实验五 植物组织中超氧化物歧化酶活性测定
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
超氧化物歧化酶（SOD）活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。
过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。
植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。
抗坏血酸（VC ）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。
自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。
二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。
如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。
H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。
植物多酚氧化酶、超氧化物歧化酶的测定
植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。
二、原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。
用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。
反应式如下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌＋H2O三、材料、仪器及试剂1. 材料：马铃薯块茎等2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。
3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1 pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚；20％三氯乙酸。
四、实验步骤1. 粗酶液的制备称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。
将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。
2. 活性酶的测定在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。
五、酶活性的计算以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。
A 酶提取液总量（ml）酶活力（0.01A·min－1）＝———————×———————————0.01×反应时间测定时酶液用量（ml）A 酶提取液总量（ml）酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)＝—————————×——————————0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml）公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。
超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法
超氧化物歧化酶（SOD ）活性的测定方法
一、试剂
1. 0.1mol/L HCl
2. 10mmol/L HCl
3. 0.1mol/L Tris 标准溶液：12.114g 三羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水，并定容至1000ml.
4. 50mmol/LTris 缓冲溶液：50ml0.1mol/L Tris 标准溶液中加入0.1mol/L HCl 19.9～22.0ml,定容至100ml ，PH 为8.20。
5. 30mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液：3.7833g 邻苯三酚溶于10mmol/LHCl 中，并用10mmol/LHCl 定容至1000ml.
二、仪器
1. 紫外分光光度计
2. 酸度计
3. 恒温水浴锅
三、操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率测定
在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris 缓冲溶液，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min 测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl 代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min 左右。
%1004
min 1min 5⨯值值－第第自氧化速率＝OD OD 2.SOD 活性测定
将样液加入到Tris 缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。
活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u ）。
样品质量样液体积样品稀释倍数自氧化速率速率自氧化速率－样液氧化＝活力（⨯⨯⨯⨯5.4%50%100)/SOD ml u。
超氧化物歧化酶活性的测定
超氧化物歧化酶活性的测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物体内一种重要的抗氧化酶，它能够将有害的超氧自由基（superoxide radical, O2•⁻）转化为氧和过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2），从而防止细胞和组织受到氧化应激的损伤。
因此，超氧化物歧化酶活性的测定对于研究氧化应激与各种疾病的关系具有极大的重要性。
超氧化物歧化酶活性的测定方法有多种，以下主要介绍两种常用的方法：一、停止法停止法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，用发生超氧自由基的化学反应（如PMS-NADH系统）制造超氧气自由基以模拟体内超氧自由基的生成，观察并测定经超氧化物歧化酶处理后剩余的超氧自由基量的下降速率，通过计算算出SOD活性。
步骤：1、准备试剂：PMS（N-甲基-苯肼）溶液、NADH（辅酶Ⅰ）溶液、EDTA-Na2溶液、碳酸氢钠-硫酸溶液、紫外分光光度计。
2、制定反应液：取适量PMS溶液和NADH溶液加入缓冲液中，使最终浓度分别为100μM和780μM，混匀。
3、制备样品：用生理盐水或缓冲液将要测定的样品进行稀释，并在4℃下保存备用。
4、制备标准品：以SOD标准品（0-10U/mL）为浓度系列，每组分别加入50μL的样品和反应液，在37℃水浴中反应30min。
5、反应终止：以碳酸氢钠-硫酸溶液均匀混合停止反应。
6、测定吸光度：用紫外分光光度计测定反应液的吸光度，波长设置在340 nm。
7、计算超氧化物歧化酶活性：计算标准品的反应速率（Vx）和酶反应的反应速率（Vt），按照以下公式计算超氧化物歧化酶活性：SOD活性（U/mL）=（Vt–Vx）/Vx×标准品的酶活力二、降解法降解法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，将超氧自由基产生物质注入试管中，随着时间的推移，样品中的超氧自由基将越来越少。
超氧气自由基和非酶物质将通过电子色谱法被检测和测量。
1、制备反应液：将样品加入含有相应浓度的降解剂中，使反应液中超氧气自由基的浓度达到稳定状态。
超氧化物歧化酶的分离、纯化和活性测定
综合实验超氧化物歧化酶的分离、纯化实验背景超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD) 广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶，生物体内重要的自由基清除剂，防御生物体氧化损伤。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型：铜锌金属辅基(CuZn-SOD) ，蓝绿色，存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙；锰离子(Mn-SOD)，粉红色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，以及植物的叶绿体基质和类囊体膜上；Fe-S0D，黄色或黄褐色，存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
实验一超氧化物歧化酶的活性测定一、实验原理SOD的活力测定方法：化学法：黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，N BT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等；免疫法；等电点聚焦法；本实验采用邻苯三酚自氧化法邻苯三酚自氧化法：邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
二、试剂和器材1、试剂（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl称取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
胞外抗氧化酶类酶活力的测定
原理:在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,并产生O2-,在SOD存在下,自氧化反应受到抑制。
参考邻苯三酚测活法(Marklund 法)孙 [66]，按下表加入0.1M Tris-HCl（PH 8.0,内含1mM EDTA）和ddH2O，25℃恒温水浴20 min，加入1 mL 待测液后加入25℃预热的邻苯三酚溶液，摇匀，立即于320nm测吸光值A320，每0.5 min测定一次，持续测到5 min。
邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活力
酶活力的定义为：温度25 ℃，pH 8.0，波长320 nm处，在每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量为1个酶活力单位，酶活力按下式计算。
单位菌体SOD酶活力（U/g）=
1
-
50%
A A
V N V A
V W
∆∆
⨯⨯⨯∆
⨯⨯
邻菌
邻
A∆
邻:1分钟邻苯三酚自氧化时A320的变化量；A∆
菌：加入待测液后1分钟邻苯三酚氧化
时A320的变化量；V：待测液总体积；N：待测液稀释倍数；V0：加入的待测液的体积;W:菌体重；V1：反应总体积。
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
超氧化物歧化酶（SOD）活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。
过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。
植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。
抗坏血酸（VC ）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。
自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。
二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。
如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。
H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。
玉米超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活性测定
- · O2 -· O 2 + + 2H + H 2O 2 + O 2 SOD 玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定一、目的1．通过对玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定，掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质和超滤浓缩的方法和原理。
2．掌握测定超氧化物歧化酶（SOD ）的活力和比活力的方法。
3．掌握分级盐析沉淀的方法和原理，以及透析的方法和原理。
二、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，简称SOD ），它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：Cu,Zn-SOD ，Mn-SOD ，Fe-SOD 。
SOD 催化如下反应：在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能治疗人类多种病症，如炎症、脑外伤、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老等，对生物体有保护作用。
在玉米中，SOD 主要存在于胚芽中，当将萌发的玉米籽粒打浆破碎后，以中性盐沉降其蛋白质部分，SOD 就存在于沉淀中，但其中有许多杂蛋白，因此在盐析时先用40%（NH 4）2SO 4去除杂蛋白部分，再用90%（NH 4）2SO 4饱和上清液，经过一定时间后，再将盐析液离心，取其沉淀进行透析，一定时间后，则其中的SOD 成分即被浓缩分离。
超滤也是一种蛋白质浓缩方法，其工作原理是运用液压迫使溶质透过膜，并按溶质分子量、形状、大小的差异，把大溶质分子阻留在膜的一侧，而小分子溶质则随溶剂透过膜到另一侧，使大小溶质分子得到分离。
利用此原理只要选择适当的超滤膜即可将玉米浆中SOD 与其它小分子杂蛋白、可溶性糖等分离，并去除水份，得到SOD 浓缩液。
SOD 活性的测定：采用NBT 光还原法。
其原理为核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O 2-，当加入NBT 后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），既而还原成二甲月替（呈兰色）。
该产物在560nm 下有最大吸收峰。
当加入SOD 时，可以使超氧自由基与H +结合生成H 2O 2+O 2，从而抑制了NBT 光还原的进行，使兰色二甲月替 生成速度减慢。
植物组织SOD歧化酶活性测定
植物组织SOD歧化酶活性测定一、实验目的1.了解还原法测定抗氧化物酶活性的原理和方法；2.熟悉植物叶片中ROS清除机制。
二、实验原理细胞内自由基的产生和消除处于动态平衡状态，自由基水平很低，不会伤害细胞。
逆境条件下，植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破，O2-.、H2O2、OH·的产量增加；SOD、CAT、POD活性降低；从而伤害细胞。
依据SOD能抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2.-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2.-，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
三、实验材料普通新鲜的小麦叶片（对照），经冷冻处理的小麦叶片1、提取介质─pH7.0磷酸缓冲液。
2、反应介质─pH7.0磷酸缓冲液, 内含77.12μmol/L硝基四唑蓝, 0.1mmol/LEDTA, 13.37mmol/L蛋氨酸。
3、核黄素溶液: 用含有0.1mmol/L EDTA的50mmol/L(pH7.8)的磷酸缓冲液配制。
四、实验步骤1．酶液的提取各称取0.5g的上述两种叶片，各加入2mL 预冷的提取介质，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内各研磨成匀浆，用提取介质冲洗研钵2~3次，在试管中定容到10mL ，取5ml于刻度离心管中，于4℃，10000r/min，离心10min，上清液即为SOD 酶粗提液。
2．酶活力的测定每种叶片取4个洗净且已经干燥的试管，按下表加入各试剂及酶提取液，试剂（ml）1（照光）2（照光）3（照光）4（不照光）buffer 1.5 1.5 1.5 1.5Met 0.3 0.3 0.3 0.3NBT 0.3 0.3 0.3 0.3EDTA-Na20.3 0.3 0.3 0.320umol核黄素0.3 0.3 0.3 0.3粗酶液0.1 0.1 0 0ddH2O 0.5 0.5 0.6 0.6 各试剂全部加入后，充分混匀，4号试管罩黑布套，作为空白对照，比色时调零用。
植物组织中超氧化物歧化酶活性测定
三、实验步骤
1、酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶 脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷 酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使 终体积为5ml。取1.5－2ml于1000r/min下 离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2、显色反应 取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为 测定管，另2支为对照管，按下表加入各种 溶液： 各溶液显色反应用量
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料 水稻或小麦叶片。 （二）仪器设备 高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx）， 试管或指形管数支。 （三）试剂 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。 （2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。 （3）750µmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光 保存。 （4）100µmol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至 1000ml。 （5）20 µmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。
式中：SOD总活性以鲜重酶单位每克表示；比活 力单位以酶单位每毫克蛋白表示；A 为照光对照 管的吸光度；A 为样品管的吸光度；V为样品液总 体积ml，V 为测定时样品用量ml；W为样鲜重g； 蛋白质含量单位为mg/g。
The end.
混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于 4000lx日光下反应20min（要求各管受光情 况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。 3、SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管作空白， 分别测定其他各管的吸光度。
四、结果计算
黄瓜叶片组织超氧化物酶活性的测定
实验六黄瓜叶片组织超氧化物酶活性的测定一、实验目的与要求用氮蓝四唑法测定黄瓜叶片中SOD的含量二、原理SOD普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
SOD的活性测定是根据光照时，体系中产生氧自由基使硝基四唑蓝还原成蓝色（在560nm 处有吸收峰），而超氧化物歧化酶作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。
一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的还原抑制到对照一半时所需的酶量。
三、植物材料、仪器设备及试剂1.植物材料：15盆（3组完全液，3组100mg/L铅处理，3组300mg/L铅处理，3组500mg/L铅处理，3组700mg/L铅处理）黄瓜叶片2.仪器设备：冰箱，光照箱，低温离心机，电子天平，分光光度计，试管架，普通玻璃试管，移液枪，剪刀，离心管，研钵，吸球，洗瓶等3.试剂（1）提取介质——50mmol/L(PH7.8)磷酸缓冲液（内含1%不可溶聚乙烯吡咯烷酮）（2）反应介质——50mmol.L（PH7.8）磷酸缓冲液（内含77.12μmol/L硝基四唑蓝，0.1mmol/L EDTA,13.37mmol/L蛋氨酸）（3）80.2μmol/L核黄素溶液：用含有0.1mmol/L EDTA的50mmol/L(PH2.8)的磷酸缓冲液配制。
（4）SOD反应混合液：390ml反应介质，加入10 ml 80.2μmol/L核黄素溶液。
四、实验步骤及注意事项1.酶液提取：将黄瓜叶片剪细——混合均匀——称0.5g（用保鲜膜包好放入冰箱中预冻1小时）——置于预冻的钵体中，加入2ml冰冷的0.05mol/LPH7.8磷酸缓冲液，研磨均匀后，将匀浆倒入聚乙烯离心管中——低温（0~4℃）下，4800xg离心10min——上清液即为酶液，将上清液倒入小青霉瓶，低温下贮存，供SOD活性测定。
2.SOD活性测定：取23支干燥的，玻璃质量一致的普通玻璃试管，1号参比管加入40μL酶液，4mlSOD反应混合液。
2号对照管，加入40μL提取介质，4mLSOD反应混合液。
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
超氧化物歧化酶（SOD）活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。
过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。
植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。
抗坏血酸（VC ）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。
自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。
二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。
如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。
H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。
植物组织中超氧物歧化酶活性的测定
• 引言 • 实验材料与方法 • 结果与数据分析 • 结论 • 参考文献
01
引言
目的和背景
目的
超氧物歧化酶（SOD）是生物体内重要的抗氧化酶，能够催化超氧阴离子自由基歧化为氧气和过氧化氢，从而保 护细胞免受氧化损伤。测定植物组织中超氧物歧化酶活性有助于了解植物的抗氧化能力和抗逆性，为植物生理学、 农学和园艺学等领域的研究提供重要依据。
对照组
超氧物歧化酶活性为0.78 U/mg， 标准误差为0.04 U/mg。
数据分析
使用SPSS软件进行数据分析，对实验组和对照 组的超氧物歧化酶活性进行独立样本t检验，以 确定是否存在显著差异。
结果显示，实验组的超氧物歧化酶活性显著高 于对照组，P值小于0.05。
通过数据分析，可以得出实验组植物组织中超 氧物歧化酶活性受到某种处理的影响，而对照 组未受到该处理的影响。
在实验中，通常采用氮蓝四唑（NBT）还原法、邻苯三酚自氧化法、荧光法等方法 测定SOD活性。其中，NBT还原法是一种常用的方法，通过观察NBT还原生成蓝色 沉淀物的量来计算SOD活性。
02
实验材料与方法
实验材料
新鲜植物组织
实验试剂
选取健康、新鲜的植物组织，如叶片、 茎或根等，用于提取酶液。
包括磷酸缓冲液、甲苯、乙醇等，用 于提取和纯化超氧物歧化酶。
超氧物歧化酶标准品
用于制作标准曲线，以便后续计算超 氧物歧化酶活性。
实验方法
01
02
03
酶液提取
将植物组织破碎后，加入 磷酸缓冲液，搅拌均匀后 离心，取上清液作为酶液。
酶活性测定
采用分光光度法，在特定 波长下测定反应后溶液的 吸光度值，计算超氧物歧 化酶的活性。
植物组织中超氧化物歧化酶活性测定
植物组织中超氧化物歧化酶活性测定植物组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定是一项重要的生物化学实验，它有助于了解植物体内抗氧化系统的运行机制及其在应对环境压力中的作用。
以下是测定植物组织中超氧化物歧化酶活性的实验步骤和注意事项。
一、实验材料1.实验植物：选择新鲜、健康的植物组织，如叶片、根或茎。
2.实验试剂：包括磷酸缓冲液（pH 7.8）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氮蓝四唑（NBT）、核黄素、酶提取液等。
3.实验设备：包括分光光度计、离心机、研钵、试管、滴定管等。
二、实验步骤1.酶提取：将植物组织研碎，加入适量的酶提取液，充分研磨并混合均匀，然后置于离心机中以3000-4000 r/min的速度离心10-15分钟，得到清亮的上清液。
2.酶活性测定：取3毫升磷酸缓冲液、0.1毫升的EDTA、0.1毫升的氮蓝四唑（NBT）、0.1毫升的核黄素和0.002毫升的酶提取液，混合均匀后用分光光度计在560纳米处测定吸光度。
3.空白对照：取3毫升磷酸缓冲液、0.1毫升的EDTA、0.1毫升的氮蓝四唑（NBT）和0.1毫升的核黄素，混合均匀后用分光光度计在560纳米处测定吸光度。
4.数据记录：记录酶活性测定和空白对照的吸光度值，并计算超氧化物歧化酶活性。
三、注意事项1.实验过程中要保证所用试剂的纯度和新鲜度，避免影响实验结果。
2.离心机使用前应预热，保证离心的效果和效率。
3.在酶活性测定中，加入酶提取液时应十分小心，避免产生气泡，影响吸光度的测定。
4.在整个实验过程中要保证温度、光照等环境因素的一致性，以减小误差。
5.在数据处理时，应按照公式计算超氧化物歧化酶活性，并进行统计分析和比较。
四、结果分析通过对实验数据的分析，可以得出不同植物组织中超氧化物歧化酶活性的大小及其变化规律。
这些数据可以帮助我们了解植物体内抗氧化系统的运行机制及其在应对环境压力中的作用。
例如，当植物受到逆境条件的影响时，超氧化物歧化酶的活性可能会发生变化，通过比较不同植物组织的超氧化物歧化酶活性，可以筛选出抗逆性较强的植物品种，为农业生产提供参考。
植物超氧化物歧化酶活性测量
植物超氧化物歧化酶活性测量一、实验目的及要求（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
二、实验原理超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2. 大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，糖果组合组织或者细胞破碎后，可用Ph7.8的磷酸缓冲液提取。
邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。
邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40秒-3分钟这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。
三、实验材料、仪器设备及试剂1、实验材料：大蒜2、仪器：离心机3、试剂：(1)磷酸缓冲液（pH7.8, 0.05mol/L）)(PH8.3 Tris-HCl )（2）浓盐酸(3)邻苯三酚（50mmol.L-1）：称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
(5) 考马斯蓝G-250：100mg 考马斯蓝G250溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%(W/V)正磷酸，用蒸馏水稀释至1L，过滤。
（6）牛血清蛋白（1mg/100ml, 即ml=1 l）四、实验方法1、材料准备：每组30g大蒜，加入90 ml pH7.8 0.05 mol/L 磷酸缓冲液，匀浆机匀浆，两层纱布过滤，冷冻离心（5000 rpm，20min）得清液测体积，取少量清液进行SOD活性测量。
2、将上清液置于60℃20min,使杂蛋白变性，然后5000r.min-1冷冻离心20min，取上清液测体积，并进行SOD活性测量。
3、SOD活性测定（邻苯三酚法）采用改良的邻苯三酚自氧化法。
邻苯三酚自氧化速率为325 nm, 0.070D /min左右,以 1 mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚的速率达到50%的酶量作为一个酶活力单位(U)。
植物组织中超氧物歧化酶活性测定
3 试剂：
0.05mol/L 磷酸缓冲液 磷酸缓冲液（pH7.8）； NBT反应液：含1.3µmol/L核黄素， 反应液： 核黄素， 反应液 核黄素 13mmol/L甲硫氨酸，63µmol/L氮蓝四唑， 甲硫氨酸， 氮蓝四唑， 甲硫氨酸 氮蓝四唑 0.05mol/L磷酸 磷酸（pH7.8） 磷酸
四、 实验步骤
实验七、 实验七、植物组织中超氧化物 歧化酶的活性测定
一、实验目的
氮蓝四唑（NBT） 掌 握 氮蓝四唑（NBT）法 测 定 SOD 酶 活 性。
二、实验原理
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被 在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原， 还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙， O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在 560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑 560nm处有最大吸收。 SOD可清除O 处有最大吸收 可清除 制了甲腙的形成。于是光还原反应后， 制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液 蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。 蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。 据此可以计算出酶活性大小。 据此可以计算出酶活性大小。
五、实验结果计算
SOD总活性 SOD总活性 = u/g(FW)=
( A ck − A E ) × V A ck × 0 . 5 × W × a
单位：酶单位/g鲜重表示； 单位：酶单位/g鲜重表示； /g鲜重表示 Ack —照光对照管的光密度值； 照光对照管的光密度值； AE —样品管的光密度值； 样品管的光密度值； 样品管的光密度值 V —样液总体积（ml）； 样液总体积（ ）； 样液总体积 a —测定时样品用量（ml）； 测定时样品用量（ ）； 测定时样品用量 W —样重（g）； 样重（ ）； 样重
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指导老师：王小燕
一、实验原理
超氧化物歧化酶（ 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、 ）普遍存在于动、 植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应： 植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应： 2O +2H →H O +O 本反应产物H 可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。 本反应产物 O 可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。 本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT） 本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原 作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原， 作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原， 被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基， 被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基， 超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在 处有最大吸收。 可清除超氧阴离子自由基， 处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙 可清除超氧阴离子自由基 的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低， 的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反 之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
三、实验步骤
1、酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶 脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷 酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使 终体积为5ml。取1.5－2ml于1000r/min下 离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2、显色反应 取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为 测定管，另2支为对照管，按下表加入各种 溶液： 各溶液显色反应用量
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料 水稻或小麦叶片。 （二）仪器设备 高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx）， 试管或指形管数支。 （三）试剂 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。 （2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。 （3）750µmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光 保存。 （4）100µmol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至 1000ml。 （5）20 µmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。
The end.
混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于 4000lx日光下反应20min（要求各管受光情 况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。 3、SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管作空白， 分别测定其他各管的吸光度。
四、结果计算
已知SOD活性单位以抑制NBT光还原的50％为一 个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。 SOD总活性＝ 式中：SOD总活性以鲜重酶单位每克表示；比活 力单位以酶单位每毫克蛋白表示；A 为照光对照 管的吸光度；A 为样品管的吸光度；V为样品液总 体积ml，V 为测定时样品用量ml；W为样鲜重g； 蛋白质含量单位为mg/g。