革兰氏染色标准操作程序
PH1237 标准革兰氏染色液实验与操作方法
PH1237|标准革兰氏染色液Standard Gramˊs StainCatalog No：PH1237Size：☐4×100mL|☐4×250mL Store at RT简介革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。
未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。
通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。
细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。
经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。
在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。
红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。
在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。
Standard Gramˊs Stain采用最经典的革兰染色配方,临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。
组份名称4×100ml4×250ml Storage试剂(A):结晶紫染色液100ml250ml RT避光试剂(B):Gram碘液100ml250ml RT避光试剂(C):脱色液100ml250ml RT试剂(D):沙黄染色液100ml250ml RT避光自备材料1、接种环或挑取细菌的其他工具2、酒精灯3、载玻片4、光学显微镜操作步骤(仅供参考)：1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，混合均匀，涂成一薄层。
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程细菌鉴定细菌形态学鉴定16S rDNA 鉴定生理生化鉴定一、细菌形态学鉴定1.从-80˚Ϲ冰箱中取出菌株放4˚Ϲ复苏，轻柔混匀后用接种环接一环菌液在培养基平板上划线活化，根据菌株来源选择适宜的培养基。
2.放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28˚Ϲ培养，特殊菌株依据该菌最适条件（时间、温度）培养24-48h。
3. 纯化：从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。
4. 观察记录菌落形态特征：大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，，形状干湿透明度颜色边缘细菌大小（mm）注意事项：①接种划线应在酒精灯旁边操作②培养时应倒置培养，防止污染二、革兰氏染色1.涂片固定将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。
注意事项：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。
固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.染色一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。
（2）加上碘液染色1分钟，水洗。
（3）加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。
（4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。
（5）吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。
3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。
注意事项：①标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。
若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。
②玻片通过火焰温度不能太高。
③碘液变透明，则不能使用。
④水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。
三、16S rDNA 鉴定（16S rDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种）1. 细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定3. 挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。
革兰氏染色及镜检sop
革兰氏染色及镜检SOP1. 目的规范革兰氏染色及镜检的标准操作规程，确保试验的准确性。
2. 范围本标准适用于革兰氏染色及镜检的操作。
3. 定义3.1.革兰氏阳性菌（G+）：G+的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成。
在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。
3.2.革兰氏阴性菌（G-）：G-的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高。
当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。
4. 职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。
4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。
4.3.质量总监负责本规程的批准。
4.4.QA负责本规程执行的监督。
5.引用标准无6. 材料6.1.仪器、实验用具：显微镜、载玻片、酒精灯、接种环。
6.2.试剂与配制革兰氏染色液、95%乙醇、香柏油、二甲苯和0.9%氯化钠溶液。
结晶紫溶液：称量2g结晶紫于研钵内研磨至粉末，将粉末倒入100ml烧杯中，量取95%乙醇20ml 将其溶解；草酸铵溶液：称量0.8g草酸铵于200ml烧杯中，量取80ml纯化水将其溶解；结晶紫染色液：将配好的结晶紫溶液倒入草酸铵溶液中，混匀，静置24h后过滤即成结晶紫染色液；此液不易保存，如有沉淀出现，需重新配制。
碘化钾溶液：称量2gKI粉末，转移至200ml烧杯中，量取100ml的纯化水将其充分溶解；碘溶液：称量1g碘颗粒于研钵内研磨至粉末，将粉末倒入500ml烧杯中，量取200ml纯化水倒入并碘染液：将配好的碘化钾溶液倒入碘溶液中，混匀即成。
配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。
沙黄溶液：称量0.25g沙黄于200ml烧杯中，量取95%乙醇10ml将其溶解；沙皇（番红）复染液：待沙黄溶液完全溶解后加纯化水定容至100ml，混匀即成。
细菌革兰氏染色法标准流程
细菌革兰氏染色法1.目的为镜检细菌形态结构提供样本2.范围适用于实验室常见细菌的抹片制备及染色3.采样对接人服务专家针对病死猪进行解剖根据临床症状采集相应的病料。
4.设备和材料无菌剪刀、无菌手术刀、无菌试管、无菌生理盐水、无菌平皿、三角烧瓶、酒精灯、接种环、打火机、75%酒精棉球、一次性手套、营养琼脂培养基、5％石炭酸液；；碘片；碘化钾； 95％酒精；碱性复红粉末；显微镜；试管架；酒精灯；接种环；药匙；称量纸；电子称；待试菌；灭菌蒸馏水；吸水纸；香柏油；灭菌玻片、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、打火机、擦镜纸、计时器5、采样及送样操作采集：病料新鲜度→无菌操作采样→有目的进行采样→保证组织完整性→独立存放到封口袋中并做好标记。
运输：采集好病料放入保温箱（泡沫纸箱+冰袋）中，冷藏即可，不可冷冻。
样品的标识要求有样品编号、样品名称、样品来源、样品数量、初步诊结果抽样日期及周龄、检测项目等内容。
6、细菌分离在无菌操作条件下，将待测病料（含有典型临床症状部分）用平板划线分离法接种于普通营养琼脂培养基或特殊培养基上（血琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、BP琼脂等），于37℃±1℃恒温培养箱中培养18-24h后备用。
7、操作步骤7.1细菌抹片的制备1、玻片准备：载玻片应清晰透明，洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。
如有残余油迹，可按下列方法处理：2、滴上 95％酒精 2～3 滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯上轻轻脱过几次。
3、若上述方法未能去除油渍可再滴 1～2 滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯上轻轻通过。
4、抹片：所用材料不同，抹片方法亦有差异5、液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳液）可直接用灭菌接种环取一环材料与玻片的中央均匀涂成适当大小的薄层。
6、不是液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置与玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。
革兰氏染色法操作规程
革兰氏染色法操作规程编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（革兰氏染色法操作规程）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为革兰氏染色法操作规程的全部内容。
革兰氏染色法操作规程1目的建立革兰氏染色法操作规程，确保革兰氏染色法操作规范化、科学化。
2范围适用于用革兰氏染色法对细菌进行分类和鉴定。
3职责3.1检验员:负责按本规程进行革兰氏染色操作.3。
2 QC主管、质量部经理：负责监督。
4内容4.1仪器与用具酒精灯、洁净的盖玻片、接种环、滴管、生物显微镜.4.2材料4。
2。
1试剂结晶紫、番红、碘化钾、碘、95%乙醇、草酸铵、香柏油。
4。
2.2试液及配制方法4.2。
2。
1 结晶紫染色液：称取结晶紫2g,溶于20ml 95％乙醇中；称取草酸铵0。
8g，溶于80ml水中；将两种溶液混合，静置48h后使用.4.2.2.2碘染色液：称取碘化钾2g，加5～10ml水使充分溶解，加碘1g，待完全溶解后，加水至300ml。
4.2.2.3 番红复染液：称取番红0.25g溶于10ml 95%乙醇中，然后加水100ml。
4。
3操作步骤4。
3.1 样品固片取一干净的载玻片，用接种环挑取一环无菌水于载玻片中,挑取少量菌于生理盐水中涂片或直接滴一滴待检菌在盖玻片中央，自然干燥固定.4。
3.2 初染滴加结晶紫染液于已固定的涂片上，染1min，用水冲洗、甩干。
4。
3。
3 媒染滴加碘染色液，液作用1min，用水冲洗、甩干。
4.3.4 脱色滴加95％乙醇脱色,置白色背景下，侧动盖玻片,直至无紫色脱落为止(约为20—30秒），立即用水冲洗、甩干。
4.3.5 复染滴加番红复染液,染1-2 min，用水冲洗、甩干.4.3.6 镜检置油镜下观察。
《革兰氏染色法》课件
将脱色后的涂片用番红染液复染，时间约为1-2分钟。番红是 一种酸性染料，可以和蛋白质结合，使菌体或细胞呈现红色 。
番红复染的作用是使菌体或细胞呈现红色，使其更加明显， 有助于观察和鉴别。同时，番红还可以与结晶紫形成鲜明的 对比，使观察更加准确。
冲洗与干燥
• 将染色完成的涂片用清水冲洗干净，然后晾干或用吸水纸吸干 水分。冲洗的目的是去除染色过程中残留的染料和媒染剂等物 质，以免对观察造成干扰。干燥的目的是使涂片固定，以便于 保存和观察。
背景
革兰氏染色法的发明对于细菌学的发展起到了重要的推动作 用，为后续的细菌分类、疾病诊断和治疗提供了有力支持。
染色原理
原理
革兰氏染色法的染色原理主要是通过 一系列的脱色处理和复染，使细菌着 色，从而根据颜色差异将细菌分为革 兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
操作流程
革兰氏染色法通常包括涂片、脱色、 媒染、染色和复染等步骤，通过这些 步骤的组合和调整，可以实现对不同 类型细菌的准确鉴别。
革兰氏染色法的结
03
果与意义
革兰氏阳性菌与阴性菌的染色特性
革兰氏阳性菌
被染成紫色或蓝紫色，不易被酒 精脱色，有厚重的革兰氏染色反 应。
革兰氏阴性菌
被染成红色或淡红色，易被酒精 脱色，有较弱的革兰氏染色反应 。
染色结果的分析与解读
根据染色结果判断细菌的种类和特性，有助于临床诊断和 治疗。
通过观察染色后细菌的形态和排列，可以初步判断细菌的 致病性。
重要性
革兰氏染色法对于临床医学、生物技术和食品工业等领域具有重要意义，能够 帮助科学家和医生快速准确地鉴别不同类型的细菌，从而采取相应的治疗和预 防措施。
发展历程与背景
发展历程
革兰氏染色法由丹麦细菌学家汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884 年发明，至今已有百余年历史。随着科学技术的不断进步， 该方法在操作流程和染料选择等方面不断得到优化和改进。
革兰氏染色液操作步骤及注意事项-资料类
革兰氏染色液操作步骤及注意事项－资料类关键信息项1、染色液的组成成分结晶紫染液碘液脱色液（乙醇或丙酮溶液）复染液（沙黄染液或番红染液）2、操作所需的器材载玻片酒精灯接种环显微镜染色缸吸水纸3、样本的准备要求细菌培养物的新鲜程度培养物的浓度涂片的厚度和均匀度4、染色的具体步骤初染媒染脱色复染5、操作过程中的注意事项染液的使用量和作用时间脱色程度的控制避免染液干燥样本的固定6、结果的观察与判断标准革兰氏阳性菌的染色特征革兰氏阴性菌的染色特征不确定结果的处理方法1、引言革兰氏染色法是细菌学中广泛应用的一种鉴别染色法，通过此方法可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。
为了确保革兰氏染色的准确性和可靠性，特制定本操作步骤及注意事项协议。
11 适用范围本协议适用于使用革兰氏染色液对细菌进行染色的实验操作。
2、染色液的组成成分21 结晶紫染液由结晶紫、乙醇和草酸铵溶液组成，用于初染，使细菌染上结晶紫的颜色。
22 碘液由碘和碘化钾组成，用于媒染，增强结晶紫与细菌细胞的结合力。
23 脱色液通常为乙醇或丙酮溶液，用于脱色，使革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌呈现出不同的颜色反应。
24 复染液常见的有沙黄染液或番红染液，用于复染，使革兰氏阴性菌染上复染液的颜色，增强对比。
3、操作所需的器材31 载玻片要求洁净、无油脂和划痕，以便于细菌涂片的制作和观察。
32 酒精灯用于加热固定细菌涂片，使其牢固地附着在载玻片上。
33 接种环用于挑取细菌培养物，制作涂片。
34 显微镜用于观察染色后的细菌形态和颜色，以判断其革兰氏染色结果。
35 染色缸用于分别容纳不同的染色液，保证染色过程的有序进行。
36 吸水纸用于在染色过程中吸干多余的染液，保持涂片的清洁。
4、样本的准备要求41 细菌培养物的新鲜程度应使用新鲜培养的细菌，通常培养 18 24 小时的细菌染色效果最佳。
42 培养物的浓度细菌浓度不宜过高或过低，过高会导致涂片过厚，影响观察；过低则可能导致染色结果不准确。
微生物学实验一、选择题革兰氏染色的关键操作步骤是：A.结晶紫染色
微生物学实验一、选择题1.革兰氏染色的关键操作步骤是：A.结晶紫染色B.碘液固定C.酒精脱色D.复染答:( )2.放线菌印片染色的关键操作是：A.印片时不能移动B.染色C.染色后不能吸干D.A和C答:( )3.高氏培养基用来培养：A.细菌B.真菌C.放线菌答:( )4.肉汤培养基用来培养:A.酵母菌B.霉菌C.细菌答:( )5.无氮培养基用来培养:A.自生固氮菌。
B.硅酸盐细菌C.根瘤菌D.A、B均可培养E.A、B、C均可培养答:( )6.在使用显微镜油镜时，为了提高分辨力，通常在镜头和盖玻片之间滴加:A.二甲苯B.水C.香柏油答:( )7.常用的消毒酒精浓度为:A.75%B.50%C.90%答:( )8.用甲醛进行空气熏蒸消毒的用量是:A.20ml/M3B.6ml/M3C.1ml/M3答:( )9.实验室培养基高压蒸汽灭菌的工艺条件是:A.121℃/30minB.115℃/30minC.130℃/30min答:( )10.巴氏消毒的工艺条件是:A.62-63℃/30minB.71-72℃/15minC.A.B.均可答:( )11.半固体培养基的主要用途是:A.检查细菌的运动性B.检查细菌的好氧性C.A.B.两项答：( )12.半固体培养基的琼脂加入量通常是:A.1%B.0.5%C.0.1%答:( )。
13.使用手提式灭菌锅灭菌的关键操作是:A.排冷气彻底B.保温时间适当C.灭菌完后排气不能太快D.A-C答:( )。
14.目镜头上的“K”字母表示:A.广视野目镜B.惠更斯目镜C.补偿目镜答:( )15.目镜头上的“P”字母表示:A.平场目镜B.广视野目镜C.平场补偿目镜答:( )16.物镜头上的“PL”字母表示:A.正低相差物镜B.正高相差物镜C.负高相差物镜答:( )17.物镜头上的“UVFL”字母表示。
A.无荧光物镜B.照相物镜C.相差物镜答:( )18.镜头上标有“TC”字母的镜头是:A.相差调整望远镜B.摄影目镜C.相差目镜答:( )19.“PA”表示:A.马铃薯培养基B.高氏培养基C.肉汤培养基答:( )20.无菌室空气灭菌常用方法是:A.甲醛熏蒸B.紫外灯照射C.喷石炭酸D.A.B.并用答:( )21.干热灭菌的关键操作是:A.灭菌物不能有水B.保温过程中不能开箱门C.降温不能太快答:( )22.霉菌水浸制片的关键操作是：A.菌丝要分散B.菌丝首先要用50%的乙醇浸润C.盖盖玻片不能有气泡D.A-C答：（）23.加热法染芽胞的染料通常是:A.孔雀绿B.结晶紫C.复红D.蕃红答:( )24.复红法染鞭毛的关键操作是:A.玻片干净B.染料新鲜C.菌体活化适当D.A、B、C答:( )25.镀银法染鞭毛的关键操作是:A.玻片干净B.染料无沉淀C.加热适当D.菌体活化适当E.A-D答:( )。
革兰氏染色基本原理、方法及临床意义
革兰氏染色一、目的：在细胞发放之前，利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测，判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
二、原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
三、实验用品准备：灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器四、操作：1 涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。
2 干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
3 固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。
4 初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
5 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
6 媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
细菌革兰氏染色PPT课件
目录
• 引言 • 革兰氏染色的基本原理 • 革兰氏染色的操作步骤 • 革兰氏染色的结果分析 • 革兰氏染色的应用和限制 • 结论
01 引言
目的和背景
目的
介绍革兰氏染色的原理、方法及应用，帮助学习者更好地了解和掌握这一基本 染色技术。
背景
革兰氏染色是细菌学中最经典、最常用的染色方法之一，通过对细菌的染色， 可以将其分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，对于临床诊断和治疗具有 重要的指导意义。
结合其他技术
将革兰氏染色与其他技术如分子生 物学、免疫学等相结合，实现更精 确的细菌分类和鉴别。06Βιβλιοθήκη 结论总结革兰氏染色的重要性
临床诊断的关键工具
革兰氏染色是临床微生物实验室的基 本技术，用于快速识别细菌种类，对 准确诊断感染和选择合适的治疗方案 至关重要。
指导抗生素选择
科研的基础
在科研领域，革兰氏染色是研究细菌 种群结构、进化、生态和致病性的重 要手段。
染色
染色
用革兰氏染色液对固定后的涂片进行 染色，分别使用结晶紫、碘液和脱色 液进行初染、媒染和脱色处理。
染色注意事项
染色时应按照规定的步骤进行，避免 染色过度或不足，同时要确保染色液 的新鲜度和浓度适宜。
脱色
脱色
用脱色液对染色后的涂片进行脱色处理，以 去除菌体表面的结晶紫和碘液。
脱色注意事项
脱色时应控制脱色时间和脱色液的用量，避 免脱色过度或不足，影响染色效果。
革兰氏染色的工作原理
革兰氏染色利用了细菌细胞壁的成分 和结构对染料亲和性的差异，通过结 晶紫初染和碘液媒染后，由于细胞壁 组成成分对革兰氏染料的吸附能力不 同，酒精脱色时，细胞壁对染料的吸 附能力不同，从而导致被脱色的程度 不同，最终影响了复染后细菌的着色。
(完整版)Hucker改良的革兰氏染色法
Hucker 改良的革兰氏染色法一、实验目的1、了解革兰氏染色法的原理及操作方法2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性3、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术4、掌握显微镜（油镜）的使用方法5、初步认识细菌的形态特征二、实验原理革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家Christain Gram创立。
细菌先经碱性染料结晶紫染色，而后经碘液媒染，用酒精脱色，革兰氏阳性菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。
革兰氏阴性菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。
三、实验器材1、设备：显微镜（尼康YS100、YS2-H；）2、材料：酒精灯、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、载玻片、盖片、擦镜纸、白纸、革兰氏染色液（结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红液）、生理盐水3、菌种：（1）大肠杆菌；（2）枯草芽孢杆菌四、实验步骤1、涂片取一块洁净载玻片，在载玻片的左、中、右3处各滴加一小滴无菌生理盐水，且均匀分布，用接种环以无菌操作分别从大肠杆菌和枯草芽孢杆菌斜面上挑取少许菌苔于左、右一水滴中，从大肠杆菌斜面和枯草芽孢杆菌斜面上各挑取少许菌苔同置于中间一水滴中，分别混匀并涂成薄膜。
2、干燥室温自然干燥。
3、固定涂面朝上，通过火焰2-3次。
4、初染滴加结晶紫液，以刚好将菌膜覆盖为宜，染色1-2min，水洗。
5、煤染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
6、脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇通过涂面脱色20-25s，直至流出液无色时，立即水洗。
7、复染用番红液复染约2min，水洗，晾干或用吸水纸吸干。
8、镜检镜检时先后用低倍镜、高倍镜和油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
细菌革兰氏染色法标准流程
细菌革兰氏染色法标准流程细菌革兰氏染色法是一种常用的鉴别染色法，它能够将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。
下面是细菌革兰氏染色法的标准流程：
1.涂片固定：将细菌培养物均匀涂布在玻璃片上，并使其干燥。
2.火焰固定：用火焰将涂片上的细菌固定在玻璃片上。
3.草酸铵结晶紫染液染色：将涂片放入草酸铵结晶紫染液中，染1分钟。
4.水洗：用自来水冲洗涂片，洗去未结合的染液。
5.碘液媒染：将涂片放入碘液中，媒染1分钟。
6.水洗：用自来水冲洗涂片，洗去未结合的碘液。
7.脱色：将涂片放入95%酒精中，脱色20秒。
8.水洗：用自来水冲洗涂片，洗去未结合的酒精。
9.蕃红染色液复染：将涂片放入蕃红染色液中，复染2分钟。
10.水洗：用自来水冲洗涂片，洗去未结合的蕃红染色液。
11.干燥：将涂片干燥，以便于显微镜观察。
12.显微镜观察：将涂片放在显微镜下观察，根据细菌的革兰氏染色结果进行分
类鉴定。
需要注意的是，在进行革兰氏染色时，应按照规定的步骤进行操作，每一步的操作时间和温度也需要严格控制。
此外，为了提高革兰氏染色的准确性和可靠性，需要使用新鲜的染液和媒染液，并在使用前进行过滤处理。
同时，对于不同的细菌种类和不同的实验目的，可能需要调整染色时间和媒染时间等参数。
总之，细菌革兰氏染色法是一种重要的细菌鉴别方法，它能够将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，对于细菌的分类、鉴定和治疗具有重要的意义。
在进行革兰氏染色时，需要按照规定的流程进行操作，并注意控制实验条件和提高实验技巧，以提高革兰氏染色的准确性和可靠性。
革兰氏染色注意事项
革兰氏染色注意事项革兰氏染色是一种用于细菌鉴定的常见染色方法，通过染色可以将细菌区分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
以下是革兰氏染色的注意事项：1. 实验环境的准备：实验室应该保持干净整洁，所有使用的仪器和材料都应该经过消毒处理，以确保实验结果的准确性。
2. 细菌培养条件：在进行革兰氏染色之前，应先进行细菌培养。
细菌在培养基上生长应适当，不宜过旺盛也不宜过弱，通常是在对数生长期时进行染色。
3. 准备涂片：将适量的细菌涂于玻璃片上，并用火焰消毒的钳子将片子固定在烧杯上。
4. 染色步骤：革兰氏染色的步骤一般包括涂片固定、革兰碘处理、脱色、洗涤和染色五个步骤。
在每个步骤中应该注意操作的温度、时间以及试剂的使用量，以免对实验结果产生干扰。
5. 注意细菌涂片的厚薄度：涂片过厚会导致染料渗透不全，涂片过薄则会导致细菌形态不易被观察到。
因此，在涂片时应掌握好细菌涂片的适当厚度。
6. 观察细菌形态：染色完成后，需要使用高倍显微镜观察细菌的形态和颜色变化。
革兰氏阳性菌在显微镜下呈现蓝紫色，而革兰氏阴性菌呈现红色。
7. 结果的判断：根据观察到的颜色变化，我们可以判断细菌是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌。
阳性菌通常是球状或梭形，而阴性菌则呈现棒状。
8. 结果的解读：除了细菌的形态外，还需要根据实验室的标准和数据对结果进行解读。
不同的细菌在革兰氏染色中的特点是不同的，正确的解读结果需要对细菌的性质和特点有一定的了解。
9. 解释错误结果：如果染色结果不符合预期，可能是实验过程中出现了问题，也可能是细菌本身的特性造成的。
在出现错误结果时，需要仔细检查实验步骤并进行排除。
10. 染色后处理：完成革兰氏染色实验后，应及时清洗实验仪器和材料，并妥善处理实验废液和废弃物，以确保实验后的安全性和环境的整洁。
综上所述，进行革兰氏染色实验时需要注意实验环境、细菌培养条件、染色步骤、细菌涂片的厚薄度、细菌形态的观察和结果的解读等因素。
只有严谨和细致的操作才能确保实验结果的准确性和可靠性。
革兰氏染色
实验步骤（油镜的使用）
1. 准备：将所用低倍物镜拉下，上抬载物台使玻片 靠近物镜最近
2. 聚焦：先用粗调螺旋，往下调节载物台，使玻片 缓慢远离物镜，找到物象，再用细调螺旋，聚焦
3. 先用低倍镜，并将所要观察部分移至视野的中央。 4. 移开低倍镜，换用高倍镜（20X；40X）进一步聚
焦，并把所要观察部分移至视野中央。 5. 移开高倍镜，并将油镜转玻片一侧备用。 6. 在盖玻片上滴一滴香柏油，然后将油镜转正对准
细菌细胞壁结构
革兰氏阴性
革兰氏阳性
染色结果
G＋菌
G－菌
•仔细观察（染色性，形态，排列），绘图
❖ 革兰氏染色法由丹麦医生Hans Christian Gram (1853-1938) 于1884年创立，是细菌 学中重要的鉴别染色法。
❖ 通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性 菌（G+）和革兰阴性菌（G-）两大类。
法国生物梅里埃全自动革兰氏染色系统
PREVI™ Color Gram
•操作简便，只需手工加载涂片 •5分钟内即可得到标准化结果 •显著提高结果重复性、可靠性 •操作完成后涂片已干燥，可直接镜检 •减少接触感染性标本，提高生物安全性 •高通量设计，每小时可处理180/450张涂片
革兰氏染色
PREVI™ Color Gram
❖ G＋菌胞壁结构致密，肽聚糖层厚，脂质含量少， 乙醇不易透入。同时乙醇使细胞壁脱水形成一道 屏障，阻止结晶紫—碘复合物从胞内渗出，故细 菌仍保留初染时的紫色。
❖ G－菌胞壁结构较为疏松，肽聚糖层很薄，外膜含 大量脂质，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性变 大，使结晶紫--碘复合物被乙醇பைடு நூலகம்解析出而脱色， 故细菌呈复染时的红色。
脑脊液常规检查的标准操作程序
一、目的规范脑脊液常规检查。
二、适用范围适用于脑脊液的常规检测，包括：一般性状的检查、潘氏试验、细胞总数计数、白细胞计数与分类、革兰氏染色、抗酸染色、墨汁染色。
三、支持性文件《全国临床检验操作规程》(第三版)、《临床检验基础》（第三版）四、标本处理1、标本收集后应立即送验，一般不能超过1h。
收到标本后应立即检查，久置可致细胞破坏，影响细胞计数及分类检查；葡萄糖分解使含量降低；病原菌破坏或溶解。
2、细胞计数管应避免标本凝固，遇高蛋白标本时，可用EDTA盐抗凝。
五、一般性状检查主要观察颜色与透明度，可记录为水样透明、白雾状浑浊、微黄浑浊、绿黄浑浊、灰白浑浊等。
脓性标本应立即直接涂片进行革兰染色检查细菌，并应及时接种培养基。
1、红色：如标本为血性，为区别蛛网膜下腔出血或穿刺性损伤，应注意：(1)将血性脑脊液试管离心沉淀(1500r／min)，如上层液体呈黄色，隐血试验阳性，多为蛛网膜下腔出血，且出血的时间已超过4h。
如上层液体澄清无色，红细胞均沉管底，多为穿刺损伤或因病变所致的新鲜出血。
(2)红细胞皱缩，不仅见于陈旧性出血，在穿刺外伤引起出血时也可见到。
因脑脊液渗透压较血浆高所致。
2、黄色：除陈旧性出血外，在脑脊髓肿瘤所致脑脊液滞留时，也可呈黄色。
黄疸患者的脑脊液也可呈黄色。
但前者呈黄色透明的胶冻状。
3、米汤样：由于白(脓)细胞增多，可见于各种化脓性细菌引起的脑膜炎。
4、绿色：可见于绿脓杆菌、肺炎链球菌、甲型链球菌引起的脑膜炎。
5、褐或黑色：见于侵犯脑膜的中枢神经系统黑色素肉瘤。
五、潘氏(Pandy)球蛋白定性试验1、原理脑脊液中球蛋白与苯酚结合，可形成不溶性蛋白盐而下沉，产生白色浑浊或沉淀。
2、试剂5％苯酚溶液：取纯苯酚25m1，加蒸馏水至500m1，用力振摇，置37℃温箱内1—2天，待完全溶解后，置棕色瓶内保存。
3、操作取试剂2—3m1，置于小试管内，用毛细滴管滴入脑脊液l一2滴，衬以黑背景，立即观察结果。
分泌物涂片革兰染色找阴性双球菌
分泌物涂片革兰染色找阴性双球菌标准操作程序1. 检验目的为临床诊断淋病奈瑟菌感染病因提供实验室依据2. 试验原理正常人的泌尿生殖道是没有淋球菌的，只有当局部发生淋球菌感染时，才有淋球菌存在。
急性淋菌性尿道炎病人常有大量黄色脓性分泌物。
将感染部位的分泌物涂片，利用革兰氏染色原理，感染部位的淋病奈瑟菌染色呈革兰阴性双球菌，且镜下呈现典型的形态及排列。
3.标本来源3.1临床送检男性患者由临床医生采集泌尿道脓性分泌物涂片送检。
3.2婴儿由临床医生采集眼脓性分泌物涂片送检。
3.3采集方法详见标本采集SOP文件。
4.标本验收4.1收取标本时应认真核对检验项目及检验目的。
4.2女性成年患者原则上应拒收，不适宜做此项检查。
实验试剂：革兰氏染液（由试剂公司提供）5.操作程序5.1验收标本合格后，首先登录lis程序，扫码编号。
5.2标本处理5.2.1若玻片上脓性分泌物未涂开，应用接种环或另一块洁净玻片将其涂抹开，厚薄均匀。
5.2.2待其自然干燥后，在酒精灯火焰上快速来回三次固定。
5.2.3革兰染色：操作步骤参见革兰氏染色SOP文件。
5.2.4待其自然干燥后，于油镜下镜检。
5.2.5首先注意观察镜下是否有白细胞；其次有无革兰阴性双球菌成双排列，凹面相对；最重要的是寻找有无吞噬在白细胞内的革兰阴性双球菌。
5.2.5.1若镜下有大量白细胞和革兰阴性双球菌，是典型的急性感染表现，可做出诊断。
5.2.5.2若镜下白细胞稀少或革兰阴性双球菌量少时，要将整张片子仔细检查，注意观察有无白细胞内吞噬有革兰阴性双球菌。
若未见吞噬到白细胞内的阴性双球菌报告时要注明。
6.报告模式6.1阳性：检出革兰阴性双球菌。
6.2阳性：检出革兰阴性双球菌（注明：未见细胞内，建议做淋球菌培养）6.3阴性：未检出革兰阴性双球菌。
6.4阴性：未检出革兰阴性双球菌（针对取材量少和镜下看不到一个白细胞等情况，应注明取材不佳）。
7.临床意义7.1该检验可用于男性淋病诊断。
螺旋体常用的染色方法
螺旋体常用的染色方法螺旋体是细菌领域中一类重要的生物体，它们具有特殊的形态结构和重要的生理功能。
为了研究和观察螺旋体，科学家们常常需要使用染色方法。
本文将介绍螺旋体常用的染色方法，并详细讲解其原理和操作步骤。
螺旋体的染色方法可以分为直接染色和间接染色两种。
直接染色是指在螺旋体细胞上直接进行染色，以使其在显微镜下更易观察。
间接染色则是通过对细菌周围组织的染色，使螺旋体细菌在显微镜下可见。
直接染色方法中，最常用的是革兰氏染色法。
革兰氏染色法是通过革兰氏染色染剂的作用，使细菌细胞壁变色，从而区分细菌的染色性质。
其操作步骤主要包括：①将待染细胞涂片固定在玻片上；②用革兰氏第一碘盐液涂染片1分钟；③用革兰氏碘溶液洗染片，使其更易染色；④用革兰氏脱色液将染片浸泡30秒至1分钟；⑤用革兰氏第二酮溶液洗染片去除多余染料；⑥用洗净的水冲洗；⑦用95%乙醇水溶液即洗片（加盐后）；⑧用碘酊再染色；⑨用95%乙醇水溶液冲去多余碘酊；⑩用洗净的水冲洗片；⑪用革兰氏染色之后再用洗净的水反复冲洗，酒精洗；⑫用醋酸琼脂糖即可。
间接染色方法中，最常用的是伊红染色法。
这种染色方法通过间接染色剂伊红的作用，使螺旋体在显微镜下更易观察。
其操作步骤主要包括：①将待染细胞涂片固定在玻片上；②用无菌的10%磷酸标准溶液涂覆涂片，使pH值为2.5；③用0.5%伊红溶液涂覆涂片1分钟；④用无菌的10%磷酸标准溶液冲洗涂片；⑤用去离子水冲洗片，使片面清洗。
除了革兰氏染色法和伊红染色法，还有其他染色方法也可以用于观察螺旋体。
例如，焦亮石蓝染色法可以增强螺旋体在显微镜下的对比度，使其更易观察。
此外，苏木精-蓝甲基染色法、地高辛染色法等也可以用于染色螺旋体。
总的来说，螺旋体的染色方法可以通过直接染色和间接染色两种方式进行。
无论是革兰氏染色法还是伊红染色法，都可以使螺旋体细胞更加清晰地显示在显微镜下。
通过染色方法，科学家们可以更加方便地研究和观察螺旋体，进一步了解其形态结构和生理功能。
革兰氏染色标准操作程序
革兰氏染色标准操作规程1 目的确保革兰氏染色的正确操作，使革兰氏染色的操作得到有效控制，以提供稳定的实验结果。
2 适用范围适用于本公司微生物实验室革兰氏染色实验。
3 职责实验室技术人员应遵循此程序，确保按标准操作规程进行革兰氏染色。
4 程序4.1革兰氏染色原理通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层较多且交联致密，故遇丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故丙酮处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过丙酮脱色后仍呈无色，再经番红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
4.2实验物品灭菌玻片、接种环、移液器、酒精灯、计时器、显微镜、香柏油、革兰氏染色液等。
4.3实验步骤4.3.1涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液器吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用移液器分别吸取10ul金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌位于待检品的两侧（中间要有足够的空间），分别作为阴阳性对照。
用无菌接种环将液滴涂布成均匀的薄层，涂布面不宜过大。
4.3.2干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯火焰高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
4.3.3固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉得烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。
4.3.4初染：在涂片薄膜上滴加革兰氏结晶紫试剂1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
4.3.5水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
革兰氏染色标准操作规程
1 目的
确保革兰氏染色的正确操作，使革兰氏染色的操作得到有效控制，以提供稳定的实验结果。
2 适用范围
适用于本公司微生物实验室革兰氏染色实验。
3 职责
实验室技术人员应遵循此程序，确保按标准操作规程进行革兰氏染色。
4 程序
4.1革兰氏染色原理
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层较多且交联致密，故遇丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故丙酮处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过丙酮脱色后仍呈无色，再经番红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
4.2实验物品
灭菌玻片、接种环、移液器、酒精灯、计时器、显微镜、香柏油、革兰氏染色液等。
4.3实验步骤
4.3.1涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液器吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用移液器分别吸取10ul金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌位于待检品的两侧（中间要有足够的空间），分别作为阴阳性对照。
用无菌接种环将液滴涂布成均匀的薄层，涂布面不宜过大。
4.3.2干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯火焰高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
4.3.3固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉得烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。
4.3.4初染：在涂片薄膜上滴加革兰氏结晶紫试剂1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
4.3.5水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
4.3.6媒染：取1-2滴革兰氏碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
4.3.7水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
4.3.8脱色：斜置载玻片，滴加革兰氏脱色剂脱色，至流出的脱色剂不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。
4.3.9复染：在涂片薄膜上滴加革兰氏番红精复染剂1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
4.3.10水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
4.3.11干燥：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下观察。
4.3.12观察：待标本片干后置显微镜下观察，用低倍镜观察，发现目标物后滴一滴香柏油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色。
4.4结果判定
显微镜观察由金黄色葡萄球菌制成的标本显示葡萄球状蓝紫色，大肠埃希菌制成的标本显示杆状红色，则实验过程有效。
一方不成立则实验结果无效。
此时，如果样品在显微镜下呈蓝紫色，则判定样品菌株为革兰氏阳性菌；如果样品在显微镜下呈红色，则判定样品菌株为革兰氏阴性菌。
4.5实验结束
4.5.1实验结束后，按显微镜使用、维护和保养规程的要求，关闭和清洁显微镜。
4.5.2实验过程中用到的带菌工具，根据工具的不同选择不同的灭菌方式，确保物品丢弃前均已灭菌。
4.5.3实验中用到的载玻片和盖玻片一次性应用，使用前用75%酒精浸泡，清洗干净风干灭菌后应用；使用后灭菌，按废弃物处理程序处理。
5相关文件
5.1 《微生物学教程》第三版周德庆著高等教育出版社
6修订内容。