第14章+细胞增殖调控与癌细胞

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(Mik1)
（CAK） CDK1-Activiting Kinase
(Wee1) (CAK)
Pre-MPF
CDK1激酶活性调节示意图
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2. M期周期蛋白与分裂中期向后期转化
细胞周期运转到分裂中期后，M期周期蛋 白A和B通过泛素化途径迅速降解，CDK1 激酶活性丧失，上述被CDK1激酶磷酸化 的蛋白质去磷酸化，细胞周期便从中期向 后期转化。
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芽殖酵母细胞周期蛋白变化
M期周期蛋白Clb1、Clb2在G1期的后期开始表达，到 G2期达到最大值，到达M期中期后迅速消失。G1期周期蛋 白Cln1和Cln2在M期的后期开始表达，到达G1期后期的 “起始点”前含量达到最大，然后逐渐降低。
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裂殖酵母的细胞周期蛋白变化
M期周期蛋白Cdc13、Cig1在G1期的后期开始表达， 到G2期达到最大值，到达M期中期后迅速消失。
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MPF与核纤层解体
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• MPF活性的调节受到多种因素的综合调 节。Cdc 2与cyclin B结合是激酶表现活 性的先决条件。Wee 1/Mik 1激酶和CDK 激活激酶(CDK 1-activting kinase, CAK) 催化Cdc 2的Tyr15 、Thr14和Thr161磷 酸化，形成无活性的pre-MPF。然后在 磷酸酶cdc25的催化下，其Thr14和Tyr15 去磷酸化，才能表现出激酶活性。
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哺乳动物细胞周期中的Cyclin－CDK 激酶复合物
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芽殖酵母
Cyclin-Cdk复合物的多样性
G1 Cyclin-Cdk
S Cyclin-Cdk
G2/M Cyclin-Cdk
Cln1,2,3-Cdc28 Clb5,(3,4)-Cdc28 Clb1,2(3,4)-Cdc28
高等真核生物
Cyclin D1,2,3-Cdk4/6 Cyclin A-Cdk2 Cyclin E1,2-Cdk2 Cyclin C-Cdk8
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P21蛋白在细胞源自文库期 调控中的作用
在DNA出现损伤时，P53 作为转录激活因子诱导 P21基因的表达，P21蛋白 能够同CDK-周期蛋白复合 物结合并将细胞阻止在G1 期或G2期。同时，P21蛋 白与增殖细胞核抗原
(proliferatin cell nuclear antigen, PCNA)，一种 DNA聚合酶亚基的相互 作用抑制DNA的复制。
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六、细胞周期运转调控
1. G2/M期转化与CDK1激酶的关键性调控作用 2. M期周期蛋白与分裂中期向后期转化 3. G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性Cdk激酶 4. S/G2期转化与DNA复制检验点
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1. G2/M期转化与CDK1激酶的关键性调控作用
• CDK1激酶即MPF，由p34cdc2蛋白和周期 蛋白B结合而成。p34cdc2蛋白在细胞周期中 的含量相对稳定，而周期蛋白B一般在G1 期的晚期开始合成，S期含量不断增加， 到G2期含量达到最大。因此，CDK1激酶 活性在G2期晚期达到最大并一直维持到M 期的中期阶段。
M期周期蛋白A和B的降解是通过泛素化 途径(ubiquitination pathway)来实现的。
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周期蛋白的降解主要是在破坏框或PEST 介导下，通过泛素－蛋白水解酶复合物 水解系统来实现。该过程需要： ▶泛素蛋白活化酶(ubiquitin-activating
enzyme, E1)
▶泛素蛋白结合酶(ubiquitin-conjugating
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一、 MPF的发现及其作用
细胞融合与PCC Masui等爪蟾卵成熟实验 海胆等胚胎早期发育的研究发现一种周期蛋
白的合成与细胞进入M期及MPF活性密切相 关。该周期蛋白在间期合成，G2/M达到高峰， M期后突然下降，下一轮间期又重新合成。
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人M期细胞与袋鼠G1、S、G2期细胞融合诱导早熟染色 体凝集 (PCC)，提示M期细胞存在诱导PCC的因子。
enzyme, E2)
▶泛素蛋白连接酶(ubiquitin ligase, E3)
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周期蛋白的破坏框介导周期蛋白的降解
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由泛素和蛋白酶体所介导的蛋白质降解
E1：泛素活化酶；E2：泛素结合酶；E3：泛素连接酶
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后期促进因子 (APC)调节M期周期蛋白泛素 化途径的降解，此外，还调节其他一些与细 胞周期有关的非周期蛋白类蛋白质的降解， 在分裂中期向后期的转化中发挥作用。
Cyclin B-Cdk1 (Cdc2)
G1 Substrates
S Substrates
G2/M Substrates
Growth and Morphogenesis
DNA Replication
Mitosis 26
五、Cdk激酶抑制因子
• 哺乳动物Cdk抑制因子 (Cdk inhibibitors, CKIs) ，包括Cip/Kip家族和INK4家族。
• Cip/Kip家族包括p21cip1/WAF1、p27kip1和 p57kip2等，INK4家族包括p16INK4a、 p15INK4c、p18INK4c、p19INK4d等。其作用 是抑制Cyclin-Cdk复合物的装配或活性， 而将细胞阻止在不同的检验点。
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p21是一种广泛的Cdk抑制因子，是p53蛋白 在细胞周期DNA损伤检验点发挥作用的中 介者。p21主要对G1期CDK起抑制作用。 如S期前DNA受损时，导致p53水平升高， 刺激p21蛋白表达，细胞停留在G1期检验点， 让细胞修复DNA或凋亡。p21蛋白也可通过 与增殖细胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 结合抑制PCNA参 与的DNA聚合酶的活性，从而阻抑DNA的 复制过程。
CDK激酶分子含有一段类似的CDK激酶结 构域，该结构域中有一小段保守序列，即 PSTAIRE ( Pro-Ser-Thr-Ala-Ile-Arg-Glu)。
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CDK激酶同源性比较
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不同的周期蛋 白与不同的 CDK激酶结合， 构成不同的 Cyclin-Cdk复 合物；不同的 Cyclin-Cdk在 不同的时相表 现活性，影响 不同的下游事 件。
G1期周期蛋白Cig2在M期的后期开始表达，到达G1期 后期的“起始点”前含量达到最大，然后逐渐降低。
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四、CDK激酶
以周期蛋白为调节亚单位，且具有蛋白激 酶活性的一类蛋白质，称为周期蛋白依赖 性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)， 简称CDK激酶。
已发现的CDK激酶包括Cdc2(CDK1)、 CDK2~CDK12等。
APC的活性受到多种因素的综合调节。APC 可以被活化的M期CDK所激活，且多种 APC作用底物被M期CDK磷酸化；而活化 的APC则可以被蛋白磷酸水解酶作用而失活。
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三、细胞周期蛋白(cyclin)
1983年Evans等报道在海胆卵细胞中存在一种特 殊蛋白质，这种蛋白含量随细胞周期进程变化 而变化，将这种蛋白称为周期蛋白(cyclin)。
已从多种生物体发现细胞周期蛋白，如酵母的 Cln1、Cln2、Cln3、Clb1~Clb6，高等动物的周 期蛋白A1、A2、B1、B2、B3、C、D1、D2、 D3、E1、E2、F、G、H、L1、L2、T1、T2等。
不同的细胞时期表达不同的细胞周期蛋白，依 据表达时间可分为：G1期周期蛋白，如C、D、 E、Cln1、Cln2、Cln3等；M期周期蛋白，如A、 B、Clb1、Clb2等。
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各周期蛋白含有一段保守的氨基酸序列——周 期蛋白框，该结构域中约含有100个氨基酸残 基。周期蛋白框介导周期蛋白与Cdk激酶结构 域(CDK kinase domain)的结合 。
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M期细胞周期蛋白的破坏框
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哺乳动物细胞周期中周期蛋白变化
周期蛋白A在G1期早期开始表达并逐渐积累，到达G1/S交界处，含量达 到最大并一直维持到G2/M期；B从G1期晚期开始表达并逐渐积累，到 G2期后期达到最大并一直维持到M期的中期阶段，然后迅速降解；D在 整个细胞周期中持续表达；E在M期晚期和G1期早期开始表达并逐渐积 累，G1晚期达到最大，然后逐渐下降到达G2期晚期其含量降到最低。
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• INK4家族中的p16INK4a是一个负调控因子， p16主要与Cdk4/Cdk6激酶结合形成一个不 具激酶活性的二聚体，抑制它们对pRb的 磷酸化，从而使与pRb结合的转录因子E2F 不能释放，导致细胞停滞在G1期；p16对细 胞周期的调控点在G1期R点附近，它与周 期蛋白D竞争结合Cdk4/6并抑制Cdk4/6激 酶活性，表现出生长负调作用。
◆亨特(Hunt)(英)发现了调节细胞周期的一种关键物 质Cdk (细胞周期蛋白依赖性激酶)，Cdk是通过对 其他蛋白质的化学作用来驱动细胞周期的。
◆纳斯(Nurse)(英)发现了调节Cdk功能的物质Cyclin (细胞周期蛋白)。
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一、MPF的发现及其作用 二、p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系 三、细胞周期蛋白 四、CDK激酶 五、CDK激酶抑制因子 六、细胞周期运转调控 七、细胞周期检验点对细胞周期的调控
周期蛋白A、B在N端具有9个氨基酸残基组成的 特殊的序列，RXXLGIXN（X代表可变氨基酸）， 该序列称为破坏框(destruction box)，其他周期蛋 白在C端具有PEST (Pro-Glu-Ser-Thr) 序列。破 坏框和PEST序列与周期蛋白的降解有关。
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部分周期蛋白分子结构特征
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Cyclin B在MPF活性调节过程中的作用
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• CDK1激酶使许多与细胞分裂有关的蛋白 磷酸化，作用位点为靶蛋白的丝氨酸或苏 氨酸残基。如：使组蛋白H1磷酸化促进染 色质凝集；核纤层蛋白磷酸化使核纤层解 聚；核仁蛋白磷酸化促使核仁解体；p60csrc蛋白磷酸化促使细胞骨架重排。这些变 化促使细胞由G2期向M期转化。
研究发现p34cdc2和p34cdc28只有与细胞周期 蛋白(cyclin)结合才具有激酶的活性，故名 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)。
MPF实质上为CDK1，是由cdc2和周期蛋 白构成的复合物，cdc2为其催化亚基，周 期蛋白为其调节亚基。
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MPF的组成
MPF是一种使多种底物蛋白磷酸化的 蛋白激酶，是p34cdc2和周期蛋白B (cyclin B) 组成的复合物；其中p34cdc2是催化亚基，相 对分子量为34kDa ，具有Ser/Thr激酶活性； 周期蛋白B是调节亚基，相对分子量为 45kDa ，具有激活p34cdc2活性等功能。MPF 实 质 上 为 周 期 蛋 白 依 赖 性 激 酶 (Cyclindependent protein kinase, CDK) 。也即， MPF=CDK1=p34cdc2 + cyclin B
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注射实验表明：孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵细胞质中，
含有卵母细胞成熟的因子，称为促成熟因子(MPF)。
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早期胚胎细胞周期过程中MPF 和周期蛋白水平变化示意图
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二、p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系
在酵母上的温度敏感突变株上分离到与细 胞分裂和细胞周期调控有关的基因，被称 为cdc (cell division cycle) 基因。
cdc2基因是裂殖酵母细胞周期调控的基因之 一。cdc2基因突变导致细胞停留在G2/M交 界处，其产物为分子质量34kD的蛋白质， 被称为p34cdc2。该蛋白具有蛋白激酶活性， 可以使多种蛋白底物磷酸化，因而又被称 为p34cdc2激酶。
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芽殖酵母的cdc28基因功能类似裂殖酵母的 cdc2，编码产物p34cdc28也具有蛋白激酶活 性，在G2/M转换过程中起中心调节作用。
第十四章 细胞增殖调控与癌细胞
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第一节 细胞周期的调控
2001年诺贝尔生理学或医学奖授 予了从事细胞周期调控研究方面的3位 科学家。
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美国科学家利兰·哈特韦尔(Hartwell) 英国科学家蒂莫西·亨特(Hunt) 英国科学家保罗·纳斯(Nurse)
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2001年诺贝尔生理学或医学奖
◆哈特韦尔(Hartwell)(美)发现了大量控制细胞周期 的基因，其中一种被称为“Start”的基因对控制各 个细胞周期的最初阶段具有决定性的作用。