植物基因的克隆与转化_3_转基因植物中报告基因的检测方法

科技知识讲座

植物基因的克隆与转化(3)

转基因植物中报告基因的检测方法

李成云　(云南省农业科学院生物技术研究所,昆明　650223)

检测转基因植物有许多方法。根据检测的基因功能来划分,可分为调控基因(包括启动子、终止子等)检测法、标记基因检测法及目的基因直接检测法。根据检测的不同阶段区分,有DNA检测法,RNA检测法及蛋白质检测法。DNA检测法只能检测到外源基因是否已经整合到植物基因组中,而后两种检测方法检测到的是外源基因是否能在受体植物中表达;根据RNA检测法得到的结果可判定外源基因是否转录,蛋白质检测法则可检测出外源基因是否翻译。还可根据检测所用的具体方法划分,有PCR检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法、S onth2 ern杂交法、Nouthern杂交法、Western杂交法及生物测定检测法等。但这些划分也并非是绝对的,如用PCR既可检测调控基因,也可检测标记基因和目的基因。其中较为常见及简便的方法是报告基因检测法,这些基因一般编码一个特殊的酶,这些酶所催化的反应很容易用普通的生化反应检测出来。而在正常的非转基因植物中,这些酶及其所催化的反应几乎完全不存在。目前常用的报告基因主要有卡那霉素抗性基因(NPT-Ⅱ),β-葡萄苷酶基因(G us),荧光素酶基因,胭脂碱和章鱼碱合成酶基因,氯霉素乙酰转移酶基因(Cat基因),除草剂抗性基因(Pat),二氢叶酸还原酶基因(DHFR)等。这些基因由于其检测简单方便,在大多数植物中背景小而得到广泛应用。本文对这些报告基因的检测原理及方法作一简要介绍。

NPT-Ⅱ基因的检测:抗卡那霉素基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPT-Ⅱ),是一个小分子量的酶(分子量为25000),它由转座子Tn5编码,催化许多氨基酸糖苷类的磷酸化反应,诸如新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等。这个反应将ATP的γ-磷酸基转到抗生素分子上,从而阻止了它们的靶位点———核糖体的相互作用,起到解毒作用。在转基因植物、动物和原核生物中, NPT-Ⅱ基因广泛地被作为选择标记,用来研究基因的表达及其调节。

在含蛋白酶抑制剂的缓冲液中研磨转化的植物材料,制取细胞的提取物。将提取物点在非变性的聚丙烯酰胺凝胶上以避免酶的不可逆变性。电泳后,将胶从胶槽中取出,放在反应缓冲液里平衡,然后在聚丙烯酰胺凝胶上面注入一层含卡那霉素和(γ-32P) ATP底物的琼脂糖固定。NPT-Ⅱ酶接触底物后,酶促反应在凝胶夹层中进行并得到具有放射性的磷酸卡那霉素。通过S outhern转移将磷酸化的卡那霉素转移到磷酸纤维素滤纸上。基本分子卡那霉素和磷酸卡那霉素可以结合在滤纸上,ATP则不能。经过洗涤除去背景的ATP。通过放射自显影显示出放射性的卡那霉素,从而确定在聚丙烯酰胺凝胶上哪些条带上的蛋白质具有NPT-Ⅱ的活性。进一步的定量分析可以将滤纸上反映出NPT-Ⅱ活性的条带切下用闪烁计数器进行测量。

G us基因的检测: E.coliβ-葡萄糖苷酸酶的编码序列已经发展成为转化植物的报告基因系统。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶。采用一些商业上提供的特种β-葡萄糖苷酸酶作为底物,其反应产物可用分光光

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度、荧光(灵敏度较分光光度检测法为高)和组织化学(该方法可观察到外源基因在特点器官、组织,甚至单个细胞内的表达情况,它催化的底物为X-gluc,产物为蓝色化合物)的方法检测。β-葡萄糖苷酸酶的基因已经被克隆和测序,并编码稳定的酶,这个酶具有令人满意的性质,可以用来进行嵌合基因的构建及分析,它提供的嵌合基因系统很容易得到好的质量和高的灵敏度。尤其在组织化学分析中应用这个标记基因,可以判定嵌合基因在不同细胞类型、器官和发育阶段的活性定位。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性,因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。

荧光素酶基因检测系统:荧光素酶基因是一种动物蛋白基因,目前研究较多的是荧光虫荧光素酶及细菌产生的荧光素酶。荧光素酶催化的底物是6-羟基喹啉类,在镁离子、ATP及氧的作用下酶使底物脱羧,生成激活态的氧化荧光素,发射光子后,转变为常态的氧化荧光素。由于这类酶的活性不需要转录后修饰,无二硫键,不需要辅酶因子和结合金属,因此几乎可以在任何宿主细胞中表达。荧光素酶基因作为一个报告基因还有一个优点,即检测的灵敏度高,检测迅速而且操作方便,对于研究低水平表达的基因有较大的意义。由于生物中普遍缺少内源荧光,因此该基因几乎不存在背景干扰问题。荧光素酶与反应底物混合后所产生的荧光持续数秒到数分钟即消失。检测需要闪烁计数器和荧光计。荧光素酶的可检测浓度在理想状况下少于10-20m ol/L。

胭脂碱和章鱼碱检测:冠瘿碱合成酶基因存在于农杆菌T i质粒或Ri质粒上,该基因与T i质粒的致瘤作用无关,故在构建载体时,有时将该基因保留作为报告基因使用。该基因的启动子是真核性的,在农杆菌中该基因并不表达,整合到植物染色体上后即行表达,编码与冠瘿碱合成有关的酶,催化冠瘿碱合成。目前已发现的催化冠瘿碱合成的酶主要有两种,一种是胭脂碱合成酶,另一种是章鱼碱合成酶。其检测原理是通过纸电泳分析筛选出存在胭脂碱和章鱼碱的转化植物材料。将植物材料直接挤压在电泳图谱纸上,进行电泳。在电场作用下,胭脂碱和章鱼碱可以同正常组织中含有的精氨酸分离开,用菲醌这一敏感的荧光染料进行染色,即可进行观察。

Cat基因(即氯霉素乙酰转移酶基因)的检测:氯霉素最早是从放线菌中分离出来的抗菌素,它能够选择性地与原核细胞50S 亚基或真核细胞线粒体核糖体大亚基结合,抑制蛋白质生物合成。Cat基因编码氯霉素乙酰转移酶,该酶催化乙酰C oA转向氯霉素形成乙酰化产物,乙酰化了的氯霉素不再具有氯霉素的活性,失去干扰蛋白质合作的作用。真核细胞不具有氯霉素乙酰转移酶基因,无该酶的内源性活性,因而Cat基因可以作为真核细胞转化的标记基因及报告基因,Cat基因转化的植物细胞能够产生对氯霉素的抗性,而非转基因植物则不具有这种抗性。Cat基因的活性可以通过反应底物乙酰C oA的减少或反应产物乙酰化氯霉素及还原型C oASH的生产来测定,目前常用的方法有硅胶G薄层层析法及DT NB分光光度计法。Cat基因不仅用来检测外源基因是否转化成功,而且在研究转化的外源基因在植物体内的表达调控中起重要作用,是目前研究基因表达调控最常用的报告基因之一。

Pat基因的检测:Pat基因为抗除草剂基因,它编码PPT乙酰转移酶(PAT)。PPT是一种谷氨酸结构类似物,能竞争地抑制植物体内谷氨酰胺合成酶(G S)的活性。当PPT 存在时,G S活性被抑制,细胞内NH+4积累,细胞中毒而死亡。PAT基因编码的PPT 乙酰转移酶可以催化乙酰基有乙酰C oA分子上转移到PPT分子的游离氨基上,使PPT 乙酰化,乙酰化了的PPT失去对G S的抑制

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