农杆菌介导水稻快速转化-Bio-protocol
一种提高农杆菌介导的水稻遗传转化效率的方法[发明专利]
![一种提高农杆菌介导的水稻遗传转化效率的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/2307f37f2f3f5727a5e9856a561252d380eb2034.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811544214.X(22)申请日 2018.12.17(71)申请人 靖西市秀美边城农业科技有限公司地址 533800 广西壮族自治区百色市靖西县新靖镇城东路宾山一小区18号(72)发明人 谢宗宜 (74)专利代理机构 北京天奇智新知识产权代理有限公司 11340代理人 牙斐颖(51)Int.Cl.C12N 15/82(2006.01)A01H 5/00(2018.01)A01H 6/46(2018.01)(54)发明名称一种提高农杆菌介导的水稻遗传转化效率的方法(57)摘要本发明涉及一种植物转基因技术领域，特别涉及一种提高农杆菌介导的水稻遗传转化效率的方法。
通过超声波处理种子获得萌动种子、含目的基因农杆菌的培养、侵染种子与共培养、脱菌与选择培养和转基因植株分子检测的步骤，获得转基因植株。
使用本发明方法可有效缩短转基因转化的时间，同时提高农杆菌介导的水稻遗传转化的效率。
权利要求书1页 说明书7页CN 109536523 A 2019.03.29C N 109536523A1.一种提高农杆菌介导的水稻遗传转化效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)种子的处理：水稻种子用清水浸泡12～16h后，捞出种子，放入浓度为0.1％～0.2％的高锰酸钾溶液中浸泡消毒20～30min，捞出种子，用无菌蒸馏水清洗2～3次，再用无菌滤纸吸干种子表面水分，将种子放入种子培养液中，于40℃～45℃下黑暗中超声波处理后，静置10～20min，捞出种子，放入40℃～45℃热水中浸泡6～10h，得到萌动种子；(2)农杆菌的培养：将含有目的基因的农杆菌单菌放入农杆菌培养液中，于25℃～30℃、220～280rmp下震荡培养，待OD 600至0.5～0.6时，于25℃～30℃、5000～6000rmp下离心10～20min后，弃上清液，得农杆菌悬浮液，将所述农杆菌悬浮液与等体积的甲液混均，配制成农杆菌侵染液；(3)侵染与共培养：用步骤(2)的农杆菌侵染液浸泡感染步骤(1)的萌动种子，捞出种子，用无菌滤纸将种子上的菌液吸干后，放在共培养液中，于25℃～30℃下共培养2～3d；(4)脱菌与选择培养：无菌双层纱布放入培养皿中，将步骤(3)共培养后的种子放在无菌纱布上，向纱布中倒入筛选培养液，使无菌纱布湿润，于人工气候箱25℃～30℃下培养6～8d，期间用筛选培养液浇湿纱布3～5次，筛选出能正常生根发芽的植株；(5)转基因植株分子检测：取步骤(4)植株的叶片，用CTAB法提取全基因组DNA，通过PCR 扩增和Southern杂交，检测目的基因片段是否成功导入植株。
农杆菌介导转化法的概述
农杆菌介导转化法的概述自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。
植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。
[1]目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。
由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术[2]。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。
本文对农杆菌介导转化法进行综述。
1 关于农杆菌农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。
1.1根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有Ti质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤；Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合环状DNA分子，大小约200-250kb。
依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。
原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区：1.1.1T-DNA区(Transfer—DNA region)：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24 kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列．其中14 bp 是完全保守的，分10 bp(CAGGAATATAT)和4 bp(GTAA)不连续的2组．左右2个边界(LB和RB)是T—DNA转移所必需的，只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要。
利用gfp报告基因优化农杆菌介导的水稻遗传转化
农杆菌介导的水稻转化
农杆菌介导的水稻转化一．愈伤组织的培养1.愈伤组织的诱导成熟水稻种子去壳，用70%酒精处理2min，无菌水冲洗2~3次，再用25%次氯酸钠消毒处理15min，无菌水冲洗5~6次，将种子转到灭菌的培养皿上，于超净工作台上吹干。
接种到诱导培养基N6AD2.5上，28℃暗培养至长出愈伤组织（10 d左右）。
2.继代培养用无菌镊子将愈伤组织转移到继代培养基N6AD2上，28℃暗培养10 d。
继代培养两次后待用。
二．农杆菌的转化及培养1. 取农杆菌LBA4404感受态细胞于冰上融化，并在冰上取50uL感受态细胞于电击杯中，加入2.5uL pHB质粒，冰浴30min，电击，向电击杯中加入800uL SOC 混匀，将混匀后的液体转移至1.5mL离心管中，28℃，200rpm，振荡培养2h，13000rpm离心5min，去掉大部分上清液，用200uL枪头吹打悬浮，涂板于YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)固体培养基上，28℃培养至长出菌落。
2. 挑取单菌落于5mL YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)液体培养基中，200rpm振荡培养过夜，取2mL过夜培养的菌液于100mL相同的YEP液体培养基中扩大培养至OD600=0.5，5000rpm离心5min收集细胞，用N6A CO液体培养基重悬。
三．浸染与共培养1.选择生长状态良好的愈伤组织，用无菌镊子将其适当夹小，创造伤口，然后放在无菌烧杯中用菌液浸泡，一般浸染时间为10~30min，浸染时要不是摇动。
2.倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液。
3.将吸干菌液的愈伤组织置于铺有一层无菌滤纸的N6A CO固体培养基上，26℃暗培养2~3天，直至愈伤组织上出现少量菌斑为止。
四．脱菌与筛选1.共培养的愈伤组织放在广口瓶中，用无菌水清洗至清澈；2.浸泡于含500mg/L Cef 的N6A CO液体培养基中，在摇床上中速振荡30~60min；3.弃液，将愈伤组织用无菌滤纸吸干或放在超净工作台上吹干后接放在一筛培养基上，26℃暗培养3周，再转入二筛培养基上26℃暗培养3周。
农杆菌介导法
农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究A Highly Efficient Agrobacterium - mediated Rice Transformation Method水稻是基因组研究的模式植物 ,近年来水稻基因组研究取得了很大进展 ,构建了遗传图谱和物理图谱 ,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2 - 3序 ,以及第 1 号和第 4 号染色体的精细测4 - 5序 ,并对第 10 号染色体的结构进行了详细分析。
在此基础上 ,各实验室大规模地 ,系统地进行水稻功能基因研究 ,普遍采用的研究手段是基因标签技术。
基因标签技术包括 T - DNA 和转座子标签 ,创建大量的基因标签体是功能基因研究的材料平台。
而根癌农杆菌介导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之一。
本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法 ,以期为水稻功能基因研究提供丰富材料 , 为水稻重要农艺性状的改良开辟途径。
1材料以水稻品种日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)为试验材料。
菌株类型为 EHA105 超毒力菌株 ,载体为增强子捕获载体 pFX- E24. 2 - 15R(见图 1) ,载体上带有 GUS报告基因、35 S的 CaMV 启动子序列和潮霉素选择标记基因(HYG) 。
农杆菌菌株为EHA105。
2方法2.1水稻愈伤组织的诱导诱导方法参照 HIEI7等。
将日本晴水稻种子去壳 ,用 75 %乙醇灭菌 5min ,再用2. 5 %的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min ,37 min ,30 min 和 25 min) ,以确定最佳灭菌时间 ,灭菌后用无菌水冲洗 6～8 次 ,于 MS 固体培养基上28 ℃避光培养 ,30 d 后 ,将愈伤组织进行继代培养 ,得到胚性愈伤组织。
2.2农杆菌转化愈伤组织用 AB 固体培养基+氯霉素 25 mg/L + 利福平 20 mg/L + AS 20 mg/L培养农杆菌 ,在20 ℃下培养5～6 d。
农杆菌介导的水稻转化
农杆菌介导的水稻转化实验目的学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。
实验原理随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。
水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。
DNA直接导入法主要包括PEG（polyethylene glycol）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。
其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。
基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。
同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。
所以已成为转化单子叶植物的首选方法。
一、目标基因对农杆菌的转化1.1农杆菌感受态细胞的制备1.取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线，28℃黑暗培养。
2.挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16小时。
3.取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.5。
农杆菌介导转化水稻方法的改进
织 ．以 ＡＡＭ 培 养 基作 为 共 培养 培 养基 ，对 于农 杆菌 ＥＨＡ１０５（ｐＵｂｌｍ）来 说 ，菌液 浓度 为 （）Ｄ６ｏｏ值 ＝０．８时 ，愈 伤
组 织 的转 化 率 最高 ．在 农 杆 菌侵 染 愈伤 组 织过 程 中 ，通 过 负 压 处 理 可 明显 提 高 愈 伤 组 织 的 转化 频率 ．在 愈 伤 组
程 的 研 究 ．
第 ５卷 第 ３期
王志 成 ，等 ：农 杆 茵 介 导 转 化 水 稻 方 法 的 改 进
第 ５卷第 ３期 ２００８年 ９月
长 沙 理 工 大 学 学 报 （自 然 科 学 版 ） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈａｎｇｓｈａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
水稻遗传转化体系Protocol
水稻遗传转化体系ProtocolIntroduction1．水稻的遗传转化研究历史与现状20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。
1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源3]。
1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1~获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。
1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。
Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。
此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。
虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。
因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。
最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5~独立的转化植株)。
2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11]a. 转基因抗虫水稻对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。
虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。
b. 转基因抗病水稻见抗水稻病毒研究c. 转基因抗旱水稻d. 转基因营养高效利用水稻e. 转基因优质水稻f. 转基因高产水稻g. 转基因抗除草剂水稻3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术基因工程上的广泛研究和应用[13~来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。
农杆菌转化原理及技术
❖ 抗性愈伤的分化
抗性苗的生根
❖
转基因植株田间种植
转化率、分化率和共转化率的计算
❖ 抗性愈伤获得率（%）=抗性克隆数/转化克隆数×100% ❖ 绿苗率（%）=再生克隆数/抗性克隆数×100%
谢谢
Bacterial T-plasmid produces receptors for acetosyringone
Plant wound produces acetosyringone
Produce callus transform callus stimulate shooting by cytokinin addition
blogsinacomcnwxppt农杆菌介导的水稻遗传转化原理及技术blogsinacomcnwxppt水稻遗传转化已成为水稻分子生物学研究和遗传改良的重要技术基础blogsinacomcnwxppt几种常用植物基因转化方法的比较转化方法农杆菌法peg法电击法微针注射法基因枪法花粉管通道法受体材料完整细胞原生质体原生质体原生质体完整细胞卵细胞宿主范围有性繁殖植物组培条件简单复杂复杂复杂简单操作复杂性简单简单复杂复杂复杂简单设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵便宜工作效率单子叶植物应用可行可行可行广泛广泛blogsinacomcnwxppt农杆菌介导法的优点操作简便外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝转移dna片段明确可转移大片段dna可直接用丌同的植物组织进行基因转移blogsinacomcnwxppt农杆菌介导遗传转化的原理blogsinacomcnwxppt农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌分为发根农杆菌导致毛状根的发生和根癌农杆菌导致冠瘿瘤冠瘿瘤细胞可产生正常细胞丌能产生的冠瘿碱
❖ 5.愈伤组织的筛选
❖ 将愈伤转移至选择培养基筛选抗性愈伤，每两周转 接1次。
the 农杆菌介导的水稻转化及bar 基因稳定遗传guide download
N6B1K1H50 N6 大量，MS 微量，B5维生素，6-BA 1 . 0 mg / L，KT 1 . 0 mg / L，NAA 0 . 2 mg / L，潮霉素 50 mg / L，蔗糖
30 g / L ，Agar 8g / L，pH 5 . 8
胡张华等：农杆菌介导的水稻转化及 bar 基因稳定遗传
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200µmol，Taq 酶 1 u；扩增反应 程 序：94℃ 5 min 后，进行 30 个循环（94℃ 1 min），55℃ 1 mi（n 扩增 bar 基因时为 61℃），72℃ 2 min；最 后是 72℃ 10 min 。反应完毕后，取 2 µl 终产 物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，观察照相。 1 .2 . 5 Southern 杂交分析 从 PCR 为阳性 的植株中随机选取转化株进行 Southern 杂交 分析。10 ～ 15 µg 总 DNA 经 XhoI 完全消化， 在 0 . 8% 的琼脂糖凝胶上电泳，用标准 Southern 印迹方法进行转移。以 bar 基因为探针， 采用随机引物方法标记探针。杂交与预杂交 均按 Sambrook 等［11］方法进行。 1 . 2 . 6 再生植株的 Basta 抗性鉴定 首先每 1 株选一片稻叶浸沾 0 . 25% Basta 溶液，1 周 后观察稻叶对 Basta 的反应，然后对供试水稻 全株 喷 施 0 . 25% Basta 溶 液，记 录 全 株 对 Basta 的抗性反应。 1.2.7 转基因植株的农艺性状考察 对部 分转基因株系及其对照的生长发育过程进行
表 1 水稻组织培养与遗传转化使用的培养基及其 成分 Table 1 Culture medium and their components used in tissue culture and genetic transformation of rice
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选
浙江大学硕士学位论文农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选姓名：刘朋娟申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：王政逸20050501本研究受国家自然科学基金项目３０２７０８６１资助单位代码：——究生学号：——硕士学位论文农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选论文评阅人：．郄鏖压潘废垡蒸友基答辩委员会主席：．郑康乐答辩委员会成员：奎蕉夔筮回盐国昌三遮逸论文答辩日期：摘要稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ）可以引起水稻上的重要病害一稻瘟病。
了解彪ｇｒｉｓｅａ的致病分子机理不仅对防治稻瘟病具有重要的意义，而且它作为一个理想的研究体系对了解其他植物病原真菌与寄主的相互作用也有重要的意义。
分离和鉴定稻瘟病菌的致病相关基因，是达到这一目标的关键所在。
ＢＮＡ插入突变是标记、分离功能基因的有效途径之一，ＡＴＭＴ是丝状真菌遗传转化的一个的新的技术，具有转化效率离、成本低，操作方便和重复性好多重优点。
我们在构建了二个含有潮霉素Ｂ磷酸转移酶基因双元载体的基础上，成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化，转化效率达每１０６个分生孢子＞３００个转化子，并得到了４０００多个转化子。
通过继代培养和ＰＣＲ检测，证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明，大约有２／３转化子的Ｔ－ＤＮＡ插入是单拷贝的。
用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性，发现一个致病缺陷突变体：Ａ１－４１２。
该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片，说明Ａ１．４１２突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。
进一步的表型分析，发现Ａ１，４１２突变体的产孢量显著下降，仅为野生菌株的７％，在疏水表面不能形成附着胞，部分分生孢子萌发的速度也略有延迟。
Ｓｏｕｔｈｃｍ杂交显示Ａ１－４１２基因组中Ｔ－ＤＮＡ插入是单拷贝的。
一种农杆菌介导的粳稻快速遗传转化方法[发明专利]
![一种农杆菌介导的粳稻快速遗传转化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/5c3aad4c5bcfa1c7aa00b52acfc789eb172d9ef9.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610154281.5(22)申请日 2016.03.17(71)申请人 海南波莲水稻基因科技有限公司地址 570125 海南省海口市紫荆路2-1号紫荆信息公寓26A(72)发明人 黄培劲 安保光 李亚梅 陈思兰 欧阳超 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限公司 11002代理人 王文君(51)Int.Cl.C12N 15/82(2006.01)A01H 4/00(2006.01)A01H 5/00(2006.01)(54)发明名称一种农杆菌介导的粳稻快速遗传转化方法(57)摘要本发明提供一种农杆菌介导的粳稻快速遗传转化方法，包括如下步骤：诱导、侵染、共培养、筛选、分化、生根。
本发明整个转化流程耗时约70d，相比常规转化缩短了3个多月，应用该转化方法得到的愈伤诱导率高于85％，平均抗性愈伤率69.71％，平均分化率84.58％，平均转化率约58％。
总的来说，该转基因方法不仅可以保证转基因效率，而且可操作性强，适于大批量粳稻转基因实验，为水稻基础研究节约了大量时间，同时降低了实验过程中的人力、物力和财力耗费。
权利要求书2页 说明书14页 附图3页CN 105755037 A 2016.07.13C N 105755037A1.一种农杆菌介导的粳稻快速遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织；2)侵染：将步骤1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于农杆菌悬浮液中侵染，之后晾干待用；3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，培养至愈伤组织表面出现菌体；4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到筛选培养基中进行抗性筛选，获得抗性愈伤组织；5)分化：将获得的抗性愈伤组织接种到分化培养基上培养至分化出幼苗；6)生根：将幼苗接种到生根培养基上生根，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株作为转化得到的粳稻植株；所涉培养基的具体配方如下：诱导培养基为NLD培养基，其为以NL培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸浓度为2-3mg/L、水解酪蛋白浓度为0.3-0.5g/L、脯氨酸浓度为1-2g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶浓度为3g/L，pH值为5.8的培养基；共培养基为NL-AS培养基，其为以NL培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸浓度为2-3mg/L、水解酪蛋白浓度为0.3-0.5g/L、蔗糖浓度为30g/L、葡萄糖浓度为10g/L、乙酰丁香酮浓度为100-200μM，pH值为5.2的培养基；筛选培养基为NLS培养基，其为以NL培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸浓度为2-3mg/L、水解酪蛋白浓度为0.6-1g/L、脯氨酸浓度为0.5-1.5g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶浓度为3g/L、头孢浓度为500mg/L、潮霉素浓度为50mg/L，pH值为5.8的培养基；分化培养基为MSRe培养基，其为以MS培养基为基本培养基，所含激动素浓度为1-2mg/ L、α-萘乙酸浓度为0.5-2mg/L、山梨醇浓度为20-40g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶浓度为3g/L，pH值为5.9的培养基；生根培养基为以1/2MS培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为20g/L、吲哚丁酸浓度为0.5mg/L、植物凝胶浓度为3g/L，pH值为5.8的培养基；所述NL培养基为有利于粳稻生长的基本培养基，其为以N6培养基的大量元素、N6培养基的微量元素、L3培养基的有机成分加上铁盐组成的基本培养基。
水稻细胞转化方法[发明专利]
![水稻细胞转化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/673271c57d1cfad6195f312b3169a4517623e55f.png)
(10)申请公布号 CN 102337294 A(43)申请公布日 2012.02.01C N 102337294 A*CN102337294A*(21)申请号 201110303588.4(22)申请日 2011.10.09C12N 15/82(2006.01)C12N 5/10(2006.01)A01H 4/00(2006.01)A01H 5/00(2006.01)(71)申请人先正达生物科技（中国）有限公司地址102206 北京市昌平区生命园路25号中关村生命科学园(72)发明人翟晨光 段永波 李浩 章旺根(74)专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人张文辉 罗天乐(54)发明名称水稻细胞转化方法(57)摘要本发明提供一种利用PMI 选择标记高效率地将外源基因导入水稻细胞的方法、所用的转化系统、以及利用该方法制备转基因水稻的方法。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 17 页序列表 13 页 附图 5 页1.一种将外源基因导入水稻日本晴品种的细胞的方法，包括下述步骤：(1)将成熟水稻谷粒去壳、灭菌后将胚分离出来；(2)取步骤(1)所得的分离的胚置于愈伤组织诱导培养基上在30℃暗培养2周以产生次生愈伤组织；(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带外源基因和磷酸甘露糖异构酶(PMI)标记基因的农杆菌接触20分钟；(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到共培养基上，23℃培养48小时；(5)将步骤(4)的愈伤组织置于恢复培养基上培养5天；(6)将步骤(5)的愈伤组织转移到含有蔗糖和甘露糖的选择培养基上，在30℃暗培养3周以获得出芽的愈伤组织；和(7)将出芽的愈伤组织转移到再生培养基中继续培养。
2.权利要求1的方法，进一步包括步骤：(8)在再生培养基中培养3周的愈伤组织转移至生根培养基中继续培养。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤3所述的与农杆菌接触是将所述愈伤组织浸泡在所述农杆菌的悬液中，所述农杆菌的悬液是在侵染当天将农杆菌以OD约0.05-0.25悬浮660包含如说明书表1所示成分的液体滤纸培养基中而制备的。
农杆菌介导的氮高效利用转基因水稻植株的获得
农杆菌介导的氮高效利用转基因水稻植株的获得作者：查中萍，万丙良，殷得所，等来源：《湖北农业科学》 2011年第24期查中萍，万丙良，殷得所，杜雪树，戚华雄（湖北省农业科学院粮食作物研究所，武汉４３００６４）摘要：将从深海硅藻中克隆的与氮具有高度亲和性的硝酸盐转运蛋白基因ＮＡＴ３通过农杆菌介导的遗传转化方法，转入水稻品种中花１１，在含３０ｍｇ／Ｌ Bａｓｔａ的选择培养基上筛选，获得４５６棵抗性植株，对ＮＡＴ３目标基因检测，获得３１３棵阳性植株，初步证明目标基因已整合到中花１１基因组中。
关键词：转基因水稻；硝酸盐转运蛋白；氮高效利用中图分类号：Ｓ５１１；Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）24－5247-03Transgenic High N Use Efficiency Rice Obtained by Agrobacterium tumefaciensＺＨＡＺｈｏｎｇ－ｐｉｎｇ，ＷＡＮＢｉｎｇ－ｌｉａｎｇ，ＹＩＮＤｅ－ｓｕｏ，ＤＵＸｕｅ－ｓｈｕ，ＱＩＨｕａ－ｘｉｏｎｇ（ＦｏｏｄＣｒｏｐｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＨｕｂｅｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＮＡＴ３ｇｅｎｅｃｏｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｈｉｇｈｎｉｔｒａｔｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇａｂｉｌｉｔｙｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓｗａｓｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｉｎｔｏｒｉｃｅ‘ｚｈｏｎｇｈｕａ１１’ ｖｉａＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．４５６ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｒｉｃｅｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｎｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈ３０ｍｇ／Ｌｂａｓｔａ．３１３ｐｏｓｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｇａｉｎｅｄｂｙＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｔａｒｇｅｔｉｎｇａｔＮＡＴ３ｇｅｎｅ．ＩｔｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔＮＡＴ３ｇｅｎｅｈａｄｂｅｅｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆ‘ｚｈｏｎｇｈｕａ１１’．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： transgenic ｒｉｃｅ；ｎｉｔｒａｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ；ｈｉｇｈＮｕｓｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ植物的生长需要合适的氮量，氮是限制植物生长的重要因素［１］。
用农杆菌介导外源基因转化水稻的方法[发明专利]
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专利名称：用农杆菌介导外源基因转化水稻的方法专利类型：发明专利
发明人：许东晖,李宝健
申请号：CN95119076.8
申请日：19951213
公开号：CN1135530A
公开日：
19961113
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种用农杆菌介导外源基因转化水稻的方法。
该方法是以诱导性信号分子
5，7，4′-三羟基-3′，5′-二甲氧基黄酮和5，4′-二羟基-3′，5′-二甲基-7-(β-D葡萄糖基)黄酮以及乙酰丁香酮诱导处理携带有外源基因重组质粒的农杆菌，再将其与水稻幼苗共培养，从而获得转基因水稻幼苗。
该方法简便而高效，瞬时转化率达50％以上。
本发明打破了农杆菌不能转化水稻等单子叶植物的传统观念，为培育优良水稻品种开辟了新的途径。
申请人：中山大学
地址：510275 广东省广州市新港西路
国籍：CN
代理机构：中山大学专利事务所
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农杆菌介导水稻快速转化Agrobacterium-mediated Rapid Transformation of Rice崔莹，蔡朝霞，林拥军，陈浩*作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉*通讯作者邮箱：hchen@引用格式：崔莹，蔡朝霞，林拥军，陈浩. (2018). 农杆菌介导水稻快速转化. Bio-101 e1010176. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010176.How to cite: Cui, Y., Cai, C. X., Lin, Y. J. and Chen, H. (2018). Agrobacterium-mediated rapid transformation of rice. Bio-101 e1010176. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010176. (in Chinese)实验原理：Toki等(2006)发现，水稻成熟胚在诱导愈伤1 d后可以被农杆菌侵染，诱导愈伤5 d后可以被高效转化。
Toki (1997)研究表明在32 °C、光照条件下，水稻愈伤组织可以快速分裂。
在该条件下进行筛选培养，14 d可以得到明显的抗性愈伤组织。
本实验的目的是在实验室已有的遗传转化方法基础上，参考Toki等(1997，2006)发表的部分实验参数，建立快速的水稻转化方法，以缩短遗传转化周期。
本实验在32 °C、光照条件下诱导愈伤，对诱导5 d的水稻愈伤组织进行侵染，随后在32 °C、光照条件下以潮霉素作为筛选剂进行筛选培养，14 d后获得了抗性愈伤组织，对抗性愈伤组织进行分化培养，获得稳定的转化植株。
从愈伤组织诱导到转化再生植株生根，整个实验周期约为50 d。
关键词：水稻成熟胚，农杆菌介导，快速转化材料与试剂1. 滤纸2. 水稻种子3. 75%酒精4. 吐温205. 农杆菌菌株EHA105 (携带含目的基因载体)6. 6-Benzylaminopurine (6-BA) (Sigma, catalog number: B-3408)7. Kinetin (KT) (Sigma, catalog number: K-0753)8. Naphthalene acetic acid (NAA) (Sigma, catalog number: N-0640)9. Indole-3-acetic acid (IAA) (Sigma, catalog number: I-2886)10. 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) (Sigma, catalog number: D-7299)11. Kanamycin (USB, catalog number: 17924)12. Casein Enzymatic Hydrolysate (CH) (Sigma, catalog number: N-4642)13. Carbenicillin (Cn) (Bio Basic INC. catalog number: CDJ469)14. Hygromycin B (Hn) (Roche, catalog number: 10843555001)15. Nicotinic acid (Sigma, catalog number: N-0765)16. Pyridoxine HCl (VB6) (Sigma, catalog number: P-8666)17. Thiamine HCl (VB1) (Sigma, catalog number: T-3902)18. Inositol (Sigma, catalog number: I-3011)19. Phytagel (Sigma, catalog number: P-8169)20. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma, catalog number: D-5879)21. Acetosringone (AS) (Aldrich chem., CO 01531 EG)22. Agar powder (日本分装，catalog number: BM0212)23. Glycine (日本分装，catalog number: BA0802)24. Proline (进口分装，catalog number: A1122)25. D-sorbitol (上海生工，catalog number: SB0491)26. NH4NO327. KH2PO428. KNO329. MgSO4·7H2O30. CaCl2∙2H2O31. MnSO4·4H2O32. ZnSO4·7H2O33. H3BO334. KI35. Na2MoO4·2H2O36. CoCl2·6H2O37. CuSO4·5H2O38. (NH4)2SO439. FeSO4∙7H2O40. Na2EDTA∙2H2O41. KOH42. HgCl243. Glucose44. Sucrose45. LB培养基46. 封口胶47. MS max储备液(10x) (见溶液配方)48. MS min储备液(100x) (见溶液配方)49. N6max储备液(10x) (见溶液配方)50. N6min储备液(100x) (见溶液配方)51. Fe2+-EDTA储备液(100x) (见溶液配方)52. Vitamin储备液(100x) (见溶液配方)53. 6-BA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)54. KT储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)55. 2, 4-D储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)56. IAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)57. NAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)58. 200 mM AS储备液(见溶液配方)59. 1 N KOH储备液(见溶液配方)60. 0.15% HgCl2 (见溶液配方)61. 50% 葡萄糖(见溶液配方)62. 250 mg/ml Cn (见溶液配方)63. 50 mg/ml Kan (见溶液配方)64. 诱导培养基(见溶液配方)65. 悬浮培养基(见溶液配方)66. 共培养基(见溶液配方)67. 筛选培养基(见溶液配方)68. 分化培养基(见溶液配方)69. 生根培养基(见溶液配方)仪器设备1. 超净台2. 酒精灯3. 镊子4. 平皿5. 三角瓶6. 生根管7. 摇床8.培养箱实验步骤1. 愈伤诱导选取成熟饱满的水稻种子，去壳；75%酒精消毒1~2 min，倒去酒精；用灭菌蒸馏水冲洗2次；加入0.15%的升汞(含有0.1%的吐温20)浸泡15~18 min，其间摇动数次；倒掉升汞，用灭菌蒸馏水冲洗5次。
将消过毒的种子接入诱导愈伤培养基(见溶液配方)，32 °C光照培养5~10 d (Toki, 1997; Toki等, 2006)。
2. 农杆菌划线活化在侵染的前2 d，取农杆菌在含50 mg/L kanamycin的LB培养基上划线，置于28 °C 培养。
3. 农杆菌的悬浮、侵染及共培养侵染前，将活化的农杆菌刮入悬浮培养基(见溶液配方) 中，28 °C，180 rpm震荡培养3~3.5 h，然后用悬浮培养基调节菌液浓度至OD600=0.1~0.2。
将诱导5~10 d 愈伤组织放入农杆菌悬浮液中，侵染1.5 min。
倒掉菌液，用灭菌滤纸吸干愈伤表面的菌液。
愈伤表面覆盖灭菌滤纸，超净台吹干30 min。
吹干后将愈伤转入表面覆盖有一层灭菌滤纸的共培养培养基(见溶液配方)，先20 °C暗培养过夜，然后转入25 °C培养箱继续暗培养2 d。
4. 清菌共培养完成后，将愈伤组织用镊子转移到空的灭菌容器(建议口比较大的玻璃瓶，便于操作) 中。
用灭菌蒸馏水反复清洗愈伤7~8次，其中前面3次可快速清洗，后面3~4次清洗时每次浸泡3-5 min。
最后用含有500 mg/L Cn的灭菌蒸馏水浸泡愈伤30 min。
倒掉Cn溶液，用灭菌滤纸尽量吸干愈伤表面的水分，愈伤表面覆盖一层灭菌滤纸，超净台吹干1 h。
5. 筛选将经过清菌后的愈伤摆放到筛选培养基上(见溶液配方)，32 °C，光照培养14 d。
6. 分化筛选14 d后，将抗性愈伤转入分化培养基(见溶液配方)，28 °C培养(光周期为14 h光照/10 h黑暗)。
7. 生根待抗性愈伤在分化培养基(见溶液配方) 上形成3~4 cm高的再生苗时，将其转入生根培养基(见溶液配方) 培养，至形成完整的植株。
实验结果成熟水稻种子接种到诱导培养基5-10 d后，有明显的愈伤组织形成(图1a、1b)；用农杆菌(含有潮霉素抗性基因hpt和gfp表达框架) 对愈伤组织进行侵染，共培养3 d后，将愈伤组织接种到含有50 mg/L潮霉素的筛选培养基上，14 d后可以观察到新生愈伤组织，用荧光体视显微镜进一步观察，新生愈伤组织产生明显的绿色荧光信号，说明g fp基因整合到了水稻基因组(图1c、1d)；将抗性愈伤组织接种到分化培养基，21 d左右有再生植株形成，用荧光体视显微镜进一步观察，转化再生植株有绿色荧光信号，说明gfp基因在转化再生植株中稳定表达(图1e、1f)。
采用本实验中的快速转化方法，可以在50 d左右获得转化再生植株，相比先前的转化方法(需要120 d左右) 遗传转化周期大大缩短。
图1. 农杆菌介导水稻快速转化。
a和b分别为诱导5 d和10 d的水稻愈伤组织；c 和d为筛选培养14 d形成的抗性愈伤组织；e和f为分化培养21 d形成的再生植株。
注意事项1. 本实验方法已在日本晴、中花11、稻花香、Dongjin等粳稻品种上获得验证，通过调整培养基也可以用于籼稻材料的遗传转化。
2. 愈伤组织的诱导时间因材料的基因型、种子的质量等而呈现差异，因此诱导愈伤组织后需要经常观察其生长状态，以确定合适的诱导时间。
3. 由于愈伤诱导时间短，一些染有内生菌的愈伤在侵染时不易被识别，导致同一批次侵染的愈伤全部污染。
因此首先要保证种子的质量，要求选用内生菌少且活力较高的种子。
4. 筛选过程也可以在封有透气封口膜的三角瓶中进行，以避免水汽凝结影响抗性愈伤组织生长。
5. 在清菌时，可以用镊子将愈伤组织与种子分开，以降低农杆菌污染的概率。
6. 抗性愈伤组织的筛选时间因材料而异，如果筛选时间超过14 d，则需要更换筛选培养基，以避免农杆菌污染。
7. 为避免分化过程中农杆菌污染，也可以在分化培养基中加入250 mg/L Cn。