脱氧核酶的研究进展

脱氧核酶的研究进展

脱氧核酶（deoxyribozyme，DNAzyme/ Dz）是利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。实质上, Dz也是一种反义寡聚核苷酸,它完善和补充了反义寡聚核苷酸药物的范围。自Breaker和Cuenoud等首先报道Dz功能以来, Dz的结构和催化活性已扩展到多样化,而研究的热点及应用最多的还是Dz10~ 23和Dz8~ 17两种。

关于Dz的优点在这里就不一一介绍了，简单说明下即可。

Dz为DNA片段, 非蛋白质,仅能由人工合成,非生物体组成成分,分子量小, 易于合成,稳定性高, 不仅与RNA底物配对的精确性高,RNA分解酶活性强,而且不需要胞内酶类的参与。此外, Dz具有与一般药物相似的动力学特点,对靶RNA水平的抑制程度及时间容易控制, 这就决定了Dz在医药和生物学上的不可取代性和开发的必要性。

下面我着重来介绍下Dz在几大领域的研究进展：

1 生物学方面

Dz作为一种工具酶, 应用它可以在细胞水平从事基因敲除实验, 即特异性地失活某一基因, 借以观察该基因在细胞生理、生化中的作用,探测基因功能。由于Dz对DNA 和RNA具有多重作用,它将在基因工程和DNA的直接修饰中作为一种有力的分子生物学工具。在生物进化上,Dz和核酶催化功能的发现, 改变了核酸是一种被动分子,仅适合于编码和携带遗传信息这一观念。由于RNA具有催化反应和储存信息双重功能, 故当前生命起源理论强调RNA 的原始作用。然而, 现在很清楚, DNA、可能还有其他的多聚核苷酸, 也能完成此两项功能, 由于DNA的相对稳定性, 所以了解脱氧核苷酸的生物前合成途径在生物进化上显得较为重要,即使非高效的途径,经过一定时间, 也可引起高浓度的寡聚脱氧核苷酸聚集。

2 医药方面

由于Dz的众多优点, 其已成为分子生物医学和新药开发的热门话题。在已知靶基因序列, 且了解该基因在致病过程中的作用的前提下,设计出相应的Dz,可以对疾病进行基因治疗。现Dz已用于病毒性疾病、肿瘤、遗传性疾病和血管疾病的研究中。以HIV21V3环区为靶位点的Dz能在体外转录系统中有效切割靶RNA保守序列, 抑制病毒在细胞内的复制; Toyoda等用Dz在培养细胞中有效地抑制流感病毒的复制,其作用明显优于反义寡聚核苷酸且毒性较小; Cai rns等合成的Dz在体外实验中有效抑制人乳头瘤病毒的基因表达; 以原癌基因c2mycRNA翻译起始区为靶序列的Dz在体外能有效切割其全长底物, 下调

c2myc在平滑肌细胞内的基因表达, 抑制细胞的增殖; Yen等设计的Dz在细胞内以序列特异性的方式切割亨延顿舞蹈病基因,降低蛋白的表达; 针对一种早期生长反应因子(EGR21)mRN A的特定序列设计的Dz, 在猪模型中能选择性抑制EGR 21的表达和猪冠状动脉平滑肌细胞的增殖,有效地抑制了冠脉血管成型术后的再狭窄。这些体外实验及动物实验, 为Dz进一步到达临床实验奠定了基础。Science评论Dz有可能在不久的将来走向临床,被制成多种特异性极强的核酸药物, 控制与疾病相关的RNA表达水平,为众多疾病的治疗提供崭新的手段。

下面举两个例子：

2.1病毒感染的基因治疗

Cairns等于1999年首先将10～23 DRz用于抗人乳头状瘤病毒(HPV)的研究，设计了80多条针对HPVl6的E6、E7 mRNA的脱氧核酶，应用多重分析方法，发现针对HPVl6致瘤基因E6／E7的80种脱氧核酶中有8种脱氧核酶具有很强的切割效率，这种在无细胞体系中筛选出的脱氧核酶在细胞中同样有效。研究发现脱氧核酶是肝炎病毒治疗中的一种良好的基因治疗方法。研究发现，脱氧核酶在靶基因调控性荧光素酶表达HepG2细胞中对丙型肝炎病毒(HCV)5，-非编码区(5'-NCR)同时具有反义抑制和剪切作用；应用脂质体转染将药物导入细胞内显著优于直接加药的效果。针对HBVs基因和C基因设计的特异性lO～23 DRz．作用于2.2.15细胞后，可显著抑制HBVs基因、C基因的表达，该抑制效应呈剂量依赖性，24h内可使上皮细胞内的丙型肝炎病毒RNA减少48％。

研究还发现，针对呼吸道合胞病毒(RSV)NS2基因的脱氧核酶(DZ604)，能明显改善RSV导致9HTE细胞的病理改变，5mmol／I。的DZ604能够抑制减少85．56％的RSV。Takahashi设计针对流感病毒A PB2mRNA翻译起始AUG的脱氧核酶，两端经过氨基磷酸化修饰后，能明显增加抵抗核酸酶降解能力，能减少99％的病毒复制，并有很高的特异性，对流感病毒B无明显抑制能力。

3．2肿瘤的基因治疗

血管生成在肿瘤的发生发展中具有重要作用，抗血管生成是目前肿瘤治疗的热点之一。科学家设计了针对肿瘤血管生成相关的人血小板型12-脂加氧酶的脱氧核酶，导人人红白血病细胞中，能显著抑制12-脂加氧酶的表达，这有可能成为12-脂加氧酶基因敲除的特异性工具和抑制肿瘤生长的新策略。同时发现脱氧核酶能够有效抑制血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)mRNA，并有时间和剂量依赖性。通过抑制肿瘤血管的生成，经过4次注射，可将活体肿瘤大小减少70％。后来Khachigian等也发现脱氧核酶通过抑制早期生长应答子1(Egr-1)mRNA，从而抑制癌细胞的血管生成，抑制癌细胞增殖、转移及裸鼠移植瘤的生长。增殖凋亡失调在肿瘤的发生发展中具有重要作用。科学家又设计了针对bcl／abl融合基

因的脱氧核酶，能特异地切割bcl／abl mRNA，抑制慢性髓性白血病或急性淋巴细胞性白血病细胞的生长，促进癌细胞的凋亡。

尽管Dz在生物医药方面已显示出强大的生命力,但是, Dz要发挥催化作用,底物与Dz的相互接近,Dz对细胞的转染,Dz在细胞内的稳定性等, 这些课题还需进一步研究, 目前已有一些进展:

Dz10~ 23能在嘌呤和嘧啶连接处高效水解RNA,但其切割位点往往被RNA 二级结构所保护,以抵抗Dz的活性。Cairns等发展了一种切割系统,用于筛选靶RNA分子的整个长度,而其切割位点在动力学及可接近性方面都是高效的。此系统为杂交试剂的位点选择提供了有用数据。

运用Dz10~ 23已对HIV21基因组的许多区域进行过研究,都是用脂质介导Dz进入哺乳动物细胞,此严重地限制了Dz在体内的实际应用。重庆医科大学附属儿童医院免疫研究室用胆固醇连接转染Dz入靶细胞,效率提高了3~ 4倍。由于G残基能直接与巨噬细胞上清道夫受体相互作用,Unwalla等合成了一种3c末端含10 个G残基的Dz5970,其在缺乏脂质转染的情况下, 能直接特异地被人类巨噬细胞提取, 也能在瞬时表达系统和病毒感染时抑制HIV 21基因表达,而切割效率轻微受影响。这些亲巨噬细胞的新型Dz具有潜在的应用价值。

为了提高Dz5970在细胞内的稳定性, Unwalla等在Dz5970两端各添加了长12个碱基的茎2环结构, 但切割效率显著降低。科学家也报道, Dz的磷酸硫酯修饰在体外显著的提高了Dz的胞内稳定性,但其动力学效率下降。总之, Dz 和核酶都催化一套相似的自我修饰反应。如果此功能上的相似性可以延伸, 那么, 还有很多目前尚未发现的Dz。目前已知Dz的变异体可用来产生自我标记DNA 探针,别构Dz将有可能用作构建高级生物传感器的精确分子开关, 甚至DNA计算器件。但是,简单的Dz能与细胞内的靶蛋白共价融合吗? 能够获得更多的改变细胞遗传组成的高级结构域的Dz吗? 这些任务对生物体中不存在的Dz来说,很具有挑战性, 还需要进一步探讨。

脱氧核酶作为一种崭新的分子生物学酶切工具，作为一种新型RNA水平强效基因灭活因子，为病毒感染性疾病、肿瘤和其他相关疾病提供了一条全新的基因治疗途径。但是如何将脱氧核酶发展成为新型基因治疗药物以及基因分析和诊断的工具，还需要进一步深入研究。相信在未来，脱氧核酶会扮演相当重要的角色。