第05章第四节生物样品分析方法的基本要求

第四节
生物样品分析方法的 基本要求
二、Βιβλιοθήκη Baidu品的储存
血浆和血清都必须在采血后即时分离。否则，血凝 后冰冻保存，则因冰冻时引起细胞溶解，而阻碍血浆 或血清的分出，同时因溶血而影响药物浓度变化。 冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1~2d)
冷冻—冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃) 中长期保存
尿样宜立即测定，否则应加入防腐剂或低温冷藏。
（1）液-液萃取（liquid-liquid extraction,LLE） 亲脂性的药物与强极性的内源性水溶性物质，通 过有机溶剂可以除去大部分干扰性物质。 注意： 1)所用溶剂对被测组分溶解度大,与水不混溶,无毒, 化学稳定,不易乳化。 常用：乙醚，叔丁基甲醚，氯仿，乙酸乙酯等 2）有机相：水相=1：1（2：1） 3）水相最佳pH值的选择与药物的pKa有关．
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
重要性： 为了达到药物在临床上的使用安全、合 理和有效，人们越来越要求了解和提供 药物在体内的更多信息，即需要对药物 及其制剂的体内吸收、分布、代谢和排 泄过程、作用机制及药物效应进行研究， 从而为药品生产、临床医疗、实验研究 等方面对所研究的药物作出估计与评价， 对药物的改进与发展作出贡献。
定义：
生物样品内药物分析，又称体液药 物分析、生物药物分析，是通过分析手 段了解药物在体内数量与质量的变化， 获得各种药物动力学参数，代谢的方式 和途径等信息。
任务： 1）进行体内各种体液、组织，器官和排泄物中药物及 代谢物的分离测定。 2）进行新测定方法的研究、开发，以供临床常规测定 之用。 3）进行分析质量管理工作，提高测定技术和效率，以 便获得迅速，准确，可靠的测定结果。 4）进行方法学研究，及时为相关学科的研究提供合理 的最佳分析条件与方法，估计、评定各种方法能达到 的灵敏、专属和准确的程度。 5）参与相关学科研究中对获得的分析结果的阐明工作， 使所得的测定数据更有助于说明问题。
生物样品分析方法的 基本要求
三、生物样品分析前处理技术 (一) 蛋白质的去除 （二）缀合物的水解 （三）有机破坏 （四）分离、纯化和浓集 （五）化学衍生化法
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
(一) 蛋白质的去除 目的： 1）使于蛋白质结合的药物释放出来，以便准确地测定药 物及其代谢产物的浓度。 2）减免后续溶剂萃取过程中乳化现象 3）保护仪器性能
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
三、生物样品分析方法的验证
(五) 稳定性 1）短期室温条件下的稳定性考察 2) 长期低温条件下的稳定性考察 3) 冷冻－解冻（冻融）稳定性考察
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
三、生物样品分析方法的验证
(六) 质量控制 ＱＣ样品 （七）测定结果
详细记录实验过程和结果
思考题
十二、简述体内药物分析的对象及特点。 十三、生物样品分析前处理技术有哪些?简 述各自特点。 十四、试比较一般分析方法与体内药物分 析方法验证内容有何异同？各有何特点？
习
题
十五、用重铬酸钾法测得FeSO4.7H2O中铁 的含量为：20.03%,20.04%,20.05%和 20.06%计?算1)分析结果的平均值? 2)平 均偏差 3)相对平均偏差?4) 标准偏差5) 相对标准偏差[答案) 1)20.04%(2)0.12%(3)0.06%(4) 0.016%(5)0.08%)。
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
一、样品的种类
(二)尿样 尿药测定主要用于药物剂量回收，药物肾清除率、 药物体内代谢及 生物利用度研究，也可用于乙酰化代 谢快、慢型测定等。 尿样浓度与血样浓度相关性差。
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
一、样品的种类
(三)唾液 唾液中的药物浓度通常与血液浓度相关，可用唾液 中的药物浓度来反应血浆浓度。 唾液的采集一般是在漱口后15分钟，收集，离心后， 取上清液。
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
(五）化学衍生化法 1）使样品中的药物转化成具有可被分离的 性质 2）提高检测灵敏度 3）增强药物的稳定性 4）提高对光学异构体的分离能力
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
三、生物样品分析方法的验证
(一) 特异性 （二）标准曲线与线性范围 （三）精密度与准确度 （四）灵敏度 （五）稳定性
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
三、生物样品分析方法的验证
(一) 特异性 1）空白生物样本色谱图 2）空白样品＋标样 3）服药后生物样本色谱图
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
三、生物样品分析方法的验证
(三) 精密度与准确度 1）精密度 日内精密度（intra-day):同一天内，多次 测量的精密度． 日间精密度 (inter-day)不同时间内测 定结果的变异性．
应用——微量元素测定
方法
1．湿法破坏
2．干法破坏
3．氧瓶燃烧法
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
(四)分离、纯化与浓集 1、生物样本的分离与纯化 （1）液-液萃取（liquid-liquid extraction,LLE） （2）液-固萃取（liquid-solid,LSE）
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一 定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用
第四节
(二)
生物样品分析方法的 基本要求
缀合物的水解
尿中药物多呈缀合状态。一些含-OH，COOH，-NH3，-SH的药物可与内源性物质葡 萄糖酸或硫酸形成葡糖酸苷或硫酸缀合物。
1）酸水解 2）酶水解
第四节
(三) 有机破坏
生物样品分析方法的 基本要求
四、简述容量分析法的特点及计算公式？
五、紫外吸收光谱有什么特征？哪些特征和常数可作为 鉴定药物的定性定量指标？
思考题
六、简述紫外分光光度法在药品质量标准中的应 用。 七、简述HPLC法中系统适用性试验的意义与内容。 八、HPLC法定量的分析方法哪些？各人何特点？ 九、药物分析方法的选择原则？比较几种定量分 析方法的特点并指出适用范围。 十、简述准确度与精确度的定义以及它们之间的 关系？ 十一、什么叫有效数字？如何正确运用有效数字 的运算规则来表示分析结果？
习
题
十六、取维生素B2 20片,精密称得重量为 1.6011g，研细，精密称取片粉0.1518g， 置于１000ml量瓶中，溶解．于444nm波 长处测得吸收度为0.312,按C17H20N4O6的 吸光系数为323计算。求维生素Ｂ２的标 示百分含量（标示量５mg/ 片）．(101.9%)。
习
题
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
(一) 蛋白质的去除方法 1）加入与水混溶的有机溶剂
可使蛋白质分子内及分子间的氢键发生变化而 使蛋白质凝聚，进而使与之结合的药物释放出来。 常用有机溶剂:乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃
血样与溶剂体积比—1∶(1~3)可除去90%以 上蛋白质
第四节
2）加入中性盐
生物样品分析方法的 基本要求
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
三、生物样品分析方法的验证
(三) 精密度与准确度 2）准确度 绝对回收率：≥５０%. 相对回收率: 又称方法回收率
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
三、生物样品分析方法的验证
(四) 灵敏度 1）检测限(LOD): S/N=3时的被测物的浓度. 2) 定量限(LOQ):能满足测定３－５个半 衰期时样品中药物浓度或Ｃmax的1/101/20时的药物浓度．
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
一、样品的种类
凡是体内药物到达之处，如各种体液， 器官组织和排泄物等，都是体内药物分 析的对象。血液是最常用的生物样品。
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
一、样品的种类
(一)血液 (1)血浆 全血中加入抗凝剂(肝素、枸橼酸、草酸 盐、EDTA等），经离心后取上清液。 （2）血清 全血不加抗凝剂，由血液中纤维蛋白原 等影响下,引起血液凝结而析出的澄清黄色液体,离心 后取上清液。 （3）全血 加入抗凝剂混匀，以防凝血。
十七、称取维生素C 0.0500g,溶于100ml的 0.05mol/L硫酸溶液中，再量取２ml，准 确稀释至100ml,取此溶液在１cm石英池 中，于２4５nm波长处测得吸收度为 0.551,按吸光系数为560计算。求维生素 C的百分含量(98.4%)。
可使溶液的离子强度发生变化，能使蛋白质脱水后沉淀下 来，离心后可获得含有药物及其代谢物的上层清液。
常用中性盐—饱和硫酸铵、硫酸钠、
镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等 试剂用量—血清与饱和硫酸铵比例为1∶2时除去90% 以上的蛋白质
第四节
3）加入强酸
生物样品分析方法的 基本要求
使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而沉淀，条 件是pH值要低于蛋白质的等电点。 常用的强酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、 5%偏磷酸等 试剂用量——血清与强酸比例为1∶0.6时，除 去90%以上的蛋白质
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
4）加入含锌盐及铜盐的沉淀剂
当pH值高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子 中带负电荷的羧基与金属离子形成不溶性的 盐而沉淀。 常用沉淀剂—CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH 血清与沉淀剂比例—1∶(1~3)，
第四节
５）酶解法
生物样品分析方法的 基本要求
最常用蛋白水解酶：枯草菌溶素 可使蛋白质分解而放出药物。
思考题
一、简述含金属或含卤素，硫、磷、硒等特殊元素的药 物分析前处理方法有哪些？
二、简述凯氏定氮法的实验原理,操作过程及适用范围? 方法中为何要选用硼酸作吸收液?硼酸吸收液的浓度是 否需要标定?所取体积是否必须准确量取?改用硫酸或 盐酸用吸收液,行吗?
三、简述氧瓶燃烧法的实验原理、装置构成及适用范围？
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
(2）液-固萃取（LSE） 优点：1)引入杂质少 2）无乳化现象 3）萃取效率高，样品用量少 4）水作溶剂，安全性高 5）速度快，室温下操作 缺点：成本高，重现性稍差 分类：亲水性，疏水性
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
(３）生物样品在待测组分中的浓集 生物样品在萃取过程中，微量待测组 分往往分布于较大体积的萃取溶剂中， 不能直接供ＧＣ和ＨＰＬＣ测定。
第四节
生物样品分析方法的 基本要求
三、生物样品分析前处理技术
微量药物存在于大量生物介质中，若直接进 行测定，内源性物质可能干扰，药物浓度太低 将会达不到仪器灵敏度要求。因此，生物样品 中的药物必须经过分离、纯化与浓集，必要时 还需对待测组分进行化学改性处理，从而为最 后测定创造良好的条件。
第四节