第三讲 细胞相关生物学行为分析方法2003

优点：是分子生物学和形态学相结合 的方法，并可检测出早期和极少量的 凋亡细胞，灵敏度比DNA Ladder法高。
二、细胞凋亡检测技术
溴化丙锭（propidium iodide, PI）可与细胞内DNA结合，流式细胞术检测到 的PI荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。凋亡细胞由于总DNA量 降低，将于正常G1/G0期细胞群前出现一亚二倍峰，即凋亡细胞群。
四、细胞生物力学特性检测技术
原理：采用微管吸吮方法捕获表征特异性相互作用分子的细胞或小球，通 过压电晶体驱动器操控微管，实现两细胞或小球间靠近-接触-回拉的动力 学循环，并记录回拉过程中细胞变形与否、变形大小和解离时间长短等信
息来研究分子间相互作用(interaction between molecules)的动力学性质。
优点:可直观观察粘附事件的发生
(directly observe the adhesion
events)，而且每次粘附事件均可控。 局限性:在于通量低、每次只能实现
单一细胞对检测，且由于测试周期
较长、体外难以长时间维持细胞功 能状态的限制，难于获得大样本的 统计数据。
四、细胞生物力学特性检测技术
Long M, 2007, JBC, Two-dimensional Kinetics of P-selectin-PSGL-1 Interactions
一、细胞增殖动力学检测方法
各种细胞增殖/毒性检测方法的优势比较
一、细胞增殖动力学检测方法
于细胞培养载玻片上进行，定时取出玻片进行固定染色，并观察计 数，也可将数据绘制成曲线。
细胞培养载玻片
骨髓细胞Giemsa染色
细胞分裂过程荧光染色
一、细胞增殖动力学检测方法
5-溴脱氧尿嘧啶核苷是胸腺嘧啶的衍生物，可以通过与胸腺嘧啶竞争掺 入到S期细胞单链DNA中，再利用抗BrdU单克隆抗体显示增殖细胞核。 通常用DAPI和BrdU荧光染色复染的方法来分析细胞的增殖情况。 BrdU competes with thymine in the synthesis of DNA during proliferation.
G1/G0期：正
常细胞（2N）；
G2/M期：分裂 的细胞（4N）；
S期：细胞DNA
含量介于前两 者之间。
缺点：无法区分死细胞与凋亡细胞，对早期凋亡也无法检测。
二、细胞凋亡检测技术
磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）分布于细胞内膜，凋亡细 胞PS外翻。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
CFU-E
CFU-GM
一、细胞增殖动力学检测方法
结晶紫染色 Crystal violet
二、细胞凋亡(apoptosis)检测技术
细胞死亡有两种不同形式，即细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。细 胞坏死是由外界因素导致的细胞急速死亡；凋亡是细胞在生理(physiological) 或病理(pathological)条件下由基因(gene)调控的死亡过程。细胞凋亡过程中 膜结构完整(integral membrane)，染色体DNA断裂(DNA fragmentation)，细 胞膜包裹这核碎片形成凋亡小体(apoptosis body)。 凋亡在胚胎发育、成年阶段衰老、病变细胞的清除发挥着重要的作用，也是 研究药物作用机理和进行药物筛选的的重要手段。
BrdU掺入法根据选择抗体标记物的不同， 还可以通过免疫组化(IHC)、流式细胞术 (FACS)、ELISA检测细胞的增殖情况。 同类方法：EdU法
Anti-Brdu DAPI
一、细胞增殖动力学检测方法
单个细胞在体外持续生长，其后代所形成的细胞群称为克隆或集落。 该方法可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，也常用来确定抗癌药物 对肿瘤的杀伤能力。常用的方法包括平板集落形成实验（贴壁细胞） 和软琼脂集落形成实验（悬浮细胞）。
(4)集落（克隆）形成实验：测定单个细胞(single cell)增殖能力。
一、细胞增殖动力学检测方法
在培养瓶或孔板中准确接种相同数量的细胞，每天计数(count everyday)，测 出培养瓶或孔板中的细胞总数，持续7天（也可根据需要而定）。细胞接种 量以7天能长满，而不发生接触抑制(contanct inhibition)为度。
二、细胞凋亡检测技术
凋亡细胞染色体DNA的断 裂首先降解为50~300kb 的大片段，然后在核小体 间随机断开，形成 180~200bp的小片段。 脱氧核糖核酸末端转移酶 （TDT）的作用下，生物 素或荧光素标记的dUTP 可以掺入到凋亡细胞双链 或单链DNA的3’-OH端， 通过颜色反应，特异准确 的定位凋亡细胞。
电镜观察细胞超微结构
Hoechst33258染色细胞核观察凋亡
二、细胞凋亡检测技术
细胞凋亡最突出的生化特 征是由凋亡引起的核酸内
切酶(endonuclease)的活
化，使染色质核小体 (nucleosome)间连接断裂， DNA裂解为长度为 180~200bp及其倍数的片
段，在琼脂糖凝胶电泳上
呈现DNA梯形电泳图谱。
(motility)。
三、细胞迁移/侵袭检测技术
Transwell chamber也叫 做通透性细胞培养支 持物，0.1µ m孔径的膜 主要应用于药物转导 研究，细胞迁移、侵 袭、趋化性和运动性 研究通常采用3.0µ m以 上孔径的膜。一般迁 移/侵袭实验使用8µ m 直径的膜。 实验结束后采用结晶 紫(crystal violet)或DAPI 等染色观察迁移细胞 数目。
一、细胞增殖(proliferation)动力学检测方法 二、细胞凋亡(apoptosis)检测技术 三、细胞侵袭/迁移(invasion/migration)检测技术 四、细胞生物力学特性(biomechanics)检测技术
一、细胞增殖动力学检测方法
培养中，细胞的生长、繁殖(proliferation)和死亡(death)是一个动
反映细胞生长特性：对数生长期（传 代）、倍增时间(doubling time)等
对比生化、物理刺激、基因改造前、后 细胞生长特性的差异
一、细胞增殖动力学检测方法
细胞计数法(cytometry)
血球计数板
Tips: (1)数上不数下，数左不数右； (2)每一大方格细胞数×104=细胞 数/mL (3)可用台盼蓝(trypan blue)染色区 分活、死细胞
nuclei by DAPI (blue).
共培养条件诱导内皮细 胞迁移
MTLn3： GFP-expressing rat mammary adenocarcinoma cells (乳腺癌细胞) U87MG： GFP-expressing human glioblastoma cell line （胶质瘤细胞） 10T ½： Mouse smooth muscle precursor cells （平滑 肌祖细胞）Cells were stained for actin by Rhodamine-phalloidin (yellow) and nuclei by DAPI (blue). HMVEC （内皮细胞）were stained for vWF(green) to distinguish them from 10T 1/2.
一、细胞增殖动力学检测方法
XTT法原理：XTT是异种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱 氢酶还原成水溶性的棕色(brown)甲肷产物，当XTT与电子耦合剂（PMS） 共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。 MTS法原理：与MTT法原理类似。MTS是MTT的类似物，能被活细胞线粒 体中脱氢酶还原成可溶于水的有色产物甲臜盐，可直接进行比色。特点： 步骤相对MTT更简单，相对更准确。 WST-1法原理：与MTS原理类似。检测范围宽于MTT和MTS。 CCK8法原理：基于WST-8。在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体 内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物。颜色的深浅与细胞 的增殖成正比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞 数量。
三、细胞迁移/侵袭检测技术
VEGF诱导内皮细胞
迁移
Migrating cells into soft
(pH 7.4) and rigid (pH.
11.0) scaffolds were studied.
Cells were stained for actin by Rhodamine-
phalloidin (yellow) and
三、细胞迁移(migration)/侵袭(invasion) 检测技术
细胞迁移是指细胞在接收到迁 移信号或感受到某些物质的浓 度梯度后产生的移动。过程中 细胞不断向前方伸出突足 (pseudopodium)，然后牵拉胞
体的循环过程。细胞骨架
(cytoskeleton)和其结合蛋白 (binding proteins)是这一过程的 物质基础，另外还有多种物质 对之进行精密调节。 细胞迁移侧重于研究细胞的趋 化性(chemotaxis)和运动性
0.01cm2×0.01cm=0.1mm3
一、细胞增殖动力学检测方法
MTT（四唑盐）法
酶标仪
摇床
96孔板
原理：活细胞线粒体(mitochondrion)中脱氢酶(dehydrogenase)能将四唑盐 还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臜（formazan)，并沉淀在细胞中。二甲 亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含 的formazan量成正比。用酶标仪(microplate reader)测定OD值即可获得间 接的细胞数量表征。 特点：快速，准确，可一次处理多个样品。由于脱氢酶非细胞数量的直接 表征，常被审稿人诟病。 类似方法：WST、MTS、XTT、CCK8等。
Fra Baidu bibliotek
常用检测方法： 1. 形态观察(morphology) 2. DNA琼脂糖凝胶电泳(electrophoresis) 3. MTT细胞活性检测 4. 流式细胞仪分析(FACS) 5. 原位末端标记（TUNEL）
二、细胞凋亡检测技术
可通过HE染色，Giemsa染色等方法观察凋亡细胞染色质浓缩，凋亡 小体等现象，也可用电镜、荧光显微镜观察细胞凋亡。
态的过程，细胞增殖动力学是描述细胞状态的一项重要指标。
(1)生长曲线(growth curve)的测定：记录细胞的绝对生长数值，了
解细胞总体的(global)增殖生长规律。
(2)分裂指数的测定：记录细胞群体中分裂期细胞(cell at mitotic phase)所占百分比，用以表示细胞增殖旺盛程度。 (3)细胞增殖指数：新增殖(newly generated )的细胞占细胞总数的 百分比。
三、细胞迁移/侵袭检测技术
细胞迁移（migration） 和侵袭（invasion）的概 念最初来自于肿瘤学。 侵袭是指恶性肿瘤细胞 从起源部位沿组织间隙 向周围组织浸润的过程， 其标志是肿瘤细胞突破 基底膜。肿瘤侵袭是肿 瘤细胞与周围间质相互 作用的结果。 细胞侵袭的研究侧重于 细胞与胞外基质（ECM） 的相互作用。
四、细胞生物力学特性检测技术
光是一种特殊的物质，携带有能量和动量，光与物质相互作用时彼 此交换能量和动量，产生各种效应。捕获微小粒子的光镊是一个特 别的光场，这个光场与物体相互作用时，物体整个受到光的作用从 而达到被钳的效果，然后可以通过移动光束来实现迁移物体的目的。
光镊可以捕获和操控几十纳米到 几十微米大小的粒子(optical tweezer can capture particles with diameters of dozens of nanometer/micrometer )，它还可 以作为微小力的探针，测量皮牛 亚皮牛量级的力，正好可以用来 研究生物细胞的力学行为，以及 细胞与生物大分子如蛋白质等的 相互作用等，进而从单细胞、单 分子层次上揭示细胞生命活动的 基本规律。
control
0.1 μg /ml
0.5 μg /ml
1 .0 μg /ml
OPN
三、细胞迁移/侵袭检测技术
划线法又叫做wound healing法，是体外模拟体内伤痕愈合过程的实验方法。
三、细胞迁移/侵袭检测技术
基底膜(basement membrane)是普遍存在的一种连续的细胞外基质成份构成 的膜性结构，主要含层粘连蛋白(laminin)和胶原(collagen)。局部蛋白质水解 导致基底膜降解有利于肿瘤细胞的穿出。常用的人工基底膜材料为Matrigel。