农杆菌介导水稻快速转化-Bio-protocol

农杆菌介导水稻快速转化

Agrobacterium-mediated Rapid Transformation of Rice

崔莹，蔡朝霞，林拥军，陈浩*

作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉

*通讯作者邮箱：hchen@

引用格式：崔莹，蔡朝霞，林拥军，陈浩. (2018). 农杆菌介导水稻快速转化. Bio-101 e1010176. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010176.

How to cite: Cui, Y., Cai, C. X., Lin, Y. J. and Chen, H. (2018). Agrobacterium-mediated rapid transformation of rice. Bio-101 e1010176. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010176. (in Chinese)

实验原理：Toki等(2006)发现，水稻成熟胚在诱导愈伤1 d后可以被农杆菌侵染，诱导愈伤5 d后可以被高效转化。Toki (1997)研究表明在32 °C、光照条件下，水稻愈伤组织可以快速分裂。在该条件下进行筛选培养，14 d可以得到明显的抗性愈伤组织。本实验的目的是在实验室已有的遗传转化方法基础上，参考Toki等(1997，2006)发表的部分实验参数，建立快速的水稻转化方法，以缩短遗传转化周期。本实验在32 °C、光照条件下诱导愈伤，对诱导5 d的水稻愈伤组织进行侵染，随后在32 °C、光照条件下以潮霉素作为筛选剂进行筛选培养，14 d后获得了抗性愈伤组织，对抗性愈伤组织进行分化培养，获得稳定的转化植株。从愈伤组织诱导到转化再生植株生根，整个实验周期约为50 d。

关键词：水稻成熟胚，农杆菌介导，快速转化

材料与试剂

1. 滤纸

2. 水稻种子

3. 75%酒精

4. 吐温20

5. 农杆菌菌株EHA105 (携带含目的基因载体)

6. 6-Benzylaminopurine (6-BA) (Sigma, catalog number: B-3408)

7. Kinetin (KT) (Sigma, catalog number: K-0753)

8. Naphthalene acetic acid (NAA) (Sigma, catalog number: N-0640)

9. Indole-3-acetic acid (IAA) (Sigma, catalog number: I-2886)

10. 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) (Sigma, catalog number: D-7299)

11. Kanamycin (USB, catalog number: 17924)

12. Casein Enzymatic Hydrolysate (CH) (Sigma, catalog number: N-4642)

13. Carbenicillin (Cn) (Bio Basic INC. catalog number: CDJ469)

14. Hygromycin B (Hn) (Roche, catalog number: 10843555001)

15. Nicotinic acid (Sigma, catalog number: N-0765)

16. Pyridoxine HCl (VB6) (Sigma, catalog number: P-8666)

17. Thiamine HCl (VB1) (Sigma, catalog number: T-3902)

18. Inositol (Sigma, catalog number: I-3011)

19. Phytagel (Sigma, catalog number: P-8169)

20. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma, catalog number: D-5879)

21. Acetosringone (AS) (Aldrich chem., CO 01531 EG)

22. Agar powder (日本分装，catalog number: BM0212)

23. Glycine (日本分装，catalog number: BA0802)

24. Proline (进口分装，catalog number: A1122)

25. D-sorbitol (上海生工，catalog number: SB0491)

26. NH4NO3

27. KH2PO4

28. KNO3

29. MgSO4·7H2O

30. CaCl2∙2H2O

31. MnSO4·4H2O

32. ZnSO4·7H2O

33. H3BO3

34. KI

35. Na2MoO4·2H2O

36. CoCl2·6H2O

37. CuSO4·5H2O

38. (NH4)2SO4

39. FeSO4∙7H2O

40. Na2EDTA∙2H2O

41. KOH

42. HgCl2

43. Glucose

44. Sucrose

45. LB培养基

46. 封口胶

47. MS max储备液(10x) (见溶液配方)

48. MS min储备液(100x) (见溶液配方)

49. N6max储备液(10x) (见溶液配方)

50. N6min储备液(100x) (见溶液配方)

51. Fe2+-EDTA储备液(100x) (见溶液配方)

52. Vitamin储备液(100x) (见溶液配方)

53. 6-BA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)

54. KT储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)

55. 2, 4-D储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)

56. IAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)

57. NAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)

58. 200 mM AS储备液(见溶液配方)

59. 1 N KOH储备液(见溶液配方)

60. 0.15% HgCl2 (见溶液配方)

61. 50% 葡萄糖(见溶液配方)

62. 250 mg/ml Cn (见溶液配方)

63. 50 mg/ml Kan (见溶液配方)

64. 诱导培养基(见溶液配方)

65. 悬浮培养基(见溶液配方)

66. 共培养基(见溶液配方)

67. 筛选培养基(见溶液配方)

68. 分化培养基(见溶液配方)