病理组织切片制作过程详解

病理组织切片制作过程详解
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1．取材
取材的好坏，直接影响切片的质量。

取材时，首先要有一把锋利的取材刀，在切割组织时要避免取材刀来回拖拉，切取的组织块厚薄要均匀，一般厚度以0.2 ～0.3cm 为适，较容易发脆的组织如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、大块癌组织等可适当厚一点，而脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些；淋巴结应修掉两侧球冠，并尽量剔除周围的脂肪组织。

在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织，如碰到不可避免的钙化组织，一定要非常小心。

在切取纤维组织、肌肉组织、胃肠道时，应注意纤维及肌肉的走向，取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。

(1）材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。

(2）组织块的大小：所取组织块较理想的体积为2.0cm ×2.0cm ×0.2cm ，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1～0.2cm 即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取0.3 ～0.5cm ，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。

（3）勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。

夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。

（4）规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。

（5）选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。

纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。

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（6）保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、毛发、粘液、食物、粪便等，可用生理盐水或PBS冲洗干净后再放入固定液中。

（7）保持组织的原有形态:新鲜组织固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。

为此可将组织展平，以尽可能维持原形。

2．固定
固定是病理制片工作的第一步，也是在整个制片过程中无法补救的一步。

所谓“固定”，就是组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。

固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构与生活时相仿。

另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加组织韧性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。

所以组织一旦离体必需及时固定，固定液的量应为组织的20倍以上。

固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。

最常用的固定液为10%中性福尔马林。

但10%中性福尔马林由于受到福尔马林的质量、使用时的挥发和取材时带入的水分影响，浓度被降低导致组织固定不足，而高浓度的福尔马林，降低了对组织的穿透性，形成周围固定好而中央固定不到的现象。

通过实践，个人认为以12～15%的中性福尔马林最佳。

（1）小块组织固定法：这是最常用的方法，从人体或动物体取下的小块组织，须立即置入液态固定剂中进行固定，通常，标本与固定液的比例为1:20倍以上，组织块不宜过大过厚，否则固定液不能迅速渗透。

组织块的大小一般为2.0cm×2.0cm×0.2cm。

（2）注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，或需要对整个脏器或整个动物体进行固定。

这时宜采用注射固定或灌注固定法。

将固定液注入血管，经血管分支到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。

（3）蒸汽固定法：比较小而厚的标本，可采用锇酸或甲醛蒸汽固定法。

如血液涂片，则应在血片未干燥前采用锇酸或甲醛蒸汽接触固定。

3.水洗
固定后水洗（10～20分钟），通常被很多人所忽视，而水洗不彻底，容易造成脱片和染色不鲜艳。

对需做免疫组织化学的组织，更不应当忽视。

福尔马林不利于组织块内抗原的保存。

4．脱水透明
标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入，这一过程称为脱水。

无论是用石蜡切片，还是用火棉胶切片，都必须除去组织中所含水分，因含水组织与石蜡、火棉胶等包埋材料不相容，包埋剂无法顺利进入组织。

脱水是否彻底，直接关系到组织是否能够充分透明，而脱水过度容易造成组织发脆。

造成组织发脆的原因还有加温、脱水剂内加有丙酮、浸蜡用的石蜡中二甲苯过多等等。

一般，我们总认为组织发脆跟高浓度酒精有关，而忽视了与低浓度的酒精关系，其实低浓度的酒精具有强大的穿透力，比纯酒精更容易渗透到组织块内部使之脱水，组织如果在低浓度酒精里充分脱水，在高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份，因此，仅需短时间就可完成，如果这时不缩短纯酒精的时间，便会引起组织发脆；如果脱水时加温，使用丙酮，还可引起组织收缩，并影响免疫组织化学的标记。

为了使石蜡浸入到组织块内，必须经过一种既能与脱水剂相互溶解，又能与石蜡相溶的媒介物质，这个过程称为透明。

目前最好的透明剂是二甲苯。

很多人认为二甲苯极容易使组织发脆，这个观点很片面，在常温下，如果不是时间过长二甲苯并不会引起组织过份发脆，相反会使某些组织结构比较质韧的组织（比如子宫肌瘤）等相当好切，但是当二甲苯温度过高，极易引起组织发脆。

所以大小标本最好分开脱水。

各种大小质地不相同的组织块最好制定不同的脱水透明程序。

常用的脱水剂为一系列不同浓度的乙醇。

脱水的步骤是：80%、90%、95%、100%等各种浓度乙醇，此过程可用脱水机自控完成。

丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂，但因其脱水能力很强，对组织有剧烈收缩作用，在制作科研、教学切片时一般不用该试剂。

常用的透明剂有二甲苯、氯仿、水杨酸甲酯等。

5．浸蜡、包埋
组织透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。

用其他浸透剂（如火棉胶、明胶等）渗入组织内部的过程可称为浸透或透入。

浸蜡温度过高（超过60℃），在蜡内加入二甲苯蜡或由于透明时带进的二甲苯过多，都会导致组织发硬，还会使组织内的抗原受到破坏；所以主张浸蜡用的石蜡熔点在56℃左右（三道），第一道：尽可能的短；第二三道时间可以适当延长。

浸蜡温度控制在56～58℃左右。

（1）使石蜡浸入组织中，取代组织中含有的透明剂。

（2）包埋：将浸蜡后的组织置于融化状态的石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包在其中，称
蜡块，此过程称为包埋。

脱水→透明→浸蜡→包埋过程制作不良对后期制片来说，后果将会是灾难性的。

6．修块、切片、贴片、捞片、烤片
（1）修整蜡块：可视其组织的大小，在组织边缘约0.1～0.2cm处，切去余蜡部分，否则易造成组织皱缩不平。

（2）准备好切片用具：切片机、切片刀、毛笔、眼科镊子（弯）、漂烘温控仪等。

（3）切片的厚度：切片机的厚度调节器上刻有0～50um，可任意选择其厚度，石蜡切片的厚度一般在4～6μm。

（4）切片
（5）展片：用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在40～45℃的水面上，借水的张力和水的温度，使蜡带自然展平。

（6）贴片、烘片：待切片在恒温水面上充分展平后，将蜡片捞到载玻片的中段处倾去载玻片上的余水，置入60～65℃恒温箱内或切片漂烘温控仪的烘箱内烤片15～30分钟，使组织粘附于载玻片上。

7.脱蜡至水
脱蜡也相当重要，如果脱蜡不干净，切片不易着色或着色不匀，所以，脱蜡用的二甲苯要经常更换，一般用3道二甲苯，每500ml液体，处理500张切片后更换一次为宜。

当室温低于18℃时，必须将切片从温箱拿出后立即放入二甲苯中脱蜡，或将二甲苯放入温箱内预热（37℃左右）脱蜡，最高不得超过60℃。

然后经高浓度的酒精到低浓度的酒精洗去二甲苯，至水。

8．染色
组织化学染色包括常规染色（HE染色）和特殊染色（简称特染，除HE染色以外的组织化学染色，如Masson、PAS、PASM、AB-PAS、VG）及免疫组织化学染色（IHC，简称免组）等，具体方法参照店铺内各个染色方法详解。

9.脱水、封固
切片如果想长期保存，必须要同外界的水分及空气隔绝，就像琥珀一样。

切片脱水应从低浓度的酒精到高浓度的酒精，80%酒精1道，95%酒精1道，纯酒精2道，二甲苯2道。

低浓度的酒精比高浓度的酒精更容易脱水，但也容易使染料褪色，故脱水时间可短一点，纯酒精时间可适当延长。

切片经二甲苯透明后，用中性树胶封固。

封片树胶不能过稀，封片时树胶要均匀充满盖玻片且树胶不及外溢为佳。

要将组织全部覆盖，也不能有气泡。