腐乳中毛霉的分离筛选及工业育种

腐乳中毛霉的分离筛选及工业育种摘要：对自然界分离纯化工业生产腐乳用毛霉技术进行了综述，并概括了工业发酵中毛霉种子的扩培及菌种保质防衰退的方法，为工业生产腐乳提供了理论基础。

关键词：腐乳毛霉，分离纯化，工业育种，菌种保藏Fermented bean curd of mucor separation screening andbreeding industryAbstract:The nature purification industrial production fermented bean curd with mucor technology were summarized, and generalizes the industrial fermentation medium wool mildew seed expansion of the culture and culture quality and prevent the decline of the methods for industrial production of fermented bean curd provides a theoretical basis. Keywords:fermented bean curd mucor, separation and purification, industrial breeding, culture collection.0前言腐乳具有很好的营养功能,富含有机酸、醇、酯等风味物质；含有大量水解蛋白质、游离氨基酸、游离脂肪、碳水化合物、硫胺素、核黄素、烟酸、钙、磷等营养成分,不含胆固醇。

其中蛋白质含量高达12%-22%,而且18种氨酸齐全。

腐乳生产历史悠久,依据生产使用菌种不同可分为细菌型、根霉型和毛霉型。

目前,工业生产中运用最多的是毛霉,主要因其具有菌丛细长柔软,能包裹豆坯形成块状完整的腐乳;其酶系丰富,主要含有内肽酶和端肽酶的复合酶,水解蛋白质无苦味,且无毒无害、不产生怪味和异色等。

毛霉菌种的生产性能直接影响到腐乳的产量和质量,而生产企业主要依据感官鉴定,为此,生产菌种在使用过程中出现性状衰退导致生产停滞的情况时有发生。

因此,从风味较好的腐乳成品中筛选酶系较完整且产蛋白酶活性较高、发酵性状优良的腐乳毛霉菌株,并应用分子检测手段对其进行准确鉴定具有重要意义。

1 自然界菌种筛选1.1培养基1.1.1平板分离培养基（PDA固体培养基）：马铃薯汁100mL，葡萄糖2g，琼脂2g。

1.1.2透明圈法初筛培养基（脱脂乳培养基）：脱脂乳1.5g，琼脂2g，pH 6.0。

1.1.3复筛培养基（麸皮培养基）:称取25g麸皮，加入130%-140%的无菌水拌匀，装入三角瓶内，用0.1MPa的压力灭菌30min，冷却。

1.1.4 固体发酵培养基:豆粕7 g ,麸皮3 g ,无菌水11 mL ,装入250 mL 三角瓶拌匀,灭菌后及时振散备用1.1.5发酵法复筛培养基：将豆腐切成2cm×2cm×2cm小块，装入已灭过菌的250mL三角瓶中，每瓶一块。

冷至50℃左右，迅速混匀，立即倒平板.1.2菌种的分离采用稀释分离法。

首先在家制腐乳毛坯中随机取5g于250mL三角瓶中，加入100m L无菌生理盐水，搅拌摇匀，将菌悬液接入PDA培养基中，25℃培养，根据毛霉形态学特征，挑取生长速度快、菌丝茂盛、抱子量多且纯白的单菌落，继续进行多次重复接种筛选，然后用稀释平板分离，待长出单菌落移接种于PDA琼脂培养基上斜面保藏。

1.3菌种的初筛采用透明圈法。

挑取分离的毛霉菌株孢子，点植于脱脂乳平板中央，因脱脂乳中含酪蛋白，在无酪蛋白酶的作用时，该脱脂乳培养基为浑浊不透明状态，当有酪蛋白酶时，酪蛋白被分解，分解处培养基呈透明状态，因此该法为将毛霉孢子接种后置于该培养基中25℃培养2d，加入几滴0.25mol/L的三氯乙酸（TCA）沉淀未被分解的酪蛋白，于4℃冰箱放置48h后，观察菌落周围是否有透明圈产生，并分别测量透明圈与菌落的直径，透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株即为产蛋白酶能力较强的菌株，符合生产需求，可作为优良菌株进行进一步筛选，将此菌株接入PDA斜面培养基中保存待用。

1.4菌种的复筛采用三角瓶复筛法。

取保存于PDA琼脂平板上菌种一小块，接入三角瓶麸皮培养基中，于20℃培养4d，提取酶液，测定蛋白酶活力。

酶液制备。

称取5g培养好的毛霉菌丝体，置于250mL三角瓶中，加入蒸馏水100mL，捣碎培养物，在4℃水浴中，不断搅拌，浸提1h，用滤纸过滤，取滤液测酶活力。

蛋白酶活力测定：用福林法测定中性蛋白酶活力。

用接种钩将毛霉菌接入已冷却的三角瓶内，摇匀后，置于28-30℃培养箱内培养48h。

酶液制备：称取5g已培养好的毛霉麸曲，置于研钵中研碎，放入三角瓶内加水100ml，在40℃水浴锅内剪短搅拌浸泡1h，过滤。

滤液用0.1mol/LpH7.2磷酸缓冲溶液稀释至所需要的倍数。

测定方法：取适当大小试管3支，编号，每管内加入酶液1ml，置于40℃水浴锅中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10min，时间到后立即加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，以终止反应。

继续置于水浴锅中保温20min，是残余的蛋白质沉淀后离心分离或过滤。

然后领取3支试管，编号，美观加入1ml滤液，再加入0.4mol/L碳酸钠5ml，已稀释的福林试剂1ml，摇匀，保温发色20min 后进行光密度（OD值）测定。

同时做一空白试验。

取三支试管，编号，测定方法同上，唯独在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯醋酸2ml，使酶失活，再加入酪蛋白。

净OD值=样品的平均OD值-空白平均OD值蛋白酶活力单位=4nA/10式中A——有样品测得的OD值，查标准曲线的相当的酪氨酸微克数4——4ml反应液取出1ml测定（即4倍）n——酶液稀释的倍数10——反应时间10min经上述方法选取单位蛋白酶活力高的菌株作为菌种进行下一步筛选。

1.5生长量的测定(菌体干重测定)采用直接干燥法。

接种前面选出的蛋白酶活性较高的几个菌种，接种同样大小于250ml麸皮培养基中，28℃振动培养48-72h，将振荡培养获得的培养物用定性滤纸滤得菌体后,水洗两次,然后再连同滤纸一起在105℃条件下烘干至恒重,测其质量,从而算出菌体干重。

选取菌体干重多的菌种即可作为本次筛选的最终工业用菌。

1.6菌种保藏（麸曲保藏法）称取麸皮，加适当水拌匀。

把拌匀的麸皮分装于小试管，高约1.5厘米左右，疏松，勿压紧。

塞好棉塞，用防潮纸包好，灭菌30分钟。

冷却后，把要保存的菌种接种于麸皮中，在适当的温度下培养至孢子长丰满后，取出，放于氯化钙的干燥器中，在室温下干燥几天。

将干燥器存放于20℃以下处保存，或将小管在棉塞下边烧熔，封口，然后放于小盒中，低温存放。

使用时，以无菌操作用接种环挑取少量带菌的麸皮，移至新鲜斜面上，在适温下经培养后，即可使用。

2工业菌种制备2.1工业用毛霉种子的特点：不产毒素特别是黄曲霉毒素等，符合食品的安全与卫生要求。

菌种纯、菌丝体长而色白，性能稳定，生长繁殖快，抗杂菌能力强。

生长温度范围宽，培养条件粗放，生长快，有利于常年生产。

能分泌出大量的，高活力的蛋白酶、脂肪酶、肽酶及有利于提高腐乳质量的其他霉系。

能使产品质地细腻柔软，不散不烂，气味鲜香。

2.2一级种子制备菌种检查毛霉菌种的好坏是前期培菌（发酵）的主要关键。

首先要检查使用的菌种，要求菌种纯，菌丝齐壮浓密，无杂菌感染，保存试管内不得有花纹斑点及异味。

若满足以上条件，则前期挑选出的优良菌的保藏菌株即可作为工业发酵的一级发酵种子。

2.3二级种子制备将已选好的毛霉一级种子接种小块于250ml麸皮培养液中活化培养，将培养好的毛霉接种于另一培养瓶，用75%的酒精溶液揩擦消毒，然后瓶内加入消毒过的冷水400ml，用无菌竹筷捣碎毛霉菌丝体，倒在预先准备好的滤布中，将菌液滤在容器内，滤布内的培养基须作两次洗涤，洗涤菌液并入滤液中，配制成菌种悬浮液（每50kg黄豆用800ml长方形培养瓶一个），每50kg 黄豆用菌种悬浮液1000ml。

配制好的菌液，存放时间不宜过长，即为二级种子，在使用时将其摇匀，让孢子成悬浮混合状态，即可投入生产使用。

3毛霉菌种衰退的主要表现优良的菌种是获得优质发酵产品的前提和保证，在实际生产中获得一株优良的菌种，有时候是非常不容易的，即使选到，如果保藏不适当，还会出现退化，影响菌种品质，常见的菌种衰退现象表现在一下几个方面：1、菌落和细胞形态改变：每种微生物在一定的培养条件下，都有一定的形态特征。

如果典型的形态特征逐渐减少，就表现为退化。

腐乳用毛霉在斜面培养基上多次传代后，产生“光秃”型，出现生长不齐或不产孢子的现象即为退化的典型特征之一。

2、生产性能的下降。

毛霉菌种的高产蛋白酶的性能降低，使其分解蛋白的能力下降，影响腐乳风味即为该方面退化。

3、对生长环境的适应能力减弱。

如霉菌中原抗噬菌体菌株变为敏感菌株，或原来能很好利用腐乳里某些营养物质而之后利用率明显降低的现象。

4毛霉菌种退化原因：4.1有关基因的自发突变菌种在正常情况下会发生自发突变。

虽然自发突变的概率很低，但是随着移植次数的增加，退化细胞的数目不断增加，会从劣势逐渐变为优势。

毛霉中如果控制产量的基因发生负突变，则表现为发酵产量下降。

4.2育种后未经很好的分离纯化由于毛霉细胞中含有一个以上的核，经诱变处理后，往往容易形成不纯的菌落，如未经很好的分离纯化，很容易导致核分离，使生产性状发生变化。

如果某一高产菌株是来自一个以上的孢子或细胞形成的菌落，而其中只有一个是高产突变孢子或细胞，那么经过传代，也会导致产量下降。

4.3培养条件的改变培养条件包括温度、pH值、培养基等，如果一个菌种长期生长在不适应的条件下，其优良性状就不易保持。

4.4杂菌污染5防止毛霉菌种退化5.1减少传代次数减少传代次数，可以降低自发突变的几率，这样就减少了菌种发生退化的机会。

5.2充分利用孢子接种由于毛霉菌丝常含有多核，常易引起退化，而霉菌的孢子一般是单核的，故利用孢子接种，可以有效防止菌种退化或推迟菌种退化时间。

5.3选择合适的培养条件培养条件不适宜时，霉菌不能以最优势的生长情况生长，使工业生产效率降低，不适宜的生长环境，还有可能引发霉菌的不定向突变，其中大部分可能为负突变，严重影响菌种质量。

5.4采用好的保藏方法保藏方法的好坏，直接影响着菌种优良性状的稳定性，一般认为利用低温保藏菌种，可以防止基因发生自发突变，遗传型可以得到保持。

5.5经常进行分离纯化无论是在育种时，还是在生产使用时，经常进行分离纯化，进行生产性能的测定时很重要的，这样可以保证菌种纯，及时的淘汰地产菌株，防止菌种进一步的退化。