生物样品的常用分析方法

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紫外分光光度法（UV）
原理同比色法。适用于测定具有紫外 吸收的药物。 体内药分中母体药物与代谢物的紫外 吸收光谱非常相似，易产生干扰。受灵敏 度和选择性的限制，其在体内药分中的应 用也呈下降趋势。
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荧光分析法 （Fluorescence method） 利用物质经光照射后能发射荧光的特性 进行分析的光学分析法。
参考文献：涡流色谱技术在生物样品分析中的应用 刘朋，周建良，安婧婧，李萍，Chinese Journal of Chromatography
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光谱法(Spectroscopy)
光谱法是基于检测能量（电磁辐射） 作用于待测物质后产生的辐射信号或所 引起的变化的分析方法。
特点
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薄层扫描法 (TLCS)
实例：薄层扫描色谱法检测血清中对乙酰氨基酚 采用TLCS法检测患者血清中对乙酰氨 基酚的浓度，为临床急诊中毒分析和血药浓 度监测提供了快速简便的方法。 该法板间测定误差小、回收率高、线 性范围宽，能准确测定患者血药浓度。与文 献报道的HPLC和GC法相比，具有简便快 速、样品用量少、费用低和不需要进行衍生 化等优点 。
体内药分专题之五—— 生物样品常见分析方法
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思考
1.在体内药物分析中所采用的生物 样品有哪些? 2.最常用的生物样品是什么? 3.药物分析中常见分析方法包括哪 些?哪些适用于体内药物分析?
生物样品的常用分析方法
体内药物分析是借助于现代化的仪器 与技术来分析药物在体内数量与质量的变 化，以获得药物在体内的各种药代动力学 参数、代谢方式、代谢途径等信息。目前， 用于生物样品分析的方法有很多，归纳起 来主要有以下几类：
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荧光分析法 （三）荧光探针分析法
（Fluorescence method） 局限 衍生化增加分析 步骤，易引入分析 使用荧光探针从无荧光的药物制备有荧光 误差。 的衍生物。
优点
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增强待分析 物质的荧光 响应，提高 检测灵敏度 和选择性。
稳定分析物， 有助于化合 物基团的确 尤其针对活 证。 泼的和有挥 发性的化合 物。
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薄层色谱法 （thin layer chromatography ）
分离速度快
优点
检出灵敏度高 选择性好 显色方便等
缺点：对生物高分子分离效果不甚理想。
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薄层扫描法 (TLCS)
系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄 层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射 能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得 到的图谱及积分值用于药品的质量检查的方 法。 与高效液相色谱法相比，具有多通道效应， 可同时平行分离分析多个样品；流动相用量 少且选择范围宽、更换方便；固定相为一次 性使用，对样品的预处理要求不高等优点。 已成为薄层色谱常用的定量方法，在体内药 物分析中广泛应用。
实例:气相色谱法测定中毒病人血液中的溴氰菊酯
方法: 样品加入乙腈、涡旋混合、超声提取 、Florisil固相萃取柱净化、氮吹，DB-17石 英弹性毛细管柱30m(0.32mm，0.25μm)分离 ，气相色谱电子捕获检测器(GC-ECD)检测, 保留时间定性，外标法定量。 结果: 方法最低检出限为0.01 ng/ml，样品加 标回收率为80.1%~94.5%， 相对标准偏差 (RSD)为2.3%~4.8%。
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胶束电动毛细管色谱(MECC)
在MECC体系中存在着以胶束形式存在的 准固定相和作为载体的液体流动相，胶束带电 荷在电场的作用下产生泳动，溶质中各组分依 据其在水相和胶束相之间的分配差异及在电泳 和电渗流驱动下出现淌度差异而分离。 优点：手性拆分常用的分离模式之一，只需在 背景电解质中添加手性选择剂，构建手性环境， 即可进行手性拆分，本法适用于拆分人体内的 氨基酸。
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荧光分析法
（Fluorescence method）
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薄层色谱法 （thin layer chromatography ）
是以涂布于支持板上的支持物作为固定相， 以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行 分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。 根据不同的分离机制，薄层色谱法可分为 吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换 薄层色谱和凝胶薄层色谱法等。
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气相色谱法 (gas chromatography ，GC)
结论: 该方法简便、快速、准确，检出限
低，适合中毒病人血液中溴氰菊酯含量的测 定。
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高效液相色谱法
定义 以经典液相色谱为基础，以微粒型填 料作固定相，采用高压送液泵和各种高灵敏度 检测器。 分离效能高
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生物样品的常用分析方法
1. 色谱分析法 2. 光谱分析法
3. 免疫分析法
4. 微生物分析法 5. 电化学分析法
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色谱法(chromatography)
一种物理或化学的分离分析方法，其分 离原理主要是利用物质在流动相和固定相 中的分配系数，或吸附能力的差异而达到 分离。 包括薄层色谱(TLC)，纸色谱(PC)，凝 胶色谱，气相色谱(GC)和液相色谱(LC)。
优点：
1.灵敏度高。检出限可达10-10 g/ml~1012g/ml。 2.选择性好。
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荧光分析法 （Fluorescence method） (一)常规荧光分析法
1.直接测定法 适于自身能产 生荧光的物质，因 荧光性质与溶液的 pH有关，故荧光强 度的测定须在适宜 的pH介质中进行。
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为10.03 ng/ml，线性范围为10.03～40110 ng/mL，日内RSD为1.9% ～5.9% ，日间RSD 为3.4% ～7.3%。受试制剂中对乙酰氨基酚的 相对生物利用度为(96.1 ±15.0) % ，曲马多的 相对生物利用度为(93.9 ±15.3) %。 结论:本方法操作简便、灵敏度高，可用于临床 血药浓度测定。受试制剂与参比制剂生物等效 。
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高效液相色谱法
高效液相色谱法串联紫外- 荧光检测器同时测定 人血浆中对乙酰氨基酚与盐酸曲马多的浓度
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流动相，紫外- 荧光检测器串联法同时在线检 测对乙酰氨基酚与曲马多，紫外检测波长: 245 nm；荧光激发波长: 275 nm，发射波长: 304 nm。20名健康志愿者服药后,依据血浆中 对乙酰氨基酚与曲马多经时血药浓度,对2种 制剂进行了生物等效性研究。 结果:本法中对乙酰氨基酚最低定量限为 0.110μg/mL，线性范围为0.11000～ 10.100μg/mL ，日内RSD为3.9% ～8.0% ， 日间RSD为5.5% ～6.7%；曲马多最低定量限
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高效液相色谱法
分 离 方 法
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高效液相色谱法 色谱分离方法的选择 主要根据是样品的相对分子质量 的大小，在水中和有机溶剂中的溶解 度，极性和稳定程度以及化学结构等 物理、化学性质。
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高效液相色谱法 一、相对分子质量
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气相色谱法 (gas chromatography，GC) 缺点：
要求被测药物及其代谢物必须具有一定的 挥发性和热稳定性。
解决方法：固定相发展和衍生化试 Nhomakorabea的广泛使用，使 生物样品不再受限制。
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气相色谱法 (gas chromatography，GC)
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荧光分析法
（Fluorescence method） 示例 Tb-吡哌酸的荧光体系及尿和血清中 吡哌酸含量的测定 应用镧系离子发光探针生成Tb-吡哌酸配 合物，在紫外光照射下发生分子内能量传 递使Tb产生特征荧光，其荧光强度与吡哌 酸浓度呈线性关系，从而建立一种灵敏、 快速的分析吡哌酸的方法。
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胶束电动毛细管色谱(MECC)
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涡流色谱技术(TFC)
涡流色谱技术是利用大粒径填料使流动 相在高流速下产生涡流状态，从而对生物样 品进行净化与富集。 优点: 可以在线处理生物样品，速度快、选择 性好、灵敏度高，易于实现自动化，近年来 在生物领域尤其是体内药物分析中得到了广 泛的应用。
2.间接测定法
将无荧光或弱 荧光物质衍生化， 测定衍生物荧光 强度的方法。
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荧光分析法 （Fluorescence method） （二）胶束增溶增敏荧光分析法
利用胶束溶液对荧 光物质的增溶、增 敏和增稳作用，大 大提高荧光分析法 的灵敏度和稳定性。
用β-CD单分子胶束荧光技术 检测秦艽中龙胆苦苷血药浓 度。 龙胆苦苷嵌入β-CD的疏 水空洞中，使其在胶束中溶 解度增加和相互碰撞几率减 少，荧光量子效率提高，从 而提高检测灵敏度。
优点
检测灵敏度高 分析速度快 选择性好
适用范围广
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高效液相色谱法
缺点 有“柱外效应”。在从进样到检测器 之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、 柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动 相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和 滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率 降低。 高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。