论S100A2在喉鳞状细胞癌中的表达及其意义

论S100A2在喉鳞状细胞癌中的表达及其意义

摘要：目的研究S100A2蛋白在喉鳞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,lscc)中蛋白表达的情况，探讨其在喉鳞癌发生、发展、浸润转移中的作用。方法收集40例泸州医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科20XX年1月至20XX年5月手术切除经病理诊断证实为喉鳞癌（LSCC）患者病理组织石蜡标本

作为实验组，另取40例同期手术切除经病理证实无肿瘤浸润的癌旁喉粘膜组织标本作为对照组。所有石蜡标本按4μm连续切片2张,其中1张HE染色,另外1张用免疫组织化学染色SP法检测S100A2蛋白的表达。以试剂盒内阳性切片作为阳性组，用磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Solution,PBS）代替一抗做阴性对照。具体实验步骤参照试剂盒说明，显微镜下观察喉鳞癌组织及无肿瘤浸润的癌旁粘膜组织各组细胞中S100A2的分布情况并计数其阳性表达率。结果喉鳞癌及正常喉粘膜组织中S100A2蛋白表达位于胞核和胞浆，呈黄色至棕黄色着色。40例无肿瘤浸润的癌旁喉粘膜组织中S100A2蛋白全部为阳性表达，表达率为100%(40/40)，40例喉癌组织中S100A2蛋白表达率为78%（31/40），阳性表达低于无肿瘤浸润的癌旁喉黏膜（P关键词： S100A2；喉鳞癌；免疫组织化学方法

1 材料与方法

实验材料与仪器

资料收集40例泸州医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科20XX年1

月至20XX年5月行手术切除后经病理学诊断为喉鳞状细胞癌（lscc）的存档蜡块。所有病例术前均行喉部高分辨率CT检查，均未行放化疗治疗。40例喉鳞癌中，男性例，女性1例,年龄45～71岁，平均岁；病程2～36个月。将病例按年龄、不同分化程度、有无颈淋巴结转移、TNM分期进行分组。年龄以60岁为界，分为两组；按组织病理学分级分为高分化鳞癌22例，中分化鳞癌10例，低分化鳞癌8例；有淋巴结转移22例，无颈淋巴结转移18例；按1997年国际抗癌协会（UICC）制定的TNM分期， T1～T2期有14例，T3～T4期有26例;将40例同期手术切除经病理证实无肿瘤浸润的癌旁喉黏膜标本作为对照组。

主要实验试剂兔抗人多克隆S100A2抗体（购于sigma公司），

免疫组化试剂盒、DAB显色盒购于（北京中杉生物技术有限公司）。

主要实验仪器轮转式切片机（Leica-RM2035 产于德国），OLYMPUS

显微镜（BX-50，日本），CS20XX-1恒温干燥箱孵育盒（重庆四达实验仪器厂），SAYYO低温冰箱-20℃(MDF-330.产于日本），病理图像分析处理系统(GD-8,中国)。

实验方法所有样本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，切

片厚度为4μm。免疫组化染色按试剂盒说明进行，组织切片经脱蜡、水化、微

波处理，进行抗原修复，阻断内过氧化物酶30 min ，PBS 冲洗3 次，每次3min，非特异性血清封闭30 min，PBS 冲洗3 次，每次3 min，抗原一抗4℃孵育过夜，PBS 冲洗3 次，每次3 min，二抗孵育30 min，PBS 冲洗3 次，每次3 min，DAB 显色，苏木素复染细胞核，脱水，透明，封片，镜检及摄像。采用预实验反复多次证实均呈阳性的组织切片为阳性对照，空白对照以PBS代替一抗。

结果判断及资料整理 S100A2阳性结果判定：细胞核或核与胞浆染成黄色或棕黄色或弥漫的棕黄色为阳性细胞；每张切片选择典型部位，随意选5

个不同高倍视野(400×)计数，以平均数做最后判定。根据阳性细胞数占视野中总细胞数比例进行判定：阳性细胞数≤10％为阴性结果，阳性细胞数≥ 11%，为阳性结果。切片均经2位病理医生盲法独立计数阅片,两者不一致时重新计数。最后根据免疫组化染色编号，对应的病理号及住院号整理检测结果。

统计学处理所得实验数据通过软件进行统计学分析，检验水准а=。计数资料采用χ2检验对结果进行统计学处理，比较其差异，P<为差异有统计学意义。

2 结果

60例标本全部进入结果分析，S100A2蛋白经免疫组化染色后于细胞核或细胞核与细胞质，出现棕黄色或黄色颗粒为阳性表现。

S100A2蛋白在喉鳞状细胞癌及癌旁喉部黏膜组织中的表达（见表

1） S100A2蛋白于无肿瘤浸润的癌旁喉部黏膜组织中，其阳性率表达为100%，而在喉鳞状细胞癌组织中，有31例呈阳性表现，阳性率为78%，经χ2检验，

S100A2蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达明显低于无肿瘤浸润的癌旁喉部黏膜组织，具有显著差异（χ2=,P＜）。

S100A2蛋白表达与喉鳞状细胞癌分化程度的关系（见表1） 40例喉鳞状细胞癌标本中，（1）高分化为22例，其S100A2蛋白表达阳性率为91%；（2）中分化为10例，其S100A2蛋白表达阳性率为90%；（3）低分化为8例，其S100A2蛋白表达阳性率为25%,经卡方检验，组间比较，高分化与中分化喉鳞状细胞癌

中S100A2蛋白表达阳性率明显高于低分化组，差异显著（（1）与（3）χ2=, （1）与（3）χ2=,P＜）；而高分化与中分化组间阳性表达率比较差异不明显（P

=）。

S100A2蛋白表达与喉鳞状细胞癌中淋巴结转移的关系（见表1） 40

例喉鳞状细胞癌中，有淋巴结转移22例，其S100A2蛋白表达阳性率为%；无淋巴结转移18例，其S100A2蛋白表达阳性率为%，明显高于有淋巴结转移组，组间比较差异显著（χ2=，P=，P＜）。

S100A2蛋白表达与喉鳞状细胞癌临床TNM分期的关系（见表1）按1997年国际抗癌协会（UICC）制定的恶性肿瘤分期标准，将喉鳞状细胞癌行TNM 分期，40例标本中处于T1～T2期的14例，其中S100A2蛋白的表达阳性率为%；处于T3～T4期的26例，其中阳性表达20例，阳性率为%。经χ2检验，T1～T2期中S100A2蛋白的表达阳性率与T3～T4期比较，差异不明显（χ2=，P=）。

S100A2蛋白表达与患者年龄的关系（见表1）将不同年龄组患者

S100A2蛋白表达阳性率进行统计学分析。40名患者中≤60岁的12例，其中

S100A2蛋白阳性表达者9例，阳性率%；＞60岁的28例，S100A2蛋白阳性表达者22例，阳性率%，两组比较无明显差异（χ2=，P=）。说明年龄不是影响喉鳞癌中S100A2蛋白表达水平的因素。

表1 喉鳞状细胞癌组织中S100A2蛋白表达与各临床因素的关系（略）注：与无肿瘤浸润的癌旁喉部黏膜组织比较aP＜，与低分化喉鳞状细胞癌中S100A2蛋白表达阳性率比较：bP＜; 与中分化喉鳞状细胞癌中S100A2蛋白表达阳性率比较cP＞；与无淋巴结转移组比较dP＜；与T1～T2期组比较eP＞；与≤60岁年龄组比较fP＞

3 讨论

S100A2的结构及在肿瘤发生、发展和转移中的作用 Lee 等［1］利用消减杂交技术经正常细胞和肿瘤细胞（21MT-2，从胸膜渗出液中分离出的非整倍体细胞）的cDNA 和mRNA 经二轮杂交后，筛选并鉴定了S100A2 基因全长cDNA，S100A2定位于人染色体的1q21 的250 ～300kb 之间，全长为8670bp。此蛋白由两个EF-手型结构组成与钙离子有较高的亲和性，为S100钙结合蛋白家族的成员。综合国内外研究报道：S100A2在肿瘤发生、发展和转移过程中的具体作用机制可能主要有以下几方面：(1)在各种哺乳动物自发或化学诱发的肿瘤组织中，钙离子含量明显增加［11］，相反钙结合蛋白S100A2 在肿瘤组织中表达水平降低或缺失（后述）这种现象提示在钙结合蛋白S100A2 存在时因其能够结合钙离子而使钙离子浓度降低，致使细胞增生活性得到控制，从而抑制肿瘤的生成。

(2)参与细胞周期调控作用：有研究学者检测到在正常乳腺上皮细胞周期中，

S100A2 mRNA 在早G1期表达增加2倍，S期开始时增加倍，同时，细胞周期蛋白cdc2、cyclin A 和cyclin B mRNA 在G2期表达增加，而在乳腺癌细胞中，虽然细胞周期蛋白表达异常增高，但S100A2 却表达下降甚至缺失［12］。(3)与p53相互作用，P53是涉及人类肿瘤较为广泛的肿瘤抑制基因，也是头颈部肿瘤