植物基因的克隆与转化_3_转基因植物中报告基因的检测方法
转基因植物的检测方法及其原理
转基因植物的检测方法及其原理说到转基因植物的检测方法，哎呀，别看它名字高大上，其实要搞清楚这些植物到底“基因里”藏了什么东西，可真不是一件容易的事儿！你想想，现在的科技这么发达，想查一个小小的基因变动，得靠一堆复杂的工具和技巧。
咱们生活中吃的很多食物，都可能是转基因的，然而那些转基因植物到底长啥样，它们和普通植物有啥区别，很多人其实还摸不着头脑。
今天咱们就来聊聊，转基因植物是怎么被“抓包”的。
首先得说，转基因植物其实就是经过基因工程改造过的植物，某些基因被“调皮地”加进去，目的是为了让这些植物有点特别的功能，比如抗虫、抗病，或者是让它们在干旱的环境下也能生长得好。
就像给植物做了个“基因升级版”，有点像人类做整容手术一样。
但这可不是随便改改就行的，它得在植物的DNA里留下“痕迹”，就像在你手机里安装了一个APP一样，有了它，植物就能干些别人做不到的事。
可问题是，转基因植物和普通植物怎么看上去差不多，不仔细看，还真分不出来。
就像是同一个班级里的两个人，外貌差不多，可其中一个却可能偷偷带了个高科技的手机。
所以呀，怎么知道一个植物是不是转基因的，得靠一堆高端的检测技术了。
现在，最常用的检测方法就是PCR（聚合酶链式反应）技术。
听着是不是挺复杂？其实也不难理解。
就像你拍照的时候，不管是景色还是人像，照片总是会有一定的“特征”对吧？PCR技术就相当于是放大镜，它能够把植物基因里的某些特征“放大”，让你看得清清楚楚。
科学家用PCR方法，把基因里那点儿“特殊”的转基因成分从大海捞针一样给找出来。
一旦找到了那些特定的基因序列，那就能证明，这个植物不单纯，里面有转基因。
但这个方法也有个小缺点。
它需要比较高精度的设备，检测过程比较费时，得小心翼翼地操作。
想象一下，就像你去餐厅吃饭，老板端上来的每道菜都需要经过精细的制作一样，检测转基因植物也得经历一番“精雕细琢”。
如果在操作过程中，稍有不慎，那结果可能就大不如前了。
除了PCR，还有一种叫做ELISA（酶联免疫吸附测定）的技术。
转基因植物的生产和检测方法
转基因植物的生产和检测方法转基因植物是繁殖用于人类消费的农作物，其基因被修改以抵御虫害和提高产量。
转基因的技术对世界的食品安全、环境保护和农业产量增加产生了重要的影响。
但是，随着转基因产品的不断推广和应用，对于检测其是否安全和透明的要求也越来越高。
本文将介绍转基因植物的生产和检测方法。
一、转基因植物的生产方法转基因植物的生产方法主要分为两种，一种是基因枪法，另一种是农杆菌介导的转基因法。
基因枪法是通过射入改造后的DNA 直接向植物细胞内导入外来基因，从而实现转基因植物的创建。
而农杆菌介导的转基因法则是通过把拥有外来基因的细菌注入植物细胞内，再将细菌注入特定的细胞壁，使得外来基因稳定地嵌入植物的基因组中。
当然，在此基础上，科学家还使用了一些远离传统种植法的技术，例如如基因编辑工具CRISPR-Cas9。
基于如此多样化的转基因生产方法，科学家们已经可以创造出各种不同类型的转基因植物。
二、转基因植物的检测方法转基因植物的检测方法主要包括了两类：一是用于提取DNA的样品，二是用于检测的样品。
在前人研究的基础上，当前有两种常见检测方法：PCR和ELISA。
PCR(聚合酶链反应)是目前主流的转基因检测技术，它能够根据材料提取的DNA进行基因片段扩增，从而检测模板所对应的基因是否存在。
PCR技术以灵敏度、特异性高、复查和修复能力强著称，不过，PCR技术存在可能会观察到错误反应的问题。
另外一个常见的检测技术是酶联免疫吸附法(ELISA)，它特别适用于筛查含水量较低的复合样品。
ELISA是一种抗体检测技术，它基于抗体结合了基因，在测试物接口中发生颜色反应，显示基因存在或不存在。
这种方法也常用于通过检测植物组织中蛋白质水平的方法来检测转基因。
总之，用于转基因检测的技术越来越精准和可靠，从而让我们可以安心地使用和消费转基因植物农作物。
同时，也可以使用这些技术来帮助农民更好地掌握农田信息，从而进一步提高农产品的营养价值和商品价值。
植物生物技术中的基因克隆与转基因技术
植物生物技术中的基因克隆与转基因技术植物生物技术是指通过对植物基因的研究与应用，利用一系列方法和技术手段对植物进行改良，以提高农作物产量和品质，增强植物的抗病虫害能力，改进植物的适应性和耐逆性等。
其中，基因克隆与转基因技术作为植物生物技术的重要组成部分，发挥着关键的作用。
一、基因克隆在植物生物技术中的应用基因克隆是指将感兴趣的基因从一个物种中分离并放大，然后把它们转移到另一个物种中。
在植物生物技术中，基因克隆广泛应用于植物基因组的研究、基因功能的分析、种质资源的保护和创新育种等方面。
首先，基因克隆为植物基因组的研究提供了基础。
通过基因克隆技术可以获得目标基因的DNA序列，进而揭示基因的结构、功能和调控机制，为植物的进化和发育研究提供重要的依据。
其次，基因克隆还可以用于基因功能的分析。
通过克隆目标基因，可以利用转基因技术将该基因在目标植物中表达或沉默，从而研究基因在植物生长、发育和抗逆性等方面的功能。
此外，基因克隆在植物种质资源的保护和创新育种中起着重要作用。
通过克隆具有重要性状的基因，可以将这些基因迅速转移到其他作物中，实现对作物品质和抗性的改良。
相反，对于具有抗性基因的植物种质资源，通过基因克隆技术可以更好地理解和保护这些珍贵资源。
二、转基因技术在植物生物技术中的应用转基因技术是指将来自不同种属的基因导入目标植物中，使其获得新的特征或功能。
转基因技术在植物生物技术中被广泛运用于提高农作物产量和抗病虫害能力、改善营养价值、增加对逆境的耐受性等方面。
首先，转基因技术可以提高农作物的产量和抗病虫害能力。
通过转基因技术，可以将抗病虫害基因导入农作物中，使其获得对特定病虫害的抗性。
同时，还可以通过增加产量相关的基因表达来提高农作物的产量，从而满足粮食安全的需求。
其次，通过转基因技术可以改善农作物的营养价值。
例如，将含有丰富营养物质的基因导入作物中，使其富含蛋白质、维生素和矿物质等，从而提高人类对食物的营养摄入，缓解全球营养不足问题。
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术植物遗传工程是指通过改变植物的遗传物质，以达到改良、改变或创新植物性状的目的。
其中基因克隆与转化技术是植物遗传工程中的关键技术之一。
基因克隆指的是通过将特定基因从一个生物体中分离并扩增形成DNA片段，使其能够在其他生物体中稳定表达。
转化技术则是将克隆的基因导入到目标植物体内，使其能够在植物表达并产生相应的功能。
一、基因克隆技术基因克隆技术是植物遗传工程中的关键环节。
首先需要从源生物体中分离出目标基因。
常用的方法有PCR扩增、限制酶切片段分离等。
通过PCR扩增技术，可以快速、高效地扩增目标基因，提供足够的DNA片段用于后续的克隆工作。
限制酶切片段分离则是利用特定的酶将目标基因从源DNA片段中切割出来。
接下来，克隆基因需要被插入到适当的载体中，常用的载体包括质粒和病毒等。
将基因插入载体后，需要通过转化技术将其导入目标植物体内。
二、转化技术转化技术是将克隆的基因导入到目标植物体内的关键步骤。
常见的转化技术主要有基因枪法、农杆菌介导法和化学法等。
基因枪法是通过将DNA微粒射入植物细胞，使基因得以导入的方法。
此方法简单、高效，对不同植物都适用，因此被广泛应用于植物遗传工程中。
农杆菌介导法则是利用农杆菌将目标基因导入植物细胞。
这种方法克服了基因枪法的一些限制，可以导入更长的DNA片段，但受适用植物种类的限制。
此外，化学法也是一种常用的转化技术，通过利用化学物质使植物细胞的细胞壁通透性增强，从而实现目标基因的导入。
三、应用前景与挑战基因克隆与转化技术在植物遗传工程中具有广阔的应用前景。
通过基因克隆和转化技术，可以实现对植物农艺性状的改良，提高植物的抗病虫害能力、耐逆性和产量，从而促进农业的可持续发展。
此外，利用基因克隆和转化技术还可以为植物生物制药、环境修复等领域提供解决方案。
然而，基因克隆与转化技术在应用过程中也面临一些挑战。
首先，对于目标基因的选择和定位仍然是一个复杂的问题。
基因转化方法与转基因植株鉴定全
图 3.18 转基因烟草中的 GUS 染色 fig3.18 GUS coloration of transformed tobacco
A
B
图 3.19 MxIrt1 基因在烟草原生质体中的瞬时表达 A. pBIrt-eGFP 在烟草原生质体中瞬时表达 B. pBGFP 在烟草原生质体中瞬时表达
•谢谢
程序与方法：①轰击微弹的制来自 ② 基因枪轰击参数 ③受体材料 ④ 轰击样品
优点： 受体材料来源广泛 靶受体类型广泛 缩短了转基因周期、转基因植株变异率低 及通常具有正常的育性 缺点： 转化效率不高 多拷贝插入 费用较高
• 基因枪（particle gun）又称微弹轰击法（microprojectile bombardment, particle bombardment, biolistic)。最早是由 Cornell大学研制的火药基因枪。1990年，美国杜邦公司 推出了商品基因枪PDS-1000系统。 • 基因枪的组成部分有：点火装置、发射装置、挡板、样 品室、真空系统组成。基因枪转化的基本步骤如下： DNA微弹的制备 DNA-微弹载体的制备 靶外植体准备 DNA微弹轰击 轰击后外植体的培养
技术特点： 转化拷贝数低 携带目的基因片段大 整合后外源基因结构变异小 操作简便等优点
该技术已成为转化成功最多的一种转化方法
• 基因枪法(particle gun) 又称微弹轰击法 (microprojectile bombardment或 particle bombardment) 。 该法借助高速运动的金属 粒子将附着于其表面的核酸 分子引入受体细胞，外源基 因进入受体细胞核后整合到 染色体组，然后通过组织培 养再生出完整个体(植株)。
RNA电泳
植物转基因方法及特点和转基因沉默现象
植物转基因方法及特点和转基因沉默现象
崔广荣
【期刊名称】《安徽科技学院学报》
【年(卷),期】2003(017)001
【摘要】本文概述和比较了植物转基因方法、特点和在转基因中出现的基因沉默现象及其机制.
【总页数】5页(P37-41)
【作者】崔广荣
【作者单位】安徽技术师范学院农学系,安徽,凤阳,233100
【正文语种】中文
【中图分类】Q943.2
【相关文献】
1.植物基因的克隆与转化（3）转基因植物中报告基因的检测方法 [J], 李成云
2.植物转基因沉默现象的发生机制 [J], 翟敏;魏华丽
3.转基因植物转录后基因沉默的特点、机理及应用 [J], 卢龙斗;常青;等
4.转基因植物成分检测方法及标准概述 [J], 刘岑杰;杨滴
5.转基因植物油中提取DNA的多种提取方法 [J], 邓家超
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植物转化及转基因的检测
复杂
复杂
简单
昂贵
昂贵
便宜
低
高
低
可行
广泛
广泛
Agrobacterium tumefaciens
Ti plasmid with the new gene
+
cell’s DNA
Agrobacterium
Plant cell
Transformation
The new gene
Tr2a0n20s/6g/20enic plant
Calli are placed in vacuum chamber, Helium pressure shot DNA into cells
Gene gun
vacuum chamber
Calli remain on the high osmotic media for 2020h2o0u/6r/s20 following shooting.
• 早衰
生长期缩短、早孕早穗等
• 对环境敏感
对水、肥、温度、光照敏感
Transformation is performed by gene gun meia prepare calli for transfomation
2020/6/20
福建省农业遗传工程重点实验室
DNA with desired gene and antibiotic resistance is coated onto the surface of gold particles.
借助标记基因和报告基因的快速筛选和纯合
抗生素抗性基因
新霉素磷酸转移酶基因（nptII）——Kanr，G418r
双氢叶酸脱氢酶基因 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)——hygr 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）——Cre
基因转化方法与转基因植株鉴定
Transferring genes into plant cells by cointegration using T-DNA，Ti plasmids，and agrobacterium
1 农杆菌感受态细胞的制备
（1）挑取农杆菌（EHA105）单菌落接种于2.0 ml YEB 培养液中，28℃培养过夜。 （2）取400µ l 菌液置于50ml YEB 液体培养基中，28℃， 220 rpm，培养5-6 hr，培养置OD600 达到0.3~ 0.5 。 （3）菌液倒入5.0ml 的离心管中，4℃，4000~5000 rpm 离心3 min。 （4）菌体悬浮于2ml 0.15M NaCl，10000 rpm 离心3 min。 （5）用1ml预冷的20mM CaCl2 轻轻悬浮，置于4℃， 24 hr内现用。
花粉管通道法是利用植物授粉后所形成的天然 的花粉管通道（ 又叫花粉管引导组织），经珠 心通道，将外源DNA 携带入胚囊，转化受精 卵或其前后的生殖细胞（ 精子、卵子），由于 它们仍处于未形成细胞壁的类似“ 原生质体” 状态，并且正在进行活跃的DNA 复制、分离 和重组，所以很容易将外源DNA 片段整合到 受体基因组中，以达到遗传转化之目的。
叶 盘 法 转 化 番 茄 体 系 的 优 化
乙酰丁香酮对转化率的影响
在侵染的菌液和筛选培养基中均加入了200μ M的乙酰 丁香酮，根据观察结果，加入乙酰丁香酮的外植体与 对照相比其分化情况没有明显差异，表明加入乙酰丁 香酮与否不能有效提高番茄突变体Chloronerva的转化 率。
适宜Kan浓度的筛选
A 突变体Chloronerva
B 转化植株
转基因番茄互补突变体Chloronerva表型
植物转化及转基因的检测
※从重组子中，提取DNA，进一步分析鉴定转化子。
表达载体构建
※将目的基因克隆到表达载体上，使之在新的遗传背景下实现功能表达。
植物基因工程的主要步骤
植物遗传转化
※ 用生物或物理方法将目的基因转入植物受体中
转基因植物的鉴定
※ 分子水平、个体水平、群体水平检测目的基因的遗传、表达及其稳定性
转基因作物的育种利用
从处于分蘖中期的供试转基因抗虫水稻植株上，随 机取三个粗壮分蘖剪取3-4cm长的叶片一片。将叶片 移置长玻璃管6.5cm×1.5cm）内经0.1g/l苯骈咪唑保 鲜液浸渍过的滤纸片上，每管分别接入5头刚孵化的蚁 螟，管口塞紧脱脂棉。自开始接虫后，第二、四、六、 八天分别考察或测定幼虫死亡率。期间向管内增添新 鲜的叶片。
对照
直链淀粉含量 %
9.7 10.9 9.6 9.9 9.2 9.3 9.6 10.4 8.9 8.9 10.8 9.2 12.8
比对照降幅 %
24.51 14.96 25.26 22.66 28.12 27.70 24.65 18.50 30.31 30.31 15.83 28.20
转基因株系的遗传分析及纯合
植物转化及转基因的检测
2021/4/8
福建省农业遗传工程重点实验室
基因工程的概念
利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种 生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工 合成的方法获取基因，然后经过一系列切割， 加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将 其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的 过程.
Calli are placed in vacuum chamber, Helium pressure shot DNA into cells
Gene gun
简述转基因动植物的检测鉴定方法
简述转基因动植物的检测鉴定方法
一、转基因检测鉴定方法
1、理化检测法
（1）流式细胞术：利用流式细胞术技术，检测转基因植物DNA 核酸的含量，即采用荧光染料标记的 DNA 膜，以流速技术，测定和对比转基因动植物与其他植物的 DNA 含量。
（2）蛋白质印迹：利用蛋白质印迹法，它可以对植物蛋白质分子进行快速和准确的检测，包括转基因植物中特异性抗性蛋白。
2、分子生物学技术
（1）PCR 技术：通过荧光定量 PCR 技术，可实现对单个核酸分子的高灵敏度检测，其是转基因植物检测的常用技术。
（2） Southern 胺基酸印迹：利用 Southern 胺基酸印迹法，检测基因的等位基因进行检测和分析，如同位素标记 PCR，可以有效鉴定和分析转基因植物种群中不同基因的表达量及突变情况。
3、其他技术
（1）生物分子识别：通过生物分子识别，可以有效地检测出转基因植物特有的 DNA 序列，从而对转基因植物进行鉴定。
（2）生物免疫技术：利用生物免疫技术，可以以免疫试剂盒的形式，对转基因植物进行快速检测，从而达到鉴定的目的。
- 1 -。
检测转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子生物学技术检测转基因烟草植株中目标基因的整合和表达情况，验证转基因植株的遗传稳定性，为后续的转基因烟草的研究和应用提供科学依据。
二、实验材料1. 转基因烟草植株：含有目标基因的烟草再生植株。
2. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA分子量标准、限制性内切酶、连接酶、T载体、感受态细胞、质粒提取试剂盒等。
3. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、离心机、电泳仪、显微镜等。
三、实验方法1. DNA提取- 将转基因烟草植株的叶片剪成小块，使用DNA提取试剂盒提取总DNA。
2. PCR扩增- 设计特异性引物，针对目标基因进行PCR扩增。
- 将提取的DNA作为模板，进行PCR扩增。
3. 电泳检测- 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带。
4. 测序验证- 对扩增的特异性条带进行测序，验证其序列与目标基因的一致性。
5. Southern blot检测- 使用限制性内切酶酶切转基因烟草植株DNA和野生型烟草DNA。
- 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上。
- 使用放射性同位素标记的目标基因探针进行杂交。
- 显影后观察杂交信号。
6. Northern blot检测- 提取转基因烟草植株RNA，进行反转录PCR，扩增目标基因mRNA。
- 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上。
- 使用放射性同位素标记的目标基因探针进行杂交。
- 显影后观察杂交信号。
四、实验结果1. PCR扩增- 转基因烟草植株DNA的PCR产物在预期位置出现特异性条带，而野生型烟草DNA没有扩增产物。
2. 测序验证- 测序结果显示，扩增产物序列与目标基因序列一致。
3. Southern blot检测- 转基因烟草植株DNA的酶切产物与探针杂交后，在预期位置出现杂交信号，而野生型烟草DNA没有杂交信号。
4. Northern blot检测- 转基因烟草植株RNA的RT-PCR产物与探针杂交后，在预期位置出现杂交信号，而野生型烟草RNA没有杂交信号。
植物基因转化与转基因植株鉴定
3. 目标基因 PCR 扩增 采用 PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 高保真酶从玉米 cDNA 中扩增 ZmMKK4 全长编码序列（GenBank 序列号：NM_001158890.1）。 ZmMKK4 扩增引物：F-ZmMKK4，R-ZmMKK4。 25μL 反应体系为：5 μL 5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+ Plus)，2 μL dNTP Mixture (各 2.5 mM)，1μL 上游引物（5μM），1μL 下游引物（5μM），1 μL cDNA，0.25 μL PrimeSTARTM HS DNA Polymerase，加 ddH20 至 25μL。PCR 扩增程序为 98C 98C 58C 72C 72C 1～3 min 10 s 15 s 1.5 min 10 min
图 1 外源基因转化流程图
三、实验目的和实验要求 目的： 学习和掌握从基因分离克隆到植株转化及转基因植株的筛选整个实验 体系。 要求： 综合利用前面的单个实验环节所掌握的知识， 获得完整的实验理念， 并在实验过程中学会设计、构建适合的载体并将外源基因转化植株。 四、实验材料和方法 （一）实验仪器 PCR 仪， 凝胶成像系统， 台式高速离心机， 台式高速冷冻离心机， DU 640 紫 外分光光度计，UV-2450 分光光度计，精密 pH 计，微量移液器，控温摇床，电 子天平，制冰机，-80C 超低温冰箱，电热恒温水浴锅，自动电热压力蒸汽灭菌 器，超净工作台，光照培养箱等 （二）试剂及配方 Trizol试剂，RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit，DNase I，2× PCR Master Mix，FastDigest 限制性内切酶，T4 DNA Ligase，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 高保真酶， pEASY-Blunt C， 质粒提取试剂盒 （E.Z.N.A. Gel Extraction Kit） ， 凝胶回收试剂盒 （E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I） ， DNA提取试剂盒， Kanamycin （Kan） ，Ampicillin（Amp） ，Carbenicillin（Cb） ，电泳缓冲液，LB培养基、YEB 培养基，烟草培养基如下表1.
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定金万枚 巩振辉 李桂荣 张桂华(西北农业大学 陕西杨陵 712100)提 要 对现有主要植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定进行了比较分析,并对它们在植物遗传转化中的前景进行了展望。
关键词 植物;遗传转化方法;转基因植株;转基因植株鉴定 人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变异来创造新物种和新品种。
但常常存在着杂交不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在诱变的非定向性。
采用遗传转化技术,将所要求的外源目的基因导入受体植株,并通过对转化植株的鉴定选择,从而创造出人类所需要的新品种或新物种。
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定是植物遗传转化的重要环节。
关*国家自然科学基金资助,项目编号39770522。
优质小麦品质的决定性因素;其次要有较强的生活力,保证营养生长健壮。
3.3.2 播种 研究表明,适当晚播和增加密度能在稳定产量的基础上提高小麦品质。
根据我省实际,关中优质专用小麦播量应控制在每亩6～8kg,渭北应控制在9kg。
播期可依据实际情况较当地常规适播期推迟2～3d。
提倡机械以精量半精量播种。
3.4 灌水灌水对小麦品质的影响比较复杂,尤以抽穗至成熟期间影响最大,此期灌水会降低蛋白质含量,对沉淀值等加工品质也不利,但如果氮量充足或灌水与施氮结合则蛋白质含量不下降或下降很慢。
因而施肥上的前氮后移也为后期合理灌水提供了条件。
中国农业大学曾研究出一套节水高产栽培技术,小麦春季可只灌一次,并将灌水时期移至孕穗期;若特别干旱,可在拔节期和开花期分别灌水。
这种灌水制度与前氮后移的施肥方法配合起来,有利于优质专用小麦生产。
3.5 地膜覆盖地膜覆盖栽培能使小麦产量大幅度提高,对品质的影响这方面研究还较少。
陕西省农科院小麦中心的初步研究表明,小麦覆膜后籽粒容重有不同程度提高;蛋白质含量与正常露地播种没有差异;覆膜不影响不同生态类型品种的干、湿面筋值和沉淀值;但不同生态类型品种之间籽粒容重、蛋白质含量、干、湿面筋值和沉淀值存在较大差异。
实验-转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测
本实验材料中使用的转基因载体的部分图谱
克隆拟南芥中的AK12基因的启动子，插入到 PBI101载体GUS基因上游的克隆位点（具体图 示如下）
农杆菌转化
转化拟南芥
AK12- pro RB 35S-pro NPT П NOS-ter
GUS
NOS-ter LB
pBI101
本实验基本流程
拟南芥AK12-pro 种子萌发，长成幼苗
• 组织化学法检测：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷 酸酯（X-Gluc）作为反应底物。将被检材料用含有 底物的缓冲液浸泡，若组织细胞被转入了GUS基 因，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将 X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧 化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的 部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到 ，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性 。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、 组织，甚至单个细胞内的表达情况。
实验七、转基因植物中报告基因 GUS组织化学定位检测
原理
➢ GUS基因就是β-葡糖醛酸酶基因 ，它存在于E.coli 等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡 萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物 质为底物，其分解产物呈蓝色。
➢ 由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景 活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究 中。根据gus基因检测所用的底物不同，可以选择三 种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法 （灵感度为分光光度检测法最高），其中最为常用 的是组织化学法。
取幼苗 组织化学检测 -- GUS检测
报告基因GUS的表达的检测
➢ 材料：拟南芥AK12-pro ➢ 试剂：
GUS工作液：在450mlddH2O中加入82mg铁氰化钾，105.6mg亚 铁氰化钾，50ml 1mol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0），加水至500ml， 4℃储存备用。1mol/LGUS染色液：用DMSO溶解100mg X-Gluc， 再加入GUS工作液，定容至100ml，分装成小管，置于-20℃储存备 用。
植物外源基因转化方法及转化子的检测
3.3 DNA直接导入基因转化
所谓DNA直接导入转化就是不依赖农杆 菌载体和其他生物媒体，将特殊处理的 裸露的DNA直接导入植物细胞，实现基 因转化的技术。常用的DNA直接转化技 术根据其原理可分为化学法和物理法两 大类。
3.3.1化学诱导DNA直接转化
化学诱导DNA直接转化是以原生质体为 受体，借助于特定的化学物诱导DNA直 接导入植物细胞的方法。目前主要有2种 方法：PEG介导法和脂质体介导法。
化学诱导DNA直接转化
物理法诱导DNA直接转化 花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法）
3.1农杆菌介导法
农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方 法。
它是利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti (Tumer induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植 物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并 插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转 化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可 使外源基因整合到受体染色体而获得稳定的表达。
植物敏感细胞和土壤农杆菌相互作用 土壤农杆菌的毒性区基因被激活 T-DNA的切割和T复合物生成 T复合物由土壤农杆菌经植物细胞膜进入
植物细胞 T-DNA整合到植物染色体上
农杆菌的 活化
挑单克隆
收集细胞
用液体MS培 养基重悬细 胞
将预培养的 外植体放 入菌液中 侵染
取出外植体在
➢脂质体介导基因转化
脂质体法是用脂类化学包裹DNA成球体，通过植物原生质 体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。
脂质体是由磷脂组成的膜状结构,用它包装外源DNA分子, 然后与植物原生质体共保温,于是脂质体与原生质体膜结构 之间发生相互作用,而后通过细胞的内吞作用而将外源DNA 导入植物的原生质体
植物基因的克隆实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习植物基因克隆的基本原理和操作步骤，掌握PCR扩增、酶切、连接、转化等基因克隆技术，并验证克隆基因的正确性。
二、实验原理植物基因克隆是通过PCR扩增目的基因片段，然后将其插入到载体中，构建重组质粒，再通过转化宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子。
本实验采用PCR扩增目的基因片段，再通过酶切、连接等步骤将其插入到载体中。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：- 植物DNA模板- 引物- 载体DNA- 宿主细胞（如大肠杆菌）- 转化试剂（如CaCl2）2. 实验试剂：- DNA聚合酶- 限制性内切酶- DNA连接酶- T4 DNA连接酶缓冲液- DNA分子量标准- 水浴加热器- PCR仪- 电泳仪- 显微镜四、实验步骤1. PCR扩增目的基因片段- 配制PCR反应体系，包括DNA模板、引物、DNA聚合酶等。
- 将PCR反应体系置于PCR仪中，进行PCR扩增。
- PCR扩增完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2. 酶切和连接- 将PCR扩增产物和载体DNA进行酶切，酶切位点应与目的基因片段的上下游序列相匹配。
- 将酶切后的目的基因片段和载体连接，加入DNA连接酶和连接缓冲液。
- 将连接产物置于水浴加热器中，进行连接反应。
3. 转化宿主细胞- 将连接产物与宿主细胞混合，加入转化试剂（如CaCl2）。
- 将混合物置于冰浴中，使细胞吸收连接产物。
- 在适当的温度下，将细胞培养一段时间，使其吸收连接产物并表达目的基因。
4. 筛选转化子- 将转化后的细胞涂布于含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转化子。
- 将转化子进行PCR扩增，检测目的基因的存在。
5. 验证克隆基因的正确性- 将PCR扩增产物进行测序，与预期序列进行比对，验证克隆基因的正确性。
五、实验结果与分析1. PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，目的基因片段大小与预期相符。
2. 酶切和连接产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，目的基因片段与载体连接成功。
植物抗病基因的克隆与鉴定
植物抗病基因的克隆与鉴定植物病害是世界各地农民和园艺爱好者所面临的一个普遍问题。
为了保护农作物和花卉的健康，植物学家和遗传学家们一直在致力于研究植物抗病基因的克隆和鉴定。
抗病基因的发现与研究为了确定植物中的抗病基因，研究人员首先需要从这些植物中分离出基因。
基于现代分子生物学技术，研究人员能够对基因进行克隆和鉴定。
最近，科学家们在研究拟南芥的抗黑线病基因时取得了一定的进展。
研究表明，该抗病基因能够依靠其基因编码产物来刺激植物的免疫反应，从而保护植物不受病原体的伤害。
抗病基因的克隆与鉴定抗病基因的克隆过程通常包括两个步骤：DNA文库构建和筛选。
DNA文库是指植物细胞中所有基因序列的集合。
文库中的DNA通常是通过群体DNA提取方法或单细胞PCR方法获得的。
研究人员将DNA文库插入DNA载体中，构建出含有全部植物基因序列的基因文库。
接下来，研究人员需要验证一些基因是否为抗病基因。
通常这种工作是通过功能鉴定进行的。
功能鉴定的方法有很多种，包括转基因技术、基因敲除技术、基因启动子分析和蛋白质互作鉴定等。
利用这些技术，研究人员可以确定哪些基因与植物的免疫反应有关联。
抗病基因的功能分析与利用基因鉴定后，研究人员通常会进行功能分析和利用。
其中一种方法是通过转移、喷雾或浸泡等方式利用基因工程技术将抗病基因转接到植物中去。
这个过程通常称为转基因。
转基因作物被引入后，它们就能够抵御一系列的病原体，从而提高农民的产量和收益。
此外，研究人员还在寻找其他类型的抗病基因。
研究表明，一些植物物种的抗病基因和人类免疫系统中的基因有些相似之处。
这可能意味着这些植物基因能够为人类的免疫系统研究提供思路。
未来，研究人员将继续利用分子生物学和基因工程技术去寻找新型抗病基因，从而保护我们的农业和花卉生产。
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定1. 引言植物基因转化是一种重要的生物工程技术，利用这种技术可以引入外源基因或修改内源基因，从而改变植物的性状和功能。
转基因植物是通过植物基因转化技术获得的具有外源基因的植物，具有重要的应用价值。
本文将介绍植物基因转化的基本原理和方法，并探讨转基因植物的分析与鉴定方法。
2. 植物基因转化的基本原理和方法2.1 基本原理植物基因转化利用穿透细胞壁的技术，将外源DNA导入植物细胞，通过细胞的内源机制使其稳定地表达。
常用的植物基因转化方法包括农杆菌介导的转化、生物弹射法和基因枪法等。
2.2 基本方法2.2.1 农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化是最常用的植物基因转化方法之一。
基本步骤包括构建表达载体、感受剂的处理和遗传转化的选择和鉴定。
构建表达载体时，将目标基因插入适当的载体上，并添加转录和翻译的调控序列，如启动子和终止子，以确保目标基因的表达。
感受剂的处理是将表达载体导入农杆菌中，并通过培养条件的优化，使农杆菌中的表达载体得到高效表达。
遗传转化的选择和鉴定是将感受剂经过适当的处理后，转化到植物细胞中，并通过筛选和鉴定来确定转化成功的细胞株。
2.2.2 生物弹射法生物弹射法是将DNA以高速撞击植物细胞，使其穿透细胞的质壁和细胞膜，进而将外源基因导入细胞内。
生物弹射法通常使用微粒子加速器或毛发管射击法进行。
微粒子加速器是一种将金属微粒或微球与外源DNA一起加速，并将其发射到目标细胞上的设备。
通过微粒的高速撞击，外源基因能够穿透细胞的质壁和细胞膜。
毛发管射击法是将DNA包裹在微小的金属颗粒上，然后使用高压气体将金属颗粒射击到目标细胞上。
这种方法也能够使外源基因穿透细胞膜进入细胞。
2.2.3 基因枪法基因枪法是将外源DNA包裹在金粒或微米级金属颗粒上，并使用高压气体或炮发射器将其穿过细胞质，进入植物细胞。
基因枪法不需要依赖转化菌或细胞融合等辅助手段，直接将外源DNA送入目标细胞，因此具有较高的成功率。
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定〖实验目的〗1．了解创建烟草突变体库的方法；2．理解每种方法的基本原理；3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程..〖实验原理〗随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成;在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一..植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容;在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究..在创制突变体的策略上;传统方法是使用物理或化学诱变方法获得;其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体..与传统的物理和化学诱变方法相比;生物诱变T-DNA和转座子插人诱变通常可标记突变基因;从而较为容易地分离鉴定靶基因..最近数年;通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一..烟草是植物基因组研究的一种模式植物;其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容;其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能..突变体的创制是遗传学研究的基础;也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径..通过诱导培养;使烟草产生愈伤组织;利用土壤农杆菌感染愈伤组织;实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人;利用植物细胞的全能性;经过抗性筛选;诱导分化;从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株;获得各突变体的纯合材料;从而建立烟草突变体的数据库;然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系;存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列;用其作探针筛选基因文库;获取目标基因或克隆;再进行下一步的分析图实验4-1..T-DNA 载体构建转化植物T1;T-DNA杂合子收获T2种子筛选T2;获突变子;应为3:1分离确定T-DNA与突变型共分离的个体产生纯合后代克隆T-DNA两侧的植物DNATail PCR利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因基因功能的验证遗传互补测验;分离的野生基因转化突变体;回复功能图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物;Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物AD;Tm值44-46℃组合;以突变体基因组DNA为模板;进行多次PCR反应;采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法;最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段实验图4-2;可作为探针;筛选分离基因.. TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景;同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段;与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点;已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用..实验图4-2 TAIL-PCR反应流程图本实验用含T-DNA载体质粒pCAMBIA1301的LBA4404农杆菌菌株转染烟草愈伤组织;让T-DNA随机插入烟草的基因组中形成T-DNA突变体;通过PCR特异扩增HPT基因片段来鉴定转基因烟草; 以TAIL-PCR法获得转基因烟草突变体的侧翼基因片段;测序后将获得侧翼基因片段的序列与GeneBank中的已知序列对比;获得功能基因的全序列..〖仪器、材料和试剂〗一仪器高速冷冻离心机;PCR仪;超净工作台;恒温摇床;隔水式恒温培养箱;光照培养箱;紫外可见分光光度计;凝胶成象仪或Dark Reader;恒温水浴锅;微孔加热器;电泳仪;水平板电泳槽;天平;酸度计;旋涡混合器..二材料烟草幼苗;含T-DNA载体质粒pMD83rc的LBA4404农杆菌菌株;Ex-taq DNA 聚合酶;DNA 1kb laddeer;GoldView核酸染料..三试剂1. 2×CTAB提取液100mmol/L Tris-HCl pH8.02％w/vCTAB1.4mol/L NaCl40mmol/L b-巯基乙醇20mmol/L EDTA2. TE缓冲液10mmol/L Tris-HCl pH8.01mmol/L EDTA3. 50′TAE电极缓冲液 1000mlTris 54g硼酸 27.5g0.5mol/L EDTA 20ml4. 10％次氯酸钠5. 氯仿：异戊醇V:V;24：16. 70％乙醇7. 溶液I：50 mmol/L葡萄糖;25 mmol/L Tris.HClpH8.0;10 mmol/L EDTApH8.0100ml8. 溶液III：60ml 5mol/L乙酸钾;11.5ml 11.5％冰乙酸;28.5ml无菌水100ml9. 溶液II：分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液各30ml;用时1:1混合10. LB 液体培养基配制每升培养基;应在950mL 去离子水中加入：胰蛋白胨bacto-typtone 10g酵母提取物bacto-yeast extract 5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解;加入200uL 5mol/L NaOH 调节pH 至7.0;加入去离子水至总体积为1升;121℃高压灭菌20分钟..11. MS 基本培养基大量元素 mg/L 微量元素 mg/L 有机营养 mg/LNH 4NO 3 1650 KI 0.83 甘氨酸2.0KNO 3 1900 H 3BO 3 6.2 烟酸0.5CaCl 2·2H 2O 440 MnSO 4·4H 2O 22.3 盐酸吡哆醇Vb 6 0.5MgSO 4·7H 2O 370 ZnSO 4·7H 2O 8.6 盐酸硫胺素Vb 1 0.lKH 2PO 4 170 NaMoO 4·2H 2O 0.25 肌醇100CoCl2·6H2O 0.025CuSO4·5H2O 0.025FeSO4·7H2O 27.8配制方法母液：大量元素50× 400mL硝酸铵 33g；硝酸钾 38g；磷酸二氢钾 3.4g；七水合硫酸镁 7.4g；铁元素100× 200mL七水合硫酸亚铁 0.556g；七水合EDTA二钠 0.746g；有机营养100× 200mLGly 0.040g；VB1 0.002g；VB6 0.010g；肌醇 2g；烟酸 0.010g；微量元素1000× 200mL碘化钾 166mg；硼酸 1240mg；一水合硫酸锰 3380mg；七水合硫酸锌1720mg；二水合钼酸钠 44mg；五水合硫酸铜 5mg；六水合氯化钴 5mg；氯化钙50× 400mL 氯化钙8.8g12. 愈伤组织诱导与分化培养基：MS基本培养基＋ 0.2mg/L 6-BA＋0.02mg/L NAA ＋ 3%蔗糖＋ 0.6%琼脂其中6-BA 取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL；NAA取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL；2;4-D取50mg用少量1M NaOH溶解后定容到100mL；以上激素母液均为0.5mg/mL13. 筛选培养基：MS基本培养基＋0.2mg/L 6-BA ＋ 0.02mg/L NAA＋3%蔗糖＋0.6%琼脂＋100mg/L羧苄青霉素14. 抗生素母液的配制KANA50mg/mL 1g KANA溶于20mL蒸馏水；RIF50mg/mL 0.25g RIF溶于少量乙醇再定容至50mL；STR30mg/mL 0.6g STA溶于20mL蒸馏水；羧苄青霉素100mg/mL 2g羧苄青霉素溶于20mL蒸馏水..潮霉素B50mg/mL 可以直接购买〖实验步骤〗I 烟草外植体的无菌培养和诱导再生1. 烟草叶片预培养：取烟草完全展开的幼叶;用自来水洗净晾干..在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒;然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟消除外植体表面的微生物..无菌水至少洗涤3次消毒液对外植体有很大伤害;必须清洗干净;每次停留3～5min..将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘..2. 烟草叶片的诱导再生：自行设计MS培养基中的NAA、6-BA植物激素浓度;诱导烟草叶片生根或生芽；将上述处理过的无菌叶片接种在含有不同浓度植物激素的MS固体培养基中;每周定期观察并更换培养基..II 转基因烟草的培养1. 农杆菌的培养：将含T-DNA载体的农杆菌单菌落接种到20ml LB液体培养基中Kana 50ug/ml、RIF、STR; 27℃;180r／min振摇培养过夜..将2ml菌液转入20ml LB液体培养基中;与上述的相同条件培养6小时左右;使菌液达到OD＝0.2～0.5;用来侵染烟草叶片 ..6002. 烟草叶片预培养：取烟草完全展开的幼叶;用自来水洗净晾干..在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒;然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟消除外植体表面的微生物..无菌水至少洗涤3次消毒液对外植体有很大伤害;必须清洗干净;每次停留3～5min..将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘..3. 愈伤组织转化：在80r/min摇床上旋转浸染5～10分钟..将叶外植体置于无菌滤纸上吸去多余的菌液如果叶片粘附细菌过多;可以在无菌水中漂洗1～2次..4. 共培养：将侵染过菌液的叶片接种在MS愈伤组织诱导和分化培养基上;在26℃黑暗条件下共培养3天..5. 筛选培养与分化：将共培养处理的烟草叶片转移到凝固后的筛选培养基上100ug/L羧苄青霉素和50ug/L潮霉素B;羧苄青霉素起到抑制农杆菌生长的作用..如果农杆菌生长未被抑制;农杆菌将抑制叶外植体的生长..每隔3～4天继代一次;培养条件为;光照2000lx;温度26℃;日照16h..4周后转基因细胞分裂生长形成大量愈伤组织并有根、芽分化..接种烟草叶片于无激素的MS培养基上培养;培养条件同上;同时作为对照实验无愈伤组织生长和器官分化..Ⅲ转基因烟草的检测1. 剪取培养后的转化烟草和前期实验未转基因烟草叶片小片;液氮中研磨至粉末状;加入0.5mL65℃预热CATB抽提液65℃水浴抽提30min;间歇混匀；2. 取上清各加入0.5mL氯仿异戊醇体积比24:1去除蛋白;12000rpm离心10min；3. 取上清加入1体积预冷异丙醇至-20℃出沉淀30～60min;8000rpm离心15min；4. 弃上清;70%乙醇洗涤2次干燥;避光保存；5. 加入15μL蒸馏水溶解并电泳检测0.7%琼脂糖凝胶电泳；6. 提取pMDC83rc质粒：13-5ml过夜菌12000rpm离心1min;弃上清；2加300μL预冷溶液I;颠倒混匀6-8次；3加300μl新鲜不预冷溶液II;颠倒混匀6-8次；4加300μl预冷溶液III;颠倒混匀6-8次；512000 rpm 15min;转移上清液；6加入0.5倍体积的异丙醇;混匀;室温放置3min;如上离心12min；7弃上清;70%乙醇洗沉淀；8空气干燥;20ml 蒸馏水溶解;-20℃贮存..7. 对提出的基因组DNA进行PCR扩增；引物和扩增体系同上述的PCR步骤；GFP引物GFP-F: 5’- GCGGCGATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’;GFP-R: 5’-TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTG-3’1在0.2mlPCR管中;按照下表配制PCR反应体系25μL..2按如下程序对转基因烟草、未转基因烟草和阳性质粒进行PCR扩增..8. 琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物9. 配制1%琼脂糖凝胶; PCR产物10μL上样;同时用2μL DNA Marker作为DNA相对分子质量标准..恒压120V电泳20min..在凝胶成像系统下察看结果T-DNA载体质粒含有绿色荧光蛋白GFP基因;扩增产物为GFP 基因的片段;长735bp..10. 剪取相同株烟草小叶片放在紫外灯和荧光显微镜下观察;是否产生绿色荧光..。
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科技知识讲座植物基因的克隆与转化(3)转基因植物中报告基因的检测方法李成云 (云南省农业科学院生物技术研究所,昆明 650223) 检测转基因植物有许多方法。
根据检测的基因功能来划分,可分为调控基因(包括启动子、终止子等)检测法、标记基因检测法及目的基因直接检测法。
根据检测的不同阶段区分,有DNA检测法,RNA检测法及蛋白质检测法。
DNA检测法只能检测到外源基因是否已经整合到植物基因组中,而后两种检测方法检测到的是外源基因是否能在受体植物中表达;根据RNA检测法得到的结果可判定外源基因是否转录,蛋白质检测法则可检测出外源基因是否翻译。
还可根据检测所用的具体方法划分,有PCR检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法、S onth2 ern杂交法、Nouthern杂交法、Western杂交法及生物测定检测法等。
但这些划分也并非是绝对的,如用PCR既可检测调控基因,也可检测标记基因和目的基因。
其中较为常见及简便的方法是报告基因检测法,这些基因一般编码一个特殊的酶,这些酶所催化的反应很容易用普通的生化反应检测出来。
而在正常的非转基因植物中,这些酶及其所催化的反应几乎完全不存在。
目前常用的报告基因主要有卡那霉素抗性基因(NPT-Ⅱ),β-葡萄苷酶基因(G us),荧光素酶基因,胭脂碱和章鱼碱合成酶基因,氯霉素乙酰转移酶基因(Cat基因),除草剂抗性基因(Pat),二氢叶酸还原酶基因(DHFR)等。
这些基因由于其检测简单方便,在大多数植物中背景小而得到广泛应用。
本文对这些报告基因的检测原理及方法作一简要介绍。
NPT-Ⅱ基因的检测:抗卡那霉素基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPT-Ⅱ),是一个小分子量的酶(分子量为25000),它由转座子Tn5编码,催化许多氨基酸糖苷类的磷酸化反应,诸如新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等。
这个反应将ATP的γ-磷酸基转到抗生素分子上,从而阻止了它们的靶位点———核糖体的相互作用,起到解毒作用。
在转基因植物、动物和原核生物中, NPT-Ⅱ基因广泛地被作为选择标记,用来研究基因的表达及其调节。
在含蛋白酶抑制剂的缓冲液中研磨转化的植物材料,制取细胞的提取物。
将提取物点在非变性的聚丙烯酰胺凝胶上以避免酶的不可逆变性。
电泳后,将胶从胶槽中取出,放在反应缓冲液里平衡,然后在聚丙烯酰胺凝胶上面注入一层含卡那霉素和(γ-32P) ATP底物的琼脂糖固定。
NPT-Ⅱ酶接触底物后,酶促反应在凝胶夹层中进行并得到具有放射性的磷酸卡那霉素。
通过S outhern转移将磷酸化的卡那霉素转移到磷酸纤维素滤纸上。
基本分子卡那霉素和磷酸卡那霉素可以结合在滤纸上,ATP则不能。
经过洗涤除去背景的ATP。
通过放射自显影显示出放射性的卡那霉素,从而确定在聚丙烯酰胺凝胶上哪些条带上的蛋白质具有NPT-Ⅱ的活性。
进一步的定量分析可以将滤纸上反映出NPT-Ⅱ活性的条带切下用闪烁计数器进行测量。
G us基因的检测: E.coliβ-葡萄糖苷酸酶的编码序列已经发展成为转化植物的报告基因系统。
β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶。
采用一些商业上提供的特种β-葡萄糖苷酸酶作为底物,其反应产物可用分光光532000年第6期 云南农业科技度、荧光(灵敏度较分光光度检测法为高)和组织化学(该方法可观察到外源基因在特点器官、组织,甚至单个细胞内的表达情况,它催化的底物为X-gluc,产物为蓝色化合物)的方法检测。
β-葡萄糖苷酸酶的基因已经被克隆和测序,并编码稳定的酶,这个酶具有令人满意的性质,可以用来进行嵌合基因的构建及分析,它提供的嵌合基因系统很容易得到好的质量和高的灵敏度。
尤其在组织化学分析中应用这个标记基因,可以判定嵌合基因在不同细胞类型、器官和发育阶段的活性定位。
由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性,因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。
荧光素酶基因检测系统:荧光素酶基因是一种动物蛋白基因,目前研究较多的是荧光虫荧光素酶及细菌产生的荧光素酶。
荧光素酶催化的底物是6-羟基喹啉类,在镁离子、ATP及氧的作用下酶使底物脱羧,生成激活态的氧化荧光素,发射光子后,转变为常态的氧化荧光素。
由于这类酶的活性不需要转录后修饰,无二硫键,不需要辅酶因子和结合金属,因此几乎可以在任何宿主细胞中表达。
荧光素酶基因作为一个报告基因还有一个优点,即检测的灵敏度高,检测迅速而且操作方便,对于研究低水平表达的基因有较大的意义。
由于生物中普遍缺少内源荧光,因此该基因几乎不存在背景干扰问题。
荧光素酶与反应底物混合后所产生的荧光持续数秒到数分钟即消失。
检测需要闪烁计数器和荧光计。
荧光素酶的可检测浓度在理想状况下少于10-20m ol/L。
胭脂碱和章鱼碱检测:冠瘿碱合成酶基因存在于农杆菌T i质粒或Ri质粒上,该基因与T i质粒的致瘤作用无关,故在构建载体时,有时将该基因保留作为报告基因使用。
该基因的启动子是真核性的,在农杆菌中该基因并不表达,整合到植物染色体上后即行表达,编码与冠瘿碱合成有关的酶,催化冠瘿碱合成。
目前已发现的催化冠瘿碱合成的酶主要有两种,一种是胭脂碱合成酶,另一种是章鱼碱合成酶。
其检测原理是通过纸电泳分析筛选出存在胭脂碱和章鱼碱的转化植物材料。
将植物材料直接挤压在电泳图谱纸上,进行电泳。
在电场作用下,胭脂碱和章鱼碱可以同正常组织中含有的精氨酸分离开,用菲醌这一敏感的荧光染料进行染色,即可进行观察。
Cat基因(即氯霉素乙酰转移酶基因)的检测:氯霉素最早是从放线菌中分离出来的抗菌素,它能够选择性地与原核细胞50S 亚基或真核细胞线粒体核糖体大亚基结合,抑制蛋白质生物合成。
Cat基因编码氯霉素乙酰转移酶,该酶催化乙酰C oA转向氯霉素形成乙酰化产物,乙酰化了的氯霉素不再具有氯霉素的活性,失去干扰蛋白质合作的作用。
真核细胞不具有氯霉素乙酰转移酶基因,无该酶的内源性活性,因而Cat基因可以作为真核细胞转化的标记基因及报告基因,Cat基因转化的植物细胞能够产生对氯霉素的抗性,而非转基因植物则不具有这种抗性。
Cat基因的活性可以通过反应底物乙酰C oA的减少或反应产物乙酰化氯霉素及还原型C oASH的生产来测定,目前常用的方法有硅胶G薄层层析法及DT NB分光光度计法。
Cat基因不仅用来检测外源基因是否转化成功,而且在研究转化的外源基因在植物体内的表达调控中起重要作用,是目前研究基因表达调控最常用的报告基因之一。
Pat基因的检测:Pat基因为抗除草剂基因,它编码PPT乙酰转移酶(PAT)。
PPT是一种谷氨酸结构类似物,能竞争地抑制植物体内谷氨酰胺合成酶(G S)的活性。
当PPT 存在时,G S活性被抑制,细胞内NH+4积累,细胞中毒而死亡。
PAT基因编码的PPT 乙酰转移酶可以催化乙酰基有乙酰C oA分子上转移到PPT分子的游离氨基上,使PPT 乙酰化,乙酰化了的PPT失去对G S的抑制63云南农业科技 2000年第6期国外养鱼新法种种 变温养鱼法 莫斯科农业大学的试验养殖场,水生物专家们经过试验,成功地开发出变换水温养鱼的新方法,可在不改变鱼饲料的前提下,大大加快鱼苗的生长速度。
这种方法是在育鱼苗的池中,安装一个调控加热器,通过对池水加热,使池水温度略高于普通水温110℃～115℃,并在停止加温、水温降至正常后,再继续进行加热。
这样,依次循环,使池水的水温经常在110℃～115℃的范围内变化,从而使鱼苗的生产速度加快40%左右,同时,可使鱼苗出水后对水温的适应性更强,死亡率降低2%～3%。
激素养鱼法 加拿大的生物学家埃德瓦尔特多纳尔德森,将从小鸡和小牛身上提取的生长激素荷尔蒙,加入到鲑鱼鱼苗的饲料中去,可使鱼的生长速度快1倍,日增重指数可达到2138%,而使用普通饲料,日增重指数仅为1148%。
美国科学家还从鱼身上提取生长激素,植入另一条鱼,可使植入生长激素的鱼体内,产生比原来多1倍的生长激素,从而使鱼的生长速度大大地加快,日增重可提高50%以上。
咸水养鱼法 新加坡国立大学的科学家,采用盐度为3%的淡咸水饲养鲤鱼仔鱼,可明显地提高鲤鱼仔鱼的成活率、生育率和生长率。
如果在淡咸水中饲养的鲤鱼仔鱼的饲料里,再加入1×10-8的甲状尿素,制成微型胶囊后饲喂,还可增进其食欲,加快其生长速度。
音乐养鱼法 日本的许多养鱼场让鱼听音乐,以促进鱼生长。
在此基础上,还开发出便于捕获的新的音乐养鱼法。
这种新的音乐养鱼法,就是在鱼卵人工孵化以后,每次喂幼鱼饵料时,都伴放一种音乐,使幼鱼形成听到这种音乐,就到进食地点进食的习惯。
将幼鱼放在大面积鱼池进行饲养后,每次投食,继续伴放这种音乐,使鱼集中到进食地点。
所以,到捕捞成鱼时,只要一伴放这种音乐,鱼就和往常一样,到进食地点来,得以顺利地将其捕捞。
选择养鱼法 美国佛罗里达州泊尔梅特水产公司的专家,采用选择性繁殖技术,经过8年时间, 28代的选择性繁殖,将称为迪拉彼亚的鱼,培育成一种无刺的肉用鱼。
这种无刺的肉用鱼,只有一根脊椎,鱼刺已全部退化,食用时肉中不再带刺。
其成鱼的个体重约两磅,肉味鲜美。
一尾雌鱼一年可繁鱼苗约6000尾。
目前,这种无刺的肉用鱼,已经推广到美国的35个州和一些外国的水产公司进行养殖。
扬州市宝应叶挺东路17号信息部(225800) 何 人作用,因而转化了Pat基因的植物表现出对除草剂PPT的抗性。
目前PPT来源有两种:一种是化学合成的,称为Basta;另一种是通过微生物发酵产生的含有PPT的三肽,称为Bialaphose。
Pat基因也有两种,一种是来自Streptomyces hygrocopicus的bar基因(因其抗Basta而得名),另一种是来自S.viri2 dochrgtnes的pat基因,bar和pat都编码PAT。
Bar基因可以作为转化体筛选标记,又因其检测的灵敏度高,所以也用作报告基因。
Bar基因的表达产物PAT活性测定方法有硅胶G薄层层析法及DT NB比色分析法。
DHFR基因的检测:DHFR基因又称氨甲喋呤抗性基因,编码二氢叶酸还原酶。
二氢叶酸还原酶在DNA生物合成中起重要作用。
氨甲喋呤与二氢叶酸结构类似,竞争性抑制二氢叶酸还原酶活性。
植物细胞的二氢叶酸还原酶对氨甲喋呤极为敏感。
以氨甲喋呤作为选择剂筛选转化细胞时,非转化的植物细胞在含有一定浓度氨甲喋呤的培养基上不能正常生长,而转化细胞中含有标记基因表达的二氢叶酸还原酶,氨甲喋呤对它的抑制作用很弱,所以转化细胞能够在添加氨甲喋呤的培养基中生长。
二氢叶酸还原酶活性检测的方法是将植物材料在含有氨甲喋呤及放射性标记的磷酸盐培养上培养,然后提取总DNA,琼脂糖凝胶电泳后将X胶片放在凝胶上放射自显影检测放射性标记的磷酸盐是否掺入到DNA分子中。
X胶片上出现放射性植物DNA条带的样品具有DHFR活性,证明DHFR基因已经在植物细胞内表达。