实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
百泰派克生物科技
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
在蛋白组学研究中，如果要对某一混合体系中的蛋白质进行定性或定量分析，就需要先对蛋白组分进行分离、纯化，然后再进行后续的鉴定分析。
这一系列实验环环相扣，每一步都至关重要，直接影响实验结果的准确性。
理想的蛋白质分离技术首先要有超高的分辨率，能够将成千上万不同类型的蛋白质包括它们修饰物进行有效的分离。
目前常用的蛋白质分离技术包括一维/二维凝胶
电泳技术、双向电泳技术以及凝胶色谱技术等。
经分离的蛋白质需要进行纯度检测来评价是否含有其他杂蛋白或者杂质，通常利用聚丙烯电泳法、免疫化学法、沉降速率测定法、色谱法、质谱法等进行纯度检测。
对于含有杂质的蛋白需进行纯化，如含有核酸、糖类或脂类杂质，可以利用核酸沉淀法或有机溶剂沉淀法对杂质进行去除。
对蛋白质进行鉴定主要是基于其基本的理化参数对其进行鉴定，包括相对分子量、等电点、翻译后修饰、氨基酸序列以及高级结构等，可以选择单一的性质进行鉴定，也可以进行全面分析，根据实验需求进行选择。
百泰派克生物科技基于先进的质谱仪以及专业的技术团队提供蛋白质分离纯化及鉴定一站式技术服务，包括蛋白样品分离、纯化、纯度鉴定以及定性和定量鉴定，还可提供定制化分析服务，满足不同的实验需求，欢迎免费咨询。
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定-10-10
（三）分离纯化的一般程序
选择材料 生物大分子的分离纯化一般 可分为以下几个阶段： 可分为以下几个阶段： ①材料的选择和预处理 破碎细胞及提取（ ②破碎细胞及提取（有时还 需要进行细胞器的分离） 需要进行细胞器的分离） 分离纯化： ③分离纯化：包括粗分级分 离和细分级分离 其中前两个阶段为生物大分 子分离纯化的前处理。 子分离纯化的前处理。 破碎细胞 提取 分离纯化 分析及鉴定
脱水 阳离子
带负电荷蛋白质 （疏水胶体）
蛋白质聚集沉淀 蛋白质聚集沉淀
中性盐的选择
常用的中性盐： 常用的中性盐：(NH4)2SO4 1) 溶解度大： 溶解度大： 0℃ 70.6 70. 4.9 1.6 20℃ 20℃ 75.4 75. 18.9 18. 7.8 80℃ 80℃ 95.3 95.01
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
水化膜
带正电荷蛋白质 亲水胶体） （亲水胶体）
+ + + + + + ++ +
碱 酸
等点电时的蛋白质 亲水胶体） （亲水胶体）
碱 酸
带负电荷蛋白质 亲水胶体） （亲水胶体）
脱水 + + + + + + ++ +
带正电荷蛋白质 （疏水胶体）
脱水 阴离子
不稳定蛋白颗粒
二．特点
1、高效能 、 2、高度选择性 、 3、高灵敏度 、 4、操作简单 、 不足之处：定量精确， 不足之处：定量精确，但定性较差
三、色谱的种类
气－液色谱 气相色谱 气－固色谱 色谱 液－液色谱 液相色谱 液－固色谱
按原理分类
1、吸附色谱法 、 2、分配色谱法 、 3、离子交换色谱法 、 4、凝胶色谱法 、 5、亲和色谱法 、
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
蛋白质的表达、分离、纯化实验
蛋白质的表达、分离、纯化实验蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。
实验方法原理携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
实验材料：大肠杆菌BL21试剂、试剂盒：LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer Elution Buffer IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠仪器、耗材：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒实验步骤一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。
2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。
3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。
4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
蛋白质的分离、纯化和鉴定
三、蛋白质的胶体性质与蛋பைடு நூலகம்质沉淀
蛋白质是亲水胶体。 1. 蛋白质是亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。
球状的水溶性蛋白疏水基团借疏水作用聚合在分 子内部， 子内部，而亲水基团则分布于表面与周围水分子 结合形成水化层； 结合形成水化层； 水化层 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 双电层
影响盐析的因素有： 影响盐析的因素有： 温度 pH值 值 蛋白质浓度 常用的中性盐主要有硫酸铵， 常用的中性盐主要有硫酸铵，优点是温度系数小而溶 解度大 。
※ 有机溶剂沉淀反应
：用与水互溶的乙醇、丙酮等夺取 用与水互溶的乙醇、
水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用， 水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用，使 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、作 用时间和沉淀温度有关。 用时间和沉淀温度有关。 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在 ～ ℃ 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温 下进行，丙酮用量一般 倍于蛋白质溶液体积 倍于蛋白质溶液体积。 下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外， 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙 醇沉淀。 醇沉淀。
（2）不可逆沉淀
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可 能再重新溶解于水。 能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。
蛋白质分离纯化及鉴定
蛋白质具有多种生物活性，通过分离纯化及鉴定具有特定功能的蛋白质，
可以研发功能性食品，满足消费者对营养和健康的需求。
03
食品添加剂生产
一些蛋白质可作为食品添加剂用于生产，如乳清蛋白、大豆蛋白等。蛋
白质分离纯化及鉴定有助于优化生产工艺，提高产品质量。
在环境科学领域的应用
环境污染监测
蛋白质在不同环境中的表达会发生变 化，通过分离纯化及鉴定蛋白质，可 以监测环境污染状况、评估环境质量。
生物治疗
蛋白质在生物治疗中具有重要作用，如酶替代疗法、免疫 治疗等。蛋白质分离纯化及鉴定有助于筛选和优化治疗性 蛋白质，提高治疗效果。
在食品工业领域的应用
01食品成分分析来自蛋白质是食品的主要成分之一，通过分离纯化及鉴定蛋白质，可以分析
食品的营养成分、品质和安全性，为食品加工和质量控制提供依据。
02
功能性食品研发
VS
应用
适用于分离不同分子大小的蛋白质，常用 于高度纯化蛋白质和去除杂质。
03
蛋白质鉴定技术
蛋白质的质谱鉴定技术
质谱鉴定技术
利用质谱仪对蛋白质进行检测和鉴定，通过测定蛋白质的分子量 和部分氨基酸序列，确定蛋白质的种类和结构。
优势
高灵敏度、高分辨率和高准确性，能够同时测定多个蛋白质，广泛 应用于蛋白质组学研究。
蛋白质分离纯化的方法分类
大规模分离、微量分离等。
根据样品量分类
粗分离、部分纯化、高度 纯化等。
根据纯度要求分类
电泳法、离心法、色谱法 等。
根据分离原理分类
02
蛋白质分离纯化技术
蛋白质的沉淀技术
盐析法
利用高浓度的盐离子与蛋白质结合，使蛋白质在水中的溶解度降低而析出。常用的盐析剂包括硫酸铵 、氯化钠等。
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验一、实验内容将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度；将粗提液通过Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度；将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。
二、实验过程：1.蛋白质粗提液制备溶液配制：0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液（1）1000ml 0.1mol/L磷酸氢二纳；磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中，定容至1L；（2）250mL2.蛋白质浓度测定（1）溶液配制1mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）标准溶液：5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中；考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，避光保存。
（2）0~100ug/mL标准曲线测定：取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2mL蛋白质浓度0 20 40 60 80 100µg/ml1mg/mL BSA溶0 40 80 120 160 200液（µl）蒸馏水（µl）2000 1960 1920 1880 1840 1800总体积（µl）2000 2000 2000 2000 2000 2000测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值（OD595）：500uL蛋白质溶液与2.5mL 考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，每个溶液3次重复测定。
以OD595值（3次重复的平均值）为X，蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线Y=aX+b，R=？。
（3）测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释100倍（2mL），取稀释液500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，以500uL 蒸馏水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均值计算其浓度。
蛋白质的鉴定实验报告
蛋白质的鉴定实验报告
《蛋白质的鉴定实验报告》
在生物化学实验室中，蛋白质的鉴定是一项非常重要的工作。
蛋白质是生命体系中的基本组成部分，它们在细胞内发挥着重要的功能，因此对蛋白质的鉴定需要精确的实验方法和技术。
本次实验旨在利用凝胶电泳技术对样品中的蛋白质进行鉴定。
首先，我们需要将待测样品进行蛋白质提取，并进行浓缩和纯化处理。
接着，利用凝胶电泳技术将样品进行分离，根据蛋白质的大小和电荷特性，我们可以清晰地观察到不同蛋白质的迁移情况。
最后，通过染色和显影处理，我们可以对蛋白质进行定量和定性分析，从而得出样品中蛋白质的组成和含量。
在实验过程中，我们需要严格控制实验条件，确保样品的处理和分离过程不受外界因素的干扰。
同时，对实验结果进行准确的解读和分析也是至关重要的。
只有通过科学的实验方法和严谨的数据处理，我们才能得出可靠的蛋白质鉴定结果。
通过本次实验，我们成功地对样品中的蛋白质进行了鉴定，并得出了详细的实验报告。
这些数据和结果将为我们进一步研究蛋白质的功能和作用提供重要的参考和依据。
同时，我们也不断总结和完善实验方法，以提高蛋白质鉴定的准确性和可靠性。
总之，蛋白质的鉴定实验是生物化学领域中的重要工作，它为我们深入了解生命体系的基本组成和功能提供了重要的技木支持。
通过不懈的努力和实践，我们相信蛋白质的鉴定技术将不断得到完善和提高，为生命科学研究带来更多的突破和进展。
蛋白质的分离纯化实验报告
蛋白质的分离纯化实验报告一、实验目的1、掌握蛋白质分离纯化的基本原理和方法。
2、学会运用不同的技术手段对蛋白质进行提取、分离和纯化。
3、熟悉蛋白质纯度鉴定的常用方法。
二、实验原理蛋白质是生物体中重要的大分子化合物，其分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要前提。
蛋白质的分离纯化主要依据其物理化学性质的差异，如分子大小、电荷、溶解度、亲和力等。
常见的分离纯化方法包括：1、盐析法：通过向蛋白质溶液中加入中性盐，如硫酸铵，使蛋白质溶解度降低而沉淀析出。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶颗粒的多孔网状结构，根据蛋白质分子大小进行分离。
3、离子交换层析：基于蛋白质所带电荷的不同，在离子交换树脂上进行吸附和解吸。
4、亲和层析：利用蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离。
三、实验材料与设备1、材料新鲜的动物组织（如肝脏）各种试剂，包括硫酸铵、磷酸盐缓冲液、离子交换树脂、亲和配体等。
2、设备离心机层析柱紫外分光光度计电泳仪四、实验步骤1、蛋白质的提取将新鲜的动物组织剪碎，加入适量的磷酸盐缓冲液，在冰浴中匀浆。
低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集上清液，即为粗提的蛋白质溶液。
2、盐析沉淀在上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，使其饱和度逐渐增加到 50%。
搅拌 30 min 后，低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集沉淀。
3、凝胶过滤层析装柱：将凝胶颗粒填充到层析柱中，用缓冲液平衡柱子。
上样：将盐析沉淀溶解后，缓慢上样到层析柱中。
洗脱：用缓冲液进行洗脱，收集不同洗脱峰的流出液。
4、离子交换层析装柱：将离子交换树脂填充到层析柱中，用起始缓冲液平衡柱子。
上样：将凝胶过滤层析收集的样品上样到离子交换层析柱中。
洗脱：采用梯度洗脱的方法，逐渐改变缓冲液的离子强度，收集洗脱峰。
5、亲和层析装柱：将亲和配体偶联到层析介质上，填充到层析柱中，用平衡缓冲液平衡柱子。
上样：将离子交换层析收集的样品上样到亲和层析柱中。
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
生物化学中的蛋白质表达和纯化
生物化学中的蛋白质表达和纯化蛋白质是细胞中最基本的生物大分子之一，具有重要的结构和功能作用。
在生化实验研究中，常常需要大量的蛋白质作为实验材料。
蛋白质表达和纯化技术是生物化学研究中的关键技术之一。
本文将简要介绍蛋白质表达和纯化的原理和方法。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是将目的基因转录成RNA后再翻译成蛋白质的过程。
蛋白质表达主要有原核细胞和真核细胞两种方法。
原核细胞表达系统主要利用大肠杆菌，真核细胞表达系统则使用哺乳动物细胞，其主要的表达技术有以下几种：（一）重组蛋白质大规模表达重组蛋白质是指人为构建的同源或异源蛋白序列，利用基因工程技术将其导入到表达宿主中进行高效表达的蛋白质。
大肠杆菌是目前最常用的宿主。
一般来说，要将目的基因插入到选择性表达载体中，选用合适的启动子和终止子，将目的蛋白质与标签结合。
表达宿主随后被转化，蛋白质在生长过程中表达出来，随后进行纯化和鉴定。
（二）GST融合蛋白表达GST融合蛋白是利用GST (glutathione S-transferase)标签的蛋白质，将GST和目的蛋白质融合在一起表达，然后通过Glutathione 亲和层析纯化方法纯化目的蛋白质。
GST融合蛋白可以提高目的蛋白质的稳定性和可溶性，使得其在细胞内表达更加稳定。
（三）His标签蛋白表达His标签是一种聚组氨酸标签，可以与Ni2+螯合，因此可采用Ni2+亲和层析的方法纯化。
His标签融合蛋白表达时选择了较少的氨基酸标签，对目标蛋白的生物学性质和功能影响较小。
二、蛋白质纯化技术蛋白质表达和纯化是蛋白质生物化学研究的关键。
通常情况下，表达宿主细胞中的蛋白质必须经过纯化才能得到纯净的蛋白质，获得足够高纯度的蛋白质可用于测定其结构和功能。
（一）离子交换层析法离子交换层析法是利用蛋白质负荷（或正荷）的离子性质与相应的离子交换质团之间进行选择性结合的纯化方法。
离子交换层析法分为阴离子交换层析和阳离子交换层析两种。
实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定
实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定第一部分蛋白质的表达、分离纯化目的要求（1）了解重组蛋白表达的方法和意义。
（2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。
实验原理目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离纯化对理论研究和实验应用都具有重要的意义。
通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时目的基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。
大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。
本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白N端带有6个连续的组氨酸残基，可通过固相化的镍离子（Ni2+）亲和层析介质加以分离纯化，称为金属熬合亲和层析（MCAC）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
试剂和器材一、试剂[1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL。
[2] 氨苄青霉素：100mg/mL。
[3] 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 1 mM β-巯基乙醇,pH8.0。
[4] 清洗缓冲液(UWB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3。
[5] 洗脱液缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 500 mM 咪唑, pH8.0。
[6] IPTG二、器材摇床，离心机，层析柱（1 10 cm），蠕动泵操作方法一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株于5mLLB液体培养基中（含100μg/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。
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实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定
第一部分蛋白质的表达、分离纯化
目的要求
（1）了解重组蛋白表达的方法和意义。
（2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。
实验原理
目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离纯化对理论研究和实验应用都具有重要的意义。
通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时目的基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。
大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。
本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白N端带有6个连续的组氨酸残基，可通过固相化的镍离子（Ni2+）亲和层析介质加以分离纯化，称为金属熬合亲和层析（MCAC）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
试剂和器材
一、试剂
[1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL。
[2] 氨苄青霉素：100mg/mL。
[3] 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 1 mM β-巯基乙醇,
pH8.0。
[4] 清洗缓冲液(UWB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3。
[5] 洗脱液缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 500 mM 咪唑, pH8.0。
[6] IPTG
二、器材
摇床，离心机，层析柱（1 10 cm），蠕动泵
操作方法
一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导
1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株于5mL
LB液体培养基中（含100μg/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。
2. 转接1-5mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。
取1ml 培养物用于SDS-PAGE 分析。
3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L, 37℃继续培养1-3h.。
4. 12,000rpm 离心5 min, 弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化
1. Ni2+层析柱的准备：在层析柱中加入1mL Ni2+介质，并分别用8mL 去离子水，8mL 上样缓冲液（GLB）洗涤。
2. 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬，用振荡器轻柔的混匀样品60min, 4℃或室温12000rpm 离心30 min, 将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。
取10μl 上清样品用于SDS-PAGE 分析。
3. 上清样品以10-15mL/h 流速流经Ni2+层析柱，收集流出液，取10μl样品用于SDS-PAGE 分析。
4. 洗脱杂蛋白：用清洗缓冲液（UWB）50mL以10-15mL/h流速洗涤层析柱，去除杂蛋白，直至OD280 = 0.01，约3-4h，取10μl洗涤结束时的样品用于SDS-PAGE 分析。
5. 洗脱目标蛋白：用洗脱液缓冲液10mL洗柱，每管1 mL分部收集洗脱液，共收集6-10管，分别取10μl样品用于SDS-PAGE 分析。
第二部分蛋白质的鉴定
目的要求
（1）了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理。
（2）掌握凝胶电泳实验操作规程。
实验原理
电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。
在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
但如果加入某种试剂使电荷因素消除，则电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。
十二烷基硫酸钠（SDS）就具有这种作用。
在蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，蛋白质—SDS复合物带上相同密度的负电荷，并可引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液。
该凝胶包括积层胶和分离胶两部分。
当两电极间接通电流后，凝胶中
形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中的SDS多肽复合物向前推进。
样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。
由于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率，使蛋白依各自的大小得到分离。
试剂和器材
一、试剂
[1] 30％Acr－Bis贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。
[2] Tris-HCl/SDS，pH 6.8：在40mL水里加入6.05g Tris，0.4g SDS, 用1M HCl调pH 至6.8，补水至100mL。
[3] Tris-HCl/SDS，pH 8.8：在300mL水里加入，91g Tris，2g SDS, 用1M HCl调pH 至8.8，补水至500mL。
[4] 10% 过硫酸铵（现用现配）
[5] TEMED（商品试剂）
[6] 2×上样缓冲液：在40mL水里加入，1.52g Tris，20mL甘油，2.0g SDS，2.0mL 2-巯基乙醇，1mg溴酚蓝，用1M HCl调pH至6.8，加水至100mL
[7] 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱，94g甘氨酸（电泳级），50mL 10% SDS, 配至1000mL.
[8] 考马斯亮蓝染液：0.25g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇：水（1：1）和10mL冰乙酸的混合液中。
[9] 脱色液：水：乙酸：乙醇 = 6.7：0.8：2.5
二、器材
垂直板电泳槽,脱色摇床，移液管（1，5，10mL），烧杯（25，50，100mL），细长头的吸管，微量注射器（10µL或者50µL）。
操作方法
一、SDS聚丙烯酰胺凝胶的配置：
1. 安装玻璃板，检查漏液情况。
2. 制备分离胶：按表1分离胶所示，依次在试管中混合各成分，一旦加入TEMED后，凝胶马上开始聚合，故应立即快速混匀，迅速在两玻板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，注意流出浓缩胶所需空间。
并在其上覆盖一层水或异丁醇溶液。
将凝胶垂直放置于室温下。
1.分离胶聚合后（约30min），倒出覆盖层液体，用枪将残留液体吸净。
2.制备浓缩胶：按表1浓缩胶所示，依次在试管中混合各成分，一旦加入TEMED后，应立即快速悬动混合物，迅速在分离胶上灌注浓缩胶溶液，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的电泳梳，小心避免混入气泡。
将凝胶垂直放置于室温下。
二、上样样品的处理：
将样品置于1×上样缓冲液中，在100℃加热5min使蛋白质变性。
加热后8000rpm离心1min.
三、电泳：
1. 浓缩胶聚合完全后（约30min），将凝胶固定于电泳装置上，并加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，然后小心移出电泳梳。
2. 按预定顺序加样，小心缓慢加入样品，每样品加12μl。
3. 将电泳与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm,当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部（约1h），然后关闭电源。
4. 将玻璃板从电泳装置上卸下，并将凝胶取出，在第一点样孔侧的凝胶上切去一角以标注凝胶的方位。
四、考马斯亮蓝染色、脱色
1. 用染液浸泡凝胶，用保鲜膜封好，略微加热，放在水平摇床上染色15min, 重复加热染色1 次。
2. 移出并回收染液，将凝胶浸泡于脱色液中，用保鲜膜封好，略微加热，放在水平摇床上脱色30min,更换脱色液，直至检出蛋白质条带。
五、拍照分析
将脱色条带清晰的凝胶放到凝胶成像仪里，拍照并分析蛋白质的诱导，表达，分离纯化情况。