卤醇。

动力学分析显示HheC的高对映体选择性主要取决于酶对不同对映体的绑定和化学反应步骤。

卤醇脱卤酶的这一催化特性也在相关的X射线的晶体学研究中得到了解释[16]。

三级结构数据显示,对映体(R/S-pNSO)在活性位点的空间结合位置存在着明显的区别。

主要体现在环氧化物环上的氧原子及β碳原子的位置不同。

其中S对映体以非产物形式结合于其上,即环氧化物上的氧原
子取向错误,以至于无法与催化氨基酸残基酪氨酸Tyr145形成氢键,亲核试剂无法对β碳原子进行亲核攻击。

因此,只有R构型的对映体才能转化为相应的β取代的醇。

自由能的计算显示二者之间只有很小的差异,这同R构型结合有两个氢键而S构型的结合只有一个氢键相一致。

上述研究结果为该酶的改造奠定了良好的理论基础。

可以应用定点突变技术对酶的底物结合口袋进行改造,来调控HheC的对映体选择性[17]。

通过将该区域的139位酪氨酸突变为较小残基,突变体HheC完全失去了野生态酶对(R)型对映体的高选择性。

稳态动力学研究表明,这主要是由于突变体对(S)型底物的亲和力大大提高,而对(R 型底物的亲和力有所降低的缘故。

另外,通过对酶催化反应的限速步进行改造可以大大提高酶的催化活性。

突变体HheC如Y187F和W249F在催化对-硝基-2-溴-1-苯基乙醇(p-nitro-2-bromo-1- phenyl-ethanol)和1,3-二氯丙醇的转化过程中其活性得以提高。

主要是因为增加了卤离子的释放速度,该步骤为这些底物转化的限速步骤[18]。

这些研究表明定点突变在调控卤醇脱卤酶的活性与对映体选择性方面是一种值得推广的好方法。

卤醇脱卤酶在选择性催化邻卤醇转化为环氧化物反应中,由于反应热动力学平衡的存在,使得反应难以完全进行。

闭环反应是否完全进行,主要取决于底物中卤素取代的类型。

对于氯取代的邻卤醇,平衡更倾向于形成卤醇,并遵循以下顺序Cl->Br->I-。

为了避免由此而造成较低的对映体过剩值(e?e?),Lutje等[19]通过加入过量的环氧化物水解酶来提高产物的光学纯度,并获得光学纯S型2,3-二氯-1-丙醇和2-氯-1,3-苯基乙醇(e?e?值均大于99%),且E 值分别为>100 和73。

2.2 亲核试剂介导的环氧化物开环反应
卤醇脱卤酶的多功能性主要体现在亲核试剂所介导的环氧化物开环反应中。

Lutje等[14]以对硝基苯乙烯氧化物为底物的反应中测验了卤醇脱卤酶与一系列的离子和非离子亲核试剂参与反应的能力, 发现酶可以接受Br-、Cl-、N3-、NO-2和CN- 等阴离子作为亲核试剂,并且具有较高的区域与对映体选择性。

新近研究表明,除了上述亲核试剂, 卤醇脱卤酶还可以接受其余4种阴离子亲核试剂, I-、SCN-、OCN-和HCOO-[20-21]。

在环氧化物开环反应中,卤醇脱卤酶可以高选择性地催化9种不同的亲核试剂所介导的反应。

因此,可以通过动力学拆分手段制备多种具有光学纯的β-取代醇和环氧化物,充分显示出卤醇脱卤酶的广阔应用前景。

2.2.1 环氧化物的叠氮化
最早生物法催化环氧化物叠氮化反应是由红球菌Rhodococcussp.的酶粗提液参与完成的[22],其终产物叠氮化醇具有很低的e?e?值,并且人们对粗提液中真正起催化作用的酶了解甚少。

此外,可以接受N-3作为亲核试剂的生物酶种类也很少。

卤醇脱卤酶可以接受N-3 作为亲核试剂,而且反应表现出极高的立体选择性[13]。

如HheC在催化对-硝基氧化苯乙烯(p- nitro-styreneoxide,pNSO)进行叠氮化反应,其终产物(R)-1-对-硝基苯基-2-叠氮化乙醇的e?e? 值为96%,同时没有反应的(S)型环氧化物的e?e?值高于99%。

除了对-硝基氧化苯乙烯外, HheC对对-氯环氧苯乙烯也显示出极高的立体选择性(E>200)。

对氧化苯乙烯的选择性却一般, 主要是由于后者化学性环氧化物叠氮化反应很快。

通常,化学性环氧化物叠氮化反应是α位的区域选择,而酶催化的反应显示出了很高的β区域选择性。

因此,化学性环氧化物叠氮化反应的存在,在某种程度上降低了该反应的立体选择性。

上述动力学拆分的最大不足之处是其最高产量只能达到50%,而动态动力学拆分则利用了非偏好对映体可以发生外消旋反应这一特性,可以使最终产量高达100%。

Lutje等[23]正是利用这一特性, 以表溴醇为底物对其叠氮化反应进行了研究。

反应体系中加入一定浓度的溴离子,表溴醇除了可以发生叠氮化反应外还可以生成1,3-二溴丙醇。

由于HheC对1,3-二溴丙醇闭环反应具有较低的对映体选择性,而对表溴醇的叠氮化反应具有很高的对应体选择性,因此,表溴醇可以通过该反应进行外消旋化。

在一定条件下,以表溴醇为底物,通过动态动力学拆分可以使得e?e?值大于99%的(S)-1- 叠氮基-3-溴-2-丙醇的产量提高到77%。

总之,环氧化物的叠氮化开环反应可以用于合成具光学活性的叠氮醇,该产物是极具应用价值的生物活性物质―――胺醇的直接前体。

2.2.2 环氧化物的亚硝酸化
HheC催化的以NO-2作为亲核试剂的环氧化物开环反应较上述的叠氮化反应复杂,主要是由于NO-2的兼性离子特性,即氧原子和氮原子都可以对环氧化物环上的C原子进行亲核攻击。

虽然NO2介导的环氧化物开环反应同叠氮化反应一样具有较高的区域选择性(β位进攻为主),仍然可以产生两种取决于亲核试剂的N/O选择性攻击而得到的异构体产物。

其中产物之一亚硝酸酯在水溶液中尤其在低pH值情况下极不稳定,很容易水解成相应的二醇,它由亚硝酸根上氧原子攻击环氧化物环上β碳原子所得;当氮原子攻击环氧化物环上β碳原子时,产物为硝基醇(图2)。

研究结果显示,野生态HheC在催化环氧化物亚硝酸化反应中,以氧原子攻击环氧化物环上β碳为主,因此终产物大部分是二醇[24]。

同叠氮化反应一样,卤醇脱卤酶在催化环氧化物的亚硝酸化反应中仍然显示出对(R)型环氧化物的立体偏好性。

其对映体选择性的高低主要取决于环氧化物的结构,当环氧化物为芳香族或具有α,α-双取代的环氧化物时,卤醇脱卤酶显示出极高的对映体选择性;当底物为一般的端位脂肪族环氧化物时,卤醇脱卤酶通常具有较低的对映体选择性。

此外,当以pNSO为反应底物时,通过动力学拆分不但可以得到对-硝基苯基-1,2-乙二醇(e?e?= 91%),而且得到具有99%e?e?值的(S)-环氧化物,其产量为48%。

因此,从某种意义上讲,卤醇脱卤酶可以替代环氧化物水解酶进行环氧化物的制备。

2.2.3 氰化物介导环氧化物开环反应
因其在酶催化合成中的多功能性,氰根作为亲核试剂进行环氧化物开环反应显得尤为重要。

其产物β-羟基腈是一种用于合成具有生物学活性化合物的多用途砌块,是高附加值化合物氨基酸、羟基酸、α-羟基醛等的中间体。

日本Nakamura研究组最早报道了从来源于棒状杆菌(Corynebacteriumsp?)N-1074菌株中分离得到的卤醇脱卤酶,可以接受CN-作为亲核试剂催化环氧丁烷开环反应,生成外消旋的β- 羟基戊腈;催化表氯醇开环生成(R)-γ-氯- (R)-β-羟基丁腈[25-26]。

后者是用来合成左旋肉碱(L-carnitine)的中间体,左旋肉碱是一种类氨基酸,可以有效促使脂肪转化为能量,是减肥药物的主要成分。

HheC同样可以以氰根作为亲核试剂,催化环氧化物开环生成β-羟基腈[27]。

具有大体积取代基相对于简单的端位脂肪族环氧化物而言更具对映体选择性,特别是α,α-双取代的环氧化物的转化。

因此,可以生成用其他方法难以实现的光学纯三级β- 羟基腈[28]。

但是该反应的缺点是具有较低的转化速率,从而制约了其广泛的应用。

为了克服上述限制,蛋白质的理性设计及分子定向进化技术可以用于酶的改造,从而使其成为理想的生物催化剂。

新近报道的Fox等[29]的工作非常引人注目。

针对卤醇脱卤酶在催化CN-介导的环氧化物开环反应的低催化活性,他们巧妙地将随机突变与计算统计方法相结合,成功地对HheC进行改造,使产物抑制作用得以消除。

因而使得该突变体HheC在氰化物介导的催化过程中催化活性得到将近4000倍的提高。

该研究成果已成功应用于合成降低胆固醇药物Lipitor 的前体。

2.2.4 环氧化物的氰酸化反应
除了上述的亲核试剂外,新近研究发现,卤醇脱卤酶HheC还可以接受OCN-作为亲核试剂[21]。

由于环化反应的存在,最终生成口恶唑烷酮(oxazolidinone)。

口恶唑烷酮是一类非常有价值的用以生产药物中间体及手性助剂和受体的合成砌块。

该类化合物虽然可以通过化学方法合成,但产量不高。

另外,反应需要在含有机溶剂的溶液中进行,并且只适用于端位烷烃环氧化物。

因而应用化学方法由环氧化物合成口恶唑烷酮具有很大的局限性。

卤醇脱卤酶HheC催化OCN-介导的环氧化物开环反应中,由于OCN-具有兼性亲核试剂的特性,因此,该离子中的N和O都可以对环氧化物环上的β碳原子进行亲核攻击,生成β-羟基氰酸酯和β-羟基异氰酸酯两种异构体产物。

由于β-羟基氰酸酯在室温下不稳定,发生异构化生成β-羟基异氰酸酯,而β-羟基异氰酸酯会自发进行环化反应最终生成5-取代口恶唑烷酮。

通过对所生成的产物进行鉴定,发现终产物只有5-取代口恶唑烷酮, 而不含其他中间产物。

卤醇脱卤酶HheC催化OCN-介导的环氧化物开环反应不但具有较高的对映体选择性,而且具有较高的区域选择性。

因此, 可以用来制备光学醇的5-取代口恶唑烷酮。

尤其是对2,2-双取代的环氧化物,HheC同样显示出较高的立体选择性。

这与以前报道相一致。

2.2.5 其他亲核试剂所介导的环氧化物开环反应
卤醇脱卤酶也可以接受硫氰酸根作为亲核试剂[20]。

在有硫氰酸根和环氧丁烷存在的条件下, 酶促反应的产物中只含有(R)-1-异硫氰酸-2-丁醇。

这表明作为兼性离子的SCN-,只发生硫原子对环氧化物环上的β碳原子的亲核攻击,且反应具有很高的对映体选择性。

此外,甲酸根也是卤醇脱卤酶的底物,但与前面几种亲核试剂不同之处是甲酸根进行亲核攻击的位点是环氧化物环上的α碳原子,而不是β碳原子。

综合上述研究结果,发现酶对于不同的亲核试剂具有不同的催化特异性,而被接受的非卤离子的亲核试剂都是近于线性构型阴离子,这在很大程度上取决于卤素绑定位点的空间结构,很可能是由于绑定位点具有隧道样形状。

而卤醇脱卤酶对具有双取代基的环氧化物有较高的对映体选择性。

该类环氧化物的立体化学中心可以描述为大取代基和小取代基。

如果小取代基是甲基时,不管较大取代基是烷基、苯基或是酯基,卤醇脱卤酶对该类底物都表现出极高的对映选择率(E>200)。

通过分子模拟发现甲基伸出于由Trp139、Asn176和Thr134形成的一个较小的空穴内。

在此位置上稍为大一些的基团就会与这些氨基酸发生空间排列上的冲突,因此S型的对映体不能很好地结合在活性位点。

3 .结论与与发展趋势
卤醇脱卤酶在催化环氧化物开环反应中,不但可以接受卤离子作为亲核试剂,还可以接受包括N-3、NO-2、CN-、OCN-和SCN-等在内的非自然亲核试剂,且开环反应大多发生在环氧化物环的β位,因此可以用来合成一些非自然手性化合物(图3)。

这充分展示了卤醇脱卤酶的多功能生物催化特性,不但可以催化碳
卤键的生成和断裂,还可以催化碳氧键、碳硫键以及碳碳键的生成,并且所生成的产物具有较高的e?e?值和较好的产量。

因此,卤醇脱卤酶可以广泛应用于环氧化物以及β-取代醇。

其中叠氮化醇、氰取代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前体;手性氨基醇在生物制药领域是一类很重要的化合物,可用来合成多种生物活性物质。

异硫氰酸取代醇和口恶唑烷酮在农用化学试剂、医药和高分子化学领域中有着广泛应用。

在已知的3类卤醇脱卤酶中,对HheC的研究最为详细,其具有诸多HheA和HheB所不具有的特点,如对于氯丙酮的相对高水平的活性,对短链邻卤醇或环氧化物具有较高的活性及立体选择性(R型偏好)。

在CN-介导的环氧化物开环反应中, 特别是当环氧化物上的手性碳上存在两个取代基的时候,其手性选择性得以极大的提高。

尤其是甲基作为第二取代基在手性中心的引入极大地增加了手性选择性(E>200)。

因此,卤醇脱卤酶可以用来生产具有光学纯的叔醇。

相似的规律在细菌环氧化物水解酶中也有发现[30]。

HheA和HheB具有中等对映体选择性,并且环氧化物中取代基的大小对酶的选择性与活性都有一定的影响。

一般是随着取代基体积的增加,其选择性增加催化活性降低。

HheB在脂肪族环氧化物的开环反应中对映体选择性较低,但对带有较长侧链或较大取代基的底物呈现较高的催化活性。

3类酶具有各自的催化特色, 可以针对各自特点对酶进行改造,使其充分发挥各自的优势。

这对大大拓宽卤醇脱卤酶的应用范围起到十分积极重要的推动作用。