6.放射性核素示踪技术

设：m1为标记化合物的量； A为标 记化合物的放射性；S1为标记化合物 的比活度；S2为稀释后混合液的比活 度；mx为样品中待测化合物的量 根据公式 S2(m1+m2)=S1m1 得： mx=m·(S1/S2-1) 这是正稀释法的基本公式。
例题：某样品内含有微量磷酸钠(Na3PO4)， 加 32 P 标记的磷酸钠 (Na332PO4)0.05 mg，其放 射性计数为 1950 cpm，混匀后分离得纯品磷 酸钠0.1 mg，放射性计数为600 cpm，求样品 中磷酸钠的含量。 解 ： 已 知 A=1950cpm, m1=0.05mg, S1=1950/0.05=39000(cpm/mg) S2=600/0.1=6000 cpm/mg,代入基本公式得 ： mx=0.05×(39000÷6000-1)=0.275 mg
三、基本方法 (一)核素正稀释法(direct nuclide dilution) 用已知量的标记物测定未知量的非标 记物的稀释法称为核素正稀释法。方法要 点是：将一定量已知比放射性的标记化合 物与其非标记化合物的分子均匀混合，测 定该混合样品的比放射性，亦可进行提纯 后测定该样品的比放射性。根据比放射性wenku.baidu.com的降低来计算非标记化合物的含量。
2、整体内各种体液成分的量 整体内有些体液成分的量相对恒 定，它们不一定是一种特定物质，因 此习惯上不称为代谢库，但是它们的 变化有理论意义和临床实践意义。测 量它们总量的唯一办法也是同位素稀 释法。 下表是常用的几种体液成分测量法。
§3
物质转化的示踪研究
研究物质转化的目的要揭示机体内重 要生命物质的前身物、中间物、及产物的 关系，以完成某种转化的必要条件。该方 法是目前最常用最理想的方法之一，可以 在整体、离体的条件下进行进行，不但能 够对前身物、中间物，产物作用定性分析 ，还可用来研究前身物转化为产物的速度 ，转化的条件，转化的机制及各种因素对 转化的影响等。
④比活度：根据示踪实验灵敏度要求选择 适当的比活度，整体示踪实验时，标记物 的引入基本不改变该物质的体内含量，同 时要求能经得起体内的稀释，使放射性测 量的统计误差在允许范围内。 ⑤标记位置的选择：物质转化的示踪研究 要求采用定位标记示踪物，而目标记物在 代谢过程中应稳定、不脱落。当研究的目 的只是观察标记物的去向，而不管其代谢 产物，就不需要严格定位的标记物。
2、 离体(in vitro)参入实验： 研究物质转化过程的细节常采用离 体参入实验，实验条件易于控制，有利 于在分子水平阐明转化过程的具体步骤， 转化条件及影响因素。 一般用于离体掺入实验的生物材料 主要有组织切片、组织匀浆、游离细胞 、 亚细胞颗粒或无细胞酶系统，要求研 究材料保持生理活性，至少在进行实验 期间能与引入的标记物相互作用。应用 较多的是组织匀浆。
§2
放射性核素稀释法
一、概念 放 射 性 核 素 稀 释 法 ( radionuclide dilution technique) 即用适当的放射性核 素标记化合物作为示踪剂，利用化学上的稀 释原理对微量物质作定量分析，或测定液体 容量的方法。 二、基本原理 依据化学物质在稀释前后质量不变的原 理，放射性物质在被稀释前后，其放射性活 度也不会改变。但是，由于被稀释，它的比 活度或放射性浓度降低了。
二、主要特点 1. 灵敏度高：灵敏度可达 10 -14 ～ 10 -18 g 水平，因而对研究体内或体外实验系统内 的微量物质具有特别重要的价值。 2.检测方法简便。 3. 合乎生理条件：引入高比放射性示踪 剂，不会改变体内或体外系统的正常生理 平衡，实验结果接近正常生理状态物质的 变化。 4.能定位和定性。比如利用RAG可检测示 踪剂在组织、细胞内的分布情况等。
(二)主要参数： 1、掺入百分率(incorporation percent rate )， 表示引入的前身物分子能转变为产物 的百分率，即掺入百分率=产物的总放射 性/前身物的总放射性×100% 上式中产物的总放射性并不反映前身 物转化为产物的总量，这是因为标记前身 物进入生物体系后往往被内源性前身物所 稀释，而后者形成的产物不带放射性，因 此，形成的非放射性产物越多，产物的总 放射性反而越低。
2、选择合适的测量方法：通常根据选用的 核素发射的射线种类确定用何种方法测量。 如固体闪烁测量，液体闪烁测量、放射自 显影等方法。双标记要用双标记方法测量。 3、示踪剂量的估算 示踪剂量的估算不能用简单的公式来 估算，应该综合考虑。 ①稀释作用：放射性核素标记化合物进入 机体后，一般要求放射性活度在整个实验 过程中，经稀释后所制得的放射性样品不 能低于本底计数。
4、示踪剂引入途径：根据实验类型和 目的，对整体动物实验可采用静脉、 腹腔、皮下及肌肉注射，或口服、灌 胃等。 5、放射性样品的制备：样品的制备是 为测量服务的，测量的形式主要有三 类：①取标本在体外测放射性；②制 成不同水平的切片作放射自显影；③ 从体外测整体内的放射性。因此样品 制备就要适应不同测量类型。
2、相对比活度(relative specific activity) 常用比活度来表示产物和前身物各自 的放射性，即毫(微)克分子的放射性，然 后再计算它们的比值来反映它们的相互关 系，这种关系就称为相对比活度，相对比 活度=产物的比活度/前身物的比活度。 式中的前身物比活度是指标记前身物与内 源性前身物混匀后的测定值，两者应同时 测量。相对比活度反映的是前身物转化为 标记产物的速率，或称为标记前身物的利 用率，即掺入率(incorporation rate)。
一 、 掺 入 实 验 ( incorporation experiment) (一)基本原理：要研究生物体系中化 合物A和B是不是前身物和产物的关系 ，可将A的适当部位用放射性核素标记 。进入生物体系(整体或离体组织)后 一定时间，分离出B。如在B中出现较 多的标记核素，说明A的标记原子、标 记集团或整个标记分子已参入到B中， 即证明化合物A是产物B的前身物。
(四)基本方法 1. 选择合适的标记物。根据待测 代谢物的特定，选用适当前身物并在 一定部位进行标记。 2.将标记物引入生物体系。 3. 分离产物。根据不同情况采用 不同的分离方法，提取的产物最好制 备成溶液。 4. 测量产物。放射性测量及物质 定量，由此求出比活度。
(五)要求与条件 1.标记前身物用量是示踪量。要求比活度 尽可能高，保证测量结果准确可靠。 2.放化纯度要高(>95%)。 3.分离的产物要求达到放化纯。 （六）掺入实验实例 以淋巴细胞转化实验为例对这类方法 作简单介绍。人外周血T 淋巴细胞在PHA （植物血球凝集素）的刺激下发生母细胞 转化而增殖，处于S期的细胞不断地摄取 TdR（胸腺嘧啶核苷， DNA合成的前身物 ）用以合成DNA。
(三)掺入实验的类型 1、整体(in vivo)掺入实验： 多数采用实验动物，选用适当的 标记物也可在人体内进行。整体实验 有利于观察某一物质在体内转化的全 貌，某些酶系统作用的研究有时只能 在整体进行。如果实验设计合理，整 体参入易于得出最后结论。但由于体 内有循环交换及代谢旁路，不易弄清 转化过程的细节。
②组织的浓聚作用：由于某些放射性核 素有亲某种组织的特性，有的放射性核 素进入机体后不是完全均匀被稀释，而 可能选择性地蓄积到某些器官、组织而 浓聚。如 131 I 进入体内后，有 30% 或更高 可被甲状腺摄取，给予剂量时就要考虑 这个特异性。 ③实验周期及安全剂量：根据试验周期 长短，实验分析方法，给予途径等进行 安全剂量估算。
第六章 放射性核素示踪技术
放射核素示踪技术是利用放射性核 素及其标记化合物作为示踪剂，应用射 线探测方法来检测它的行踪，以研究示 踪剂在生物体系或外界环境中运动规律 的核技术。放射核素示踪技术是实验核 医学中最重要的实验核技术之一，促进 了学科的交叉和渗透，贯穿于整个核医 学中，也被经常应用于基础医学、临床 医学等各个学科。
设质量为m1的标记物的比活度为s1 与质量为 m2 的同一种化学形态的非示 记物均匀混合，则标记物被非标记分 子所稀释，混合物的比活度为 s2，混 合前后的总放射性应相等。即： s2(m1+m2)=s1m1 如果 m1 和 m2 中有一个量为已知， 只需测定混匀后样品 ( 取任意量 ) 的比 活度，就可算出另一量。
§1 放射性核素示踪技术的原理及特点 一、基本原理 放射性核素示踪实验的原理基于两 个方面： 1、相同性：即放射性核素及其标记化 合物和相应的非标记化合物具有相同的 化学及生物学性质，在生物体内的变化 相同； 2、可测量性：即放射性核素能发出各 种不同的射线，可被放射性探测仪器所 测定或被感光材料所记录。
1、测定生理性物质的体内代谢库： 体内各种生理性物质都有各自的分 布范围，每个分布范围称为一个代谢库。 利用同位素稀释法来测定活体各代谢库 的大小几乎是绝大多数物质整体代谢库 的唯一有效方法。例如静脉注射少量高 比活度的3 H-胆酸，待其在包括血浆在内 的代谢库混匀后取样测比活度，按稀释 法原理即可算出体内包括血浆在内的胆 酸代谢库的大小。
(二)核素反稀释法(inverse
nuclide dilution)： 用已知量的非标记物测定样品 中标记物含量的方法称之为核素反 稀释法。反稀释法与正稀释法测定 的原理相同，可以用同样的公式计 算，只是选择的未知数不同，反稀 释法的测定对象是求标记物的化学 量m1 。
四、放射性核素稀释法的应用 放射性核素稀释法当初建立时，曾 大量用于体外样品的定量工作。但自从 灵敏度更高的放射免疫分析方法及由此 发展起来的非放射性分析方法推广以来， 现已较少使用。但是在某些领域，核素 稀释法仍有不可取代的优越性。一是测 定生理性物质的体内代谢库或测定整体 内各种体液成分的量，二是作为考核其 它超微量分析方法可靠性的参比。
3.双标记示踪实验：其原理就是将两 个研究对象包括两种分子或是一种分 子的两种形态或是一种分子的两个部 分，分别带上示踪原子，通过采用相 应的测量方法，分析两种标记原子的 量，观察它们经过运动转化前后比值 的变化，判断该两种观察对象的运转 规律。
(二)实验方法及应注意的问题 1、标记物的选择： ①射线类型：体内示踪实验宜选用γ射线 发射体，如 131 I、99mTc；离体示踪或取样 进行离体测定的研究则多选用β射线或低 能γ射线发射体，如3H、14C及125I等。 ②半衰期：体内示踪实验一般选用短半衰 期核素，体外示踪实验可用半衰期长的放 射性核素。 ③放化纯度：必须经过纯化鉴定、放化纯 度>95%。
④相对比活度：两个解剖部位中同一化 合物比活度的比值或两种化合物比活度 的比值。用于反映组织中某物质的来源 及组织与血液交换的速率，可排除血液 中比活度不恒定的影响。 四、示踪实验中的同位素效应 物质转化时，如分子中某一原子被 它的同位素所取代，虽然反应性质不变， 有时却会发生反应速度的改变，称为同 位素效应(isotope effect)。 在作物质 动力学研究时，应考虑同位素效应。
三、基本类型、方法及注意事项 (一)类型： 1.整体示踪实验：将标记物引入完整的机 体，从体外或取标本观察标记物的去向， 以了解示踪剂在机体内的运动规律，主要 用于研究物质在体内的吸收，分布、代谢 和排泄过程。 2.离体示踪实验：指从整体中分离出来的 组织或细胞等简单系统进行的实验。多用 于某些特定物质如蛋白质、核酸等的转化 规律以及某些精细结构的功能研究。
6、数据处理：放射性示踪实验结果可根 据不同目的选用不同参数表示，含义也各 不相同，概括为以下几种。 ①整个脏器的总放射性活度：主要用于 研究物质分布的实验以反映各脏器的相对 分布量。 ②放射性含量： dpm/mg 组织或 ml 体液、 dpm/mg 蛋白或 DNA 等。用以反映不同组织 浓集某种物质的能力。 ③比活度： dpm/mmol 或 mg 化合物。主要用 于研究内源性物质的动态分布或代谢。