叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体的分离与荧光观察.ppt
表面张力作用， 从而使细胞发生融合，
进而细胞质沟通，形成一个双核或多核 细胞
实验用品
1.器材：离心机，移液枪，水涡锅，载玻 片，盖玻片，血细胞计数板，刻度试管， 刻度吸管，电炉，冷冻离心管，显微镜， 烧杯， 吸管
2.试剂：Alsever溶液，GKN溶液，0.85% 生理盐水，50%PEG ，蒸馏水
红细胞膨胀 到一定程度时，细胞膜破裂， 即红细胞发生溶血.由于溶质透人速度不 同，溶血时间也不同。
实验用品
试剂：0.17 mol／L氯化钠，0.17 mol／L 氯化铵，0.17 mol／L硝酸钠，0.12 mol／ L硫酸 钠，0.12 mol／L草酸钠，0.12mol ／L醋酸钠， 0.32 mol／L葡萄糖，0.32 mol／L甘油，0.32 mol／L乙醇，0.32mol ／L丙醇。 仪器：显微镜，载玻片，盖 玻片，吸管，小烧杯，试管，试管架
50％PEG混合液： 称取少许PEG(Mw 6000)放人刻度离心管内，在沸水浴中加 热， 使其溶化，待冷却至50℃时，加入 预热至50℃ 的等体积的GKN液，混匀。 注意使用前配制。
实验方法
1.取新鲜的鸡血与Alsever溶液以1：4的 比例混匀，可在冰箱内存放一周（4℃）
2.取1ml贮存鸡血加入4ml0.85%生理盐水， 充分混匀800r/min,3min弃上清，重复离 心两次。
悬浮介质：通常用缓冲的蔗糖溶液，它 比较接近细胞质的分散相，在一定程度 上能够保持细胞器的结构和酶的活性。
詹纳斯活染：詹纳斯绿B是对线粒体专一 的、毒性很小的、活性染料，由于其碱 性，解离后
带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持 在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显 色，而细胞质中的染料被还原成无色。
实验二叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体荧光产生的机制
荧光产生
叶绿体在接受光能后，将能量转化为活跃的化学能，这个过程会产生荧光。荧光是一种光发射现象，发生在叶绿 素和其他色素分子吸收光能后。
荧光类型
根据荧光产生的机制，可以将荧光分为自发性荧光和诱导荧光。自发性荧光是指色素分子自发地吸收光能后产生 的荧光；诱导荧光是指通过外部刺激使色素分子吸收光能后产生的荧光。
叶绿体的分离
01
02
03
04
制备匀浆
将新鲜叶片洗净后剪碎，加入 适量的磷酸缓冲液，用匀浆器
充分研磨的转速和时间进行离心分离，
使叶绿体沉淀到底部。
吸取上清液
将上清液吸出，留下叶绿体沉 淀。
重悬浮
将叶绿体沉淀重新悬浮在适量 的溶液中，以便进行后续的荧
光观察。
实验二叶绿体的分 离与荧光观察
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握叶绿体的分离技术
叶绿体的分离
通过离心、密度梯度离心等技术，从植物组织中分离出叶绿 体。
叶绿体纯化
通过过滤、洗涤等步骤，去除杂质，获得纯度较高的叶绿体 。
了解叶绿体荧光的基本原理
叶绿体分离的原理与方法
原理
叶绿体分离主要依据其密度和大小差异进行。常用的分离方法有差速离心法和密度梯度离心法。差速 离心法是通过逐渐增加离心速度，使不同大小和密度的细胞器分批分离；密度梯度离心法则是在介质 中形成密度梯度，使不同密度的细胞器在梯度中停留并形成不同的区带。
方法
叶绿体分离通常包括细胞破碎、差速离心或密度梯度离心、洗涤和重悬浮等步骤。根据实验需求，可 以选择适当的方法分离纯化叶绿体。
叶绿体的分离及荧光观察
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态（基态）时释放出的光。
三、荧光显微镜的成像原理
01
保持固有的荧光特性
02
荧光波长＞激发波长
03
荧光强度极小于激发光的强度
04
有不同程度的衰减
05
荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
四、荧光的性质
五、荧光显微术应用
常用的细胞破碎方法
方法
技术
原理
效果
成本
举例
机 械 法
匀浆法
细胞被搅拌器劈碎或受剪切力而破碎
适中
适中
动植物组织或细胞
研磨法
细胞被研磨物磨碎
适中
便宜
植物组织
超声波法
用超声波的空穴作用使细胞破碎
剧烈
昂贵
细胞悬浮液小规模处理
珠磨破碎法
细胞被玻璃珠或铁珠捣碎
剧烈
便宜
细胞悬浮液和植物细胞大规模处理
化 学 法
渗透冲击
生物绘图 1．要求：细胞和组织绘图是根据显微镜下的观察内容绘制的，因此，首先要充分观察了解所绘材料的特点、排列及比例。选择有代表性的、典型的部位进行绘图。客观真实地反映材料的自然状态。即生物绘图要求具备高度的科学性和真实感，形态正确、比例适当、清晰美观。 2、用线条和圆点来完成全图。如，用线条描绘细胞壁与膜。用“点”表示明暗和颜色的深浅，给予立体感 3、不要只孤独的绘制一个细胞，要表现出显微镜下还有其他细胞的存在，
介质梯度应预先形成 ，离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面、底部或中间，离心后形成区带。
介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心自形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。
叶绿体的分离与荧光观察.ppt
实验原理
脂质体常用类脂如磷脂酰胆碱、磷脂酰 丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、胆固醇等制备。 其中最常用的是磷脂酰胆碱和胆固醇的 混合物。利用磷脂的双亲分子特性，加 入水相后形成囊状或液晶态，用超声波 处理，磷脂类双亲媒性分子被打碎为分 子或分子团，并自动重新排布成类似生 物膜的双分子层囊泡。
实验用品
器材 超声波清洗机、光学显微镜、旋涡混合
凝集素（lectin）是一类含糖的（少数除 外）并能与糖专一结合的蛋白质，它能 具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用， 凝集素使细胞凝集是由于他与细胞表面 的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的 结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制 细胞的凝集。
实验用品
1、材料：土豆块茎 2、器材和仪器：显微镜，粗天平，载玻
0.85％生理盐水：0.85g氯化钠溶于 100mL重蒸水中。
ALsver液： 葡萄糖 2.05g , 枸橼酸钠 0.8g , NaCl 0.42 加蒸馏水至100ml
GKN液： NaCl 8g ，KCl 0.4g , N0.a629HgP, O葡4萄·2H糖2O2g1,苯.77酚g ，红 N0.a0H1g2P溶O于4·H2O 1000ml蒸馏水中
3.弃上清再加4mlGKN溶液离心，加GKN 液，制成细胞悬液。
4.取上述细胞悬液1ml与刻度试管中，用 血细胞计数板计数，用GKN液将其调整 为5×106个/ml
5.取上述细胞悬液1ml于另一刻度试管中， 放入37℃水浴中，浴热20min，PEG液也 浴热20min
6、20min后，将0.5ml 50%PEG液逐滴沿 管壁加入到1ml细胞悬液中，边加入边摇 匀，然后再放入37℃水浴中保温20min。
2、记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发 荧光和次生荧光现象，分析结果 。
叶绿体的分离与荧光观察
04 实验操作流程
实验材料准备
01
02
03
新鲜植物叶片
选择健康、无病虫害的植 物叶片，如菠菜、豌豆等。
实验试剂
包括分离液、荧光染色剂、 缓冲液等。
实验仪器
包括离心机、显微镜、染 色皿、吸管等。
叶绿体的分离
将新鲜叶片洗净，剪成小段， 放入离心管中。
加入适量的分离液，轻轻摇晃 ，使叶片充分浸泡在分离液中
荧光显微镜的工作原理和使用方法
工作原理
荧光显微镜利用特定波长的光激发细 胞内荧光染料或荧光探针发出可见光 ，通过光学系统放大并显示在屏幕上 。
使用方法
使用荧光显微镜时，需要先对样本进 行染色或标记，然后将其置于显微镜 下观察。观察时需要调整光源和滤光 片，以获得最佳的荧光效果。
荧光观察技术在叶绿体研究中的应用
叶绿体形态观察
荧光染料或荧光探针可以标记叶 绿体，通过荧光显微镜观察叶绿
体的形态、数量和分布情况。
叶绿体功能研究
荧光染料或荧光探针可以结合叶绿 体中的色素或蛋白质，通过观察荧 光信号的变化来研究叶绿体的功能 和代谢过程。
叶绿体动力学研究
利用荧光探针标记叶绿体，可以观 察叶绿体的运动和分布情况，了解 其在细胞内的动力学特征。
荧光观察
在荧光显微镜下观察叶绿体，发现叶绿体发出强烈的绿色荧光，表 明叶绿体含有丰富的叶绿素。
细胞壁与细胞质的分离
通过实验操作，成功将细胞壁与细胞质分离，便于后续实验的进行。
结果分析
1 2
叶绿体分离效果
实验结果表明，采用离心和密度梯度离心法能够 获得较为纯净的叶绿体，分离效果较好。
荧光观察的意义
荧光观察能够直观地展示叶绿体的存在和状态， 对于研究叶绿体的功能和结构具有重要意义。
高中生物实验 叶绿体的分离和荧光观察 实验报告
实验十一叶绿体的分离和荧光观察一．实验目的了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。
了解提取叶绿体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的叶绿体的一般形态，增加对叶绿体的感性认识。
掌握吖啶橙染色叶绿体的方法。
掌握显微数码拍照的方法。
二．实验内容提取叶绿体，吖啶橙染色，观察染色结果。
显微数码拍照。
三．实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部。
叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/LNacl或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行。
离心后可得沉淀的叶绿体。
四．实验方法与步骤1．取嫩叶3g，洗净去柄去叶脉，剪碎放入研钵中。
2．加4ml0.35mol/LNacl，研磨匀浆，尼龙布过滤于离心管中1ml。
3．1000rpm离心2分钟弃去沉淀。
4．3000rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀用少量0.35mNacl悬浮。
5．提取叶绿体观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。
6．撕取叶表皮观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。
a．在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色椒榄形，在高倍镜下看到叶绿体内部含有较深的绿色的绿色小颗粒即基粒。
b．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光。
c．加入吖啶橙染后，叶绿体可发也桔红色荧光。
而其中混有的细胞核发出绿色荧光菠菜叶手切片观察。
d．在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞：为边缘吐锯齿表的鳞片状细胞。
保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。
叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。
5．显微数码拍照。
五．实验结果。
高中生物 实验四：叶绿体的分离与荧光观察
6.沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。 7.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光 学显微镜观察。使用荧光显微镜观时，将叶绿体悬液滴在 无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料， 盖上无荧光的盖玻片后即可观察。
8.观察叶绿体的形态结构、测量1~5个叶绿体的长轴和短
【ห้องสมุดไป่ตู้验原理】
某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光 能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间 内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就
称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体
内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧 光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧 光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧 光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用 荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。
实验四：叶绿体的分离与荧光 观察
【实验目的】
了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用 荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。
【实验原理】
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生 特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿 体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或 0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗 透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在 1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未 被破碎的完整细胞，然后，3000r/min离心，可 获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。在室温 下进行分离要迅速。
【仪器、材料与试剂】
仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微 镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，目镜测微尺，物镜测 微尺，恒温箱，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴 管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。 材料：菠菜叶片
叶绿体的分离纯化及荧光观察
叶绿体的分离纯化及荧光观察叶绿体是植物细胞中的一种细胞器，它是进行光合作用的主要场所。
叶绿体具有一定的自复制能力，可以独立分离出来，纯化叶绿体样品可以方便地进行进一步的实验研究。
本文将详细介绍叶绿体的分离、纯化以及荧光观察的方法。
一、叶绿体的分离1.实验材料准备为了分离叶绿体，我们需要充足的植物组织样品。
可以选择新鲜的叶片或者细胞培养物作为实验材料。
同时，需要准备好一系列试剂，例如缓冲液、葡萄糖、EDTA、PEG等。
2.组织破碎和提取液的准备首先，将植物组织样品冷冻在液态氮中，然后用超声波处理器将样品破碎。
接下来，将破碎的样品用缓冲液溶解，加入适量的葡萄糖和EDTA。
将溶解后的样品在低温条件下离心，然后取出上清液。
3.叶绿体的沉淀将提取液中的上清液用PEG逐渐沉淀叶绿体。
首先加入PEG溶液，并轻轻搅拌。
然后，将样品在低温条件下离心，离心后会出现一个绿色的沉淀。
这个沉淀就是叶绿体。
4.叶绿体的洗涤和纯化将叶绿体的沉淀用缓冲液洗涤数次，然后用离心将叶绿体沉淀下来。
最后，将沉淀的叶绿体用缓冲液悬浮，即可得到纯化的叶绿体样品。
二、叶绿体的荧光观察1.荧光探针的准备为了观察叶绿体的荧光，我们需要准备好合适的荧光探针。
通常使用的探针有二苯基苯酚（DPBF）和二聚(4-乙基-5-（4-甲基吡啶氧基）-2-溴脱氧葡萄糖（DAB）等。
2.荧光探针的添加将纯化的叶绿体置于含有荧光探针的溶液中，静置一段时间。
荧光探针会与叶绿体中的一些分子发生作用，从而产生荧光。
3.荧光观察使用荧光显微镜观察叶绿体的荧光。
将样品放置于荧光显微镜下，设置合适的激发波长和观察波长。
然后观察荧光显微镜中的图像，即可看到叶绿体的荧光。
4.结果分析通过观察叶绿体的荧光，可以得到关于叶绿体活性和光合作用效率的信息。
例如，如果观察到荧光强度较高，可以推测叶绿体的光合作用效率较低。
总结：叶绿体的分离、纯化及荧光观察是研究植物生物学和光合作用的重要方法之一、通过正确的操作流程和合适的实验材料，可以得到纯化的叶绿体样品，并通过荧光观察了解叶绿体的活性和光合作用效率。
叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体的分离及荧光观察【实验目的】1.学习使用差速离心法获取叶绿体2.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
3.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验原理】1.高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜，长径5—10um，短径2-4um，厚2-3um。
高等植物的叶肉细胞一般含50-200个叶绿体，可占细胞质的40%。
、叶绿体的数目因物种细胞类型，生态坏境，生理状态而有所不同。
在藻类中叶绿体形状多样，有网状，带状，裂片状和星形等等，而且体积巨大，可达100um.叶绿体由叶绿体外被，类囊体和基质3部分组成。
叶绿体含有3种不同的膜：外膜，内膜，类囊体膜和三种彼此分开的腔：膜间隙，基质和类囊体腔。
2.匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒。
收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心法：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。
3.差速离心法特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心用途：分离大小相差悬殊的细胞核细胞器沉降顺序：核——叶绿体，线粒体——溶酶体与过氧化物体——内质网与高尔基体——核蛋白体可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
【实验材料】1. 试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙。
2. 器具：粗天平、组织捣碎机、普通离心机、普通光学显微镜、荧光显微镜、500ml 烧杯、量筒、滴管、10ml刻度离心管、纱布若干，试管架、无荧光载玻片和盖玻片。
叶绿体分离和荧光观察
叶绿体的分离及荧光观察XXX,YYY,ZZZ一、实验目的：1通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法2观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速度取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
以此增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体分离应在等渗溶液中进行，以免渗透压改变使叶绿体损伤。
将匀浆在1000r/min 的条件下离心2分钟，以除去其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。
然后，在3000r/min 的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体。
分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照，；另外，在制作荧光显微镜标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。
三、实验用品：1、材料：新鲜菠菜2、试剂：0.35mol/L氯化钠溶液、0.01％吖啶橙。
3、器材：离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜、盖玻片、载玻片、烧杯等四、实验步骤：1、叶绿体的分离与观察：（1）取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗，称30g于150mL0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
（2）利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆3~5分钟。
（3）将匀浆用六层纱布过滤于500mL烧杯中。
（4）取滤液4ml在1000r/min下离心2分钟。
弃去沉淀。
（5）将上清液在3000r/min下离心5min。
弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。
（6）将沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。
叶绿体荧光观察实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解叶绿体的结构和功能。
2. 掌握荧光显微镜的使用方法。
3. 通过观察叶绿体的荧光，了解光合作用的过程。
二、实验原理叶绿体是植物细胞中进行光合作用的细胞器，其主要功能是利用光能将水和二氧化碳转化为有机物质和氧气。
叶绿体中含有叶绿素等色素，可以吸收光能，并在荧光显微镜下观察到其自发荧光和次生荧光。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜菠菜叶、蒸馏水、0.35mol/L氯化钠溶液、吖啶橙荧光染料、无荧光载片和盖片。
2. 实验仪器：组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜、烧杯、量筒、滴管、刻度离心管、纱布。
四、实验步骤1. 准备叶绿体悬液：取新鲜菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称量于蒸馏水中，装入组织捣碎机。
低速匀浆，将匀浆用纱布过滤于烧杯中。
2. 离心分离：每组取滤液进行离心，弃去沉淀。
将上清液在3000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，沉淀即含叶绿体（混有部分细胞核）。
3. 悬浮叶绿体：将沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。
4. 荧光显微镜观察：a. 直接荧光观察：取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光。
b. 间接荧光观察：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴吖啶橙荧光染料，加盖片后即可在荧光显微镜下观察叶绿体的次生荧光。
5. 菠菜叶手撕片观察：轻轻撕取新鲜嫩菠菜叶的表皮，展平置于载玻片上，加盖玻片后观察。
五、实验结果与分析1. 直接荧光观察：在荧光显微镜下，叶绿体呈现明亮的绿色荧光，表明叶绿体中含有叶绿素等色素。
2. 间接荧光观察：在荧光显微镜下，叶绿体呈现明亮的橙色荧光，表明叶绿体在吖啶橙荧光染料的作用下，发生了次生荧光反应。
3. 菠菜叶手撕片观察：在荧光显微镜下，菠菜叶表皮细胞呈现明亮的绿色荧光，表明菠菜叶表皮细胞中含有叶绿素等色素。
六、实验结论1. 叶绿体是植物细胞中进行光合作用的细胞器，其主要功能是利用光能将水和二氧化碳转化为有机物质和氧气。
叶绿体分离与荧光染色观察
组织碎片
叶绿体经激发光波照射后，自 叶绿体次生荧光的来由, 结 普通光学显微镜下观察到 发荧光呈现火红色，因叶绿体 橘红色为叶绿体的荧光
果 叶绿体的正常结构。离心 在其悬液中呈现点状均匀分 效果，叶绿体的悬液中混
分 不纯导致混有其他组织碎 布，且悬液其他组分无自发荧 有的细胞核碎片中的核
析片
光反应,故观察到斑状分布的 酸经丫啶橙染色荧光反
火红色荧光效果
应呈现绿色
六．思考与讨论
1.注意事项 (１）要得到完整的、有活性的叶绿体,须在低温下迅速提取,涂片后立即观察,注意离心时的
时间及强度。
(２）利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察室，会收到许多因素的影响,如温度、光、 淬灭剂等。因此在进行荧光观察时应抓紧时间,必要时应立即拍照。
(３）在制作荧光显微标本时最好使用物荧光载玻片、无荧光盖玻片香柏油。 2．思考题 （１)在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化? 有变化。因为叶绿体的颜色取决于发出荧光能量的高低，更换不同的滤片,激发光会不同， 叶绿体得到和辐射的能量就会不同，颜色也就会不一样 （２)游离的叶绿体和完整细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，颜色和荧光强度有无区别， 为什么? 有区别。因为完整细胞内的叶绿体还要进行光合作用，这会消耗掉一部分所吸收的光,所以 最后释放的荧光能量就会比游离核糖体所释放的小,颜色和荧光强度就会有差别。 (3）根据观察到的实验现象，简述自发荧光和次生荧光的区别？ 自发荧光指不需染色，只需在激发光照射下即可发荧光的现象，而次生荧光需要染色。因为 发光机制不同，所用的滤光片也会不同，最后发出的荧光颜色也会不同。 （4)叶绿体分离的原理是什么?操作过程应注意什么？ 采用的方法是差速离心法，利用不同颗粒大小、形状不同导致沉降速率不同,把叶绿体大小 的颗粒沉降出来。 叶绿体的分离应在等渗溶液（０．３5mol/L 氯化钠或０.4mol/Ｌ 蔗糖溶液）中进行，以免 渗透压的改变使叶绿体受到损伤;分离过程最好在０～4℃的条件下进行;如果在室温下，要 迅速分离和观察。 3.实验小结
叶绿体的分离与荧光观察实验报告
实验五叶绿体的分离与荧光观察姓名：俞华军班级：09级生科3班学号：200900140157 时间：2011/04/15一．实验目的1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
二．实验原理叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。
由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
沉降顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化氢酶体、内质网与高尔基体、核蛋白体。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000 r／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。
某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。
叶绿体的分离与荧光观察实验报告
山东大学实验报告姓名：徐静班级：10级生命基地学号：201000140121 科目：细胞实验题目：叶绿体的分离与荧光观察同组者：张姗田娜王安琪一．实验目的1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
二．实验原理叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。
由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
叶肉细胞中的叶绿体内含叶绿素，使植物呈现绿色。
叶绿体是细胞内扁平的椭球形或球形的三个双层膜细胞器之一，叶绿体内基粒是光合作用的场所。
高等植物（如葫芦藓）的叶绿体呈椭球状，在不同的光照条件下，叶绿体可以运动，改变椭球体的方向，这样既能接受较多的光照，又不至于被强光灼伤。
在弱光下，叶绿体以其椭球体的正面朝向光源；在强光下，叶绿体以其椭球体的侧面朝向光源。
因此，在不同光照条件下采集的葫芦藓,观察到其小叶内叶绿体的形状不完全一样。
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
沉降顺序为：细胞核线粒体溶酶体与过氧化氢酶体内质网与高尔基体核蛋白体。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000 r／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
叶绿体分离及荧光观察
称6g 于30ml的0.35mol/L NaCl 溶液中，于研钵中研 磨。 将匀浆液用6 层纱布过滤，收集于100m1 烧杯中。 取滤液4m1 在1000 r/min 下离心2min。弃去沉淀。 将上清液在3000 r/min 下离心5min。弃去上清液， 沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。 将沉淀用0.35mol/L NaCl 溶液悬浮。 取叶绿体悬液1 滴滴于载片上，加盖片后即可在普通 光镜下观察。 取一滴叶绿体悬液在无荧光载片上，再滴加一滴 0.01% 吖啶橙染液染色1min，盖上盖玻片，于荧光显 微镜下观察。可见叶绿体发出桔红色荧光，细胞核则 发出绿色荧光。
三、实验用品
1、材料：新鲜菠菜或其它植物叶片 2、器材：普通离心机，组织捣碎机，电子天 平，光学显微镜，烧杯，量筒，滴管，刻 度离心管，纱布若干，载玻片和盖片等。 3、试剂：0.35mol/L NaCl 溶液 0.01％吖啶橙
四、实验步骤
取材→捣碎匀浆→过滤→离心→悬浮 →制片→观察
选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，
某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下 吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能 在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如 可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光 现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射 后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素 的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它 吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧 光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实 验利用荧光显微镜对发荧range，AO） 是一种荧光色素，其激发滤光片波长 488nm。阻断滤光片波长515nm。它与细胞中 DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色 的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是 个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少， 发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物 质结合的位置多，故发红色荧光。
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叶绿体的分离及荧光观察
【实验目的】
1.学习使用差速离心法获取叶绿体
2.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
3.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验原理】
1.高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜，长径5—10um，短径2-4um，厚2-3um。
高等植物的叶肉细胞一般含50-200个叶绿体，可占细胞质的40%。
、
叶绿体的数目因物种细胞类型，生态坏境，生理状态而有所不同。
在藻类中叶绿体形状多样，有网状，带状，裂片状和星形等等，而且体积巨大，可达100um.
叶绿体由叶绿体外被，类囊体和基质3部分组成。
叶绿体含有3种不同的膜：外膜，膜，类囊体膜和三种彼此分开的腔：膜间隙，基质和类囊体腔。
2.匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒。
收集类叶绿体大小的颗
粒，得到叶绿体。
差速离心法：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。
3.差速离心法
特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心
用途：分离大小相差悬殊的细胞核细胞器
沉降顺序：核——叶绿体，线粒体——溶酶体与过氧化物体——质网与高尔基体——核蛋白体
可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
【实验材料】
1. 试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙。
2. 器具：粗天平、组织捣碎机、普通离心机、普通光学显微镜、荧光显微镜、500ml 烧
杯、量筒、滴管、10ml刻度离心管、纱布若干，试管架、无荧光载玻片和盖玻片。
3. 材料：新鲜菠菜。
【实验步骤】
1.选取新鲜嫩滤菠菜叶，去除叶梗及粗脉，洗净擦干，称30g于150ml0.35mol/L NaCI溶液中；
2.将叶和液同装入组织捣碎机中，匀浆3-5min，转速5000r/min；
3.将匀浆液用6层纱布过滤到500ml烧杯中；
4.取滤液4ml在1000r /min下离心2min；
5.取上层清液在3000r/min下离心5min（沉淀为叶绿体和细胞核混合物）；
6.将沉淀用2-3ml 0.35mol/L氯化钠液悬浮；
7.取一滴悬液滴片，加盖片后显微镜下观察。
8.另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，混匀，盖上盖片后，在荧光显微镜下观察。
【实验结果】
普通光学显微镜下对叶绿体的观察
图表1普通光学显微镜下菠菜叶的叶绿体（10*40）
普通光学显微镜下可看到：菠菜叶绿体呈绿色的橄榄形
因为离心不当，带有一定量的杂质
图表2普通光学显微镜下叶绿体局部放大图（10*40）
仔细观察可看到基粒——深绿色的小颗粒荧光显微镜下的叶绿体
图表3荧光显微镜下未被染色的叶绿体（10*40）
荧光显微镜下可观察到：未被染色的叶绿体自发荧光为火红色，呈点状分布，其他部分为黑色。
图表4荧光显微镜下已被染色的叶绿体（10*40）
吖啶橙染色后荧光显微镜下，对叶绿体的观察：叶绿体可发出桔红色荧光。
其他大部分，背景为绿色。
【实验结果分析】
1.普通光学显微镜下观察到的叶绿体呈绿色橄榄形，高倍镜下仔细观察可看到叶绿体部含
有深绿色的小颗粒——基粒。
另外还可以观察到形状较小且不规则的组织碎片，这是因为在离心过程中，因为离心不彻底造成叶绿体沉降物中含有其他组织碎片。
2.荧光显微镜下，叶绿体自发荧光为“火红色”，次生荧光为“桔红色”。
3.未染色的玻片在荧光显微镜下观察，叶绿体为“火红色”，呈点状分布，且背景为黑色。
这是因为叶绿体自身在悬液中呈点状分布，并且其中的叶绿素在经过激发光波照射后，可放出火红色的自发荧光，并且悬液中的其他成份不发生荧光反应
4.染色后的玻片在荧光显微镜下观察，叶绿体为“桔红色”，其中混有的细胞核碎片中含
有的核酸在吖啶橙的作用下呈绿色。
背景空白处为绿色，这是因为载玻片有杂质。
【实验注意事项】
1.荧光显微镜有两套光源系统，先在自然光源下调整好观察视野，再切换到荧光光源观察。
2.要注意正确的使用荧光显微镜：
（1）不要直接观察激发光源，保护眼睛
（2）荧光染料有一定毒性，要做好防护
（3）观察荧光受多种因素的影响，如温度、光、淬灭剂等
（4）在荧光观察时应抓紧时间，立即拍照，防止荧光会发生淬灭，造成整体发红。
（5）荧光显微镜不能随意开关，汞灯开启15分钟之不能关闭。
3.叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L NaCl）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受
损伤；
4.制作装片，滴加悬液时，先用吸管吹匀悬液，滴加时，不能滴加太多，若滴加过多的话，
则用滤纸片吸取多余液体，否则，观察目标在镜头下漂浮，不方便观察。
5.吖啶橙可染细胞核，对人体危害比较大，不能用手直接接触。
6.离心管必须等量，对称地放入离心机中；
7.分离结束后，先关闭离心机，在离心机彻底停止转动后，才可打开离心机，取出试样。
8.差速离心法不能得到完全纯净的叶绿体，要想获得更纯的叶绿体，可以用密度梯度离心
法。
9.制片时注意所取的悬液尽量适量，保证视野中的叶绿体的数量。
【实验反思】
1.叶绿体的稀释倍数要恰当，数量太少在荧光显微镜下难以观察到。
我们组一开始制作的
玻片中因为叶绿体数量太少，在荧光显微镜下几乎观察不到叶绿体的存在；
2.通过这次试验，我较为清楚的知道了荧光的相关概念和荧光显微镜的使用方法及相关注
意事项，知道了以后进入实验室，必须具备丰厚的知识和熟练的操作技能，这样才能将实验做成功。