微核试验

小鼠骨髓细胞微核试验
沈阳药科大学 药理教研室
实验目的 实验原理 实验材料 实验方法 结果统计 注意事项
实验目的
学习小鼠骨髓多染红细胞（PCE） 微核测定方法
了解环磷酰胺对骨髓细胞染色体的 损伤作用
பைடு நூலகம்
实验原理
微核(micronucleus)：是细胞内染色体 断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂 后期滞留在细胞核外的遗传物质。形态 上完全游离于细胞浆中；大小相当于细 胞直径的1／20—1／5，体积小于主核 的1／3，呈圆形或杏仁状；染色与结构 与主核一致；数目：在间期细胞中可以 出现一个或多个。
红系祖细胞——原红细胞——早幼——中幼— 脱核
—晚幼——PCE——NCE (嗜多染红细胞) (桔黄色)
小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成
微核可出现于多种细胞，但在有核细胞中 难于与正常核的分叶及核突出物区分，故 常计数PCE细胞中的微核，因为红细胞在 成熟之前最后一次分离后数小时将主核排 出但仍保留微核于PCE细胞中。
什么是PCE?简单的说PCE就是一种刚 排核而未成熟的红细胞。红细胞是在骨 髓中生成的，骨髓中的红系祖细胞经过 数次分裂，最后脱核成为成熟的红细胞。 脱核后早期，红细胞内血红蛋白的主要 成分球蛋白的合成旺盛，因此胞质中存 在大量的核糖体，Giemsa染色呈灰蓝色， 这就是PCE。随着球蛋白合成完毕，核 糖体完全分解，PCE逐渐形成成熟的正 染红细胞。
微核形成的原因：由遗传毒性物质造成的。
微核形成的原因 微核构成
遗传终点
DNA断裂剂 无着丝粒断片 染色体完
(x-射线)
整性改变
非整倍体
一条或几条 染色体分
诱变剂
染色体
离改变
(甲基汞
秋水仙碱)
微核试验能检测药物或和其它物质 因素诱导产生的染色体完整性改变 和染色体分离改变这两种遗传学终 点。
小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验： 是目前应用最为广泛的微核试验。
（二）器材 晾片架， 1ml注射器及针头，载玻片及 推片，止血钳，显微镜（油镜头），细 胞计数器。
（三）动物 昆明种小鼠，体重24-28g，雄性。
实验方法
1．染毒：每组取小鼠4只，称重随机分 成二组，一组生理盐水组，腹腔注射生 理盐水0.2ml/10g，一组为环磷酰胺组， 环磷酰胺接100mg/kg腹腔注射 （0.2ml/10g）。
2．涂片 给药24小时后用颈椎脱臼方法 处死动物，四肢固定于解剖板，剖开胸 腹部，取下胸骨，剔去肌肉。将胸骨骨 髓挤于有一滴小牛血清的载玻片上，推 片。
3．固定 将推好晾干的标本玻片放入甲醇 溶液固定15分钟，取出晾干。
4．染色 用新鲜配制的10%Giemsa染液染 色15分钟。冲洗后晾干。
注意事项
操作时推制良好的骨髓涂片及良好的染 色，是本实验的关键步骤。
熟悉并正确区分各种骨髓细胞。
MN NCE
红细胞
电镜
单个微核
多个微核
5．观察计数 先在低倍镜下观察，选择 分布均匀，染色较好的区域，再在油镜 下观察计数。PCE细胞呈灰蓝色，正染 红细胞（NCE）呈桔黄色。一个细胞内 可出现一个或多个微核。计数200个 PCE中含有微核的PCE数.
结果统计
本试验中只计数PCE中的微核。每一动 物为一观察单位，每组动物分别计算微 核PCE的均值。全班一起用t一检验统计。
特点：简便、快速、有一定的灵敏度 应用：是化合物安全性毒理学评价必做
试验之一 为何要用小鼠，因为人和大鼠带有微核
的红细胞常在脾脏被破坏，但唯有小鼠 例外。
实验材料
（一）试剂 甲醇（分析纯）， 冰醋酸（分析纯）， 吉姆萨（Giemsa）储备液，小牛血清， 磷酸盐缓冲液pH6.8， 环磷酰胺。