引物设计步骤

分享：简并引物设计过程及原则简并引物常用于从已知蛋白到相关核酸分子的研究及用于一组引物扩增一类分子。

简并引物设计过程(1)利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。

首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。

随后利用这一序列使用BLASTP(通过蛋白查蛋白)，在整个NR数据库中查找与之相似的氨基酸序列。

(2)对所有的序列进行多序列比对将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W/X, 也可在线分析。

所有序列的共有部分将会显示出来。

“*”表示保守，“：”表示次保守。

(3)确定合适的保守区域设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸残基为宜，使得PCR产物在150~120 0bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸的保守区，因为每条引物至少18bp左右。

若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次的结果反复调整。

最终目的就是有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。

(4)利用软件设计引物当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中Primer 5.0 支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入Primer 5.0 中，将其翻译成核苷酸序列，该序列群可用一条有简并性的核苷酸链来表示(其中R=A/G,Y=C/T,M=A/C, K=G/T, S=C/G, W=A/C/T,B=C/G/T,V=A/C/G, D=A/G/T, N=A/C/G/T, 该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在Primer 5.0 中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。

(5)对引物的修饰若得到的引物为：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3则简并度=4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度很高不利于P CR，可以通过次黄嘌呤代替N(因为次黄嘌呤可以很好的和4种碱基配对)和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度。

这样设计出来的简并引物对，适用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。

简并引物设计原则从蛋白到核酸，请注意：1) 尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区，如蛋氨酸和色氨酸仅有一个密码子。

2) 充分注意物种对密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。

3) 引物不要终止于简并碱基，对大多数氨基酸残基来说，意味着引物的3末端不要位于密码子的第三位。

4) 在简并度低的位置，可用次黄嘌呤(dI)代替简并碱基。

以上几点遵循的总的原则为：尽量降低引物的简并度，尤其在3末端或近3末端一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。

点击Primer，进入引物窗口。

②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。

在Search Parameters里面，可以设定相应参数。

一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。

此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。

该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。

若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。

最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。

但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。

对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。

3、用Oligo验证评估引物①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。

在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。

定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。

引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。

②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的T m值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G 过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。

③Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。

引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。

Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。

④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。

可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。

Analyze中第四项为Composition and T m，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。

上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。

Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，T m值可以控制在50～70度之间。

第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming 分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。

⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。

若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。

⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo 软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。

因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G 窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。

4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。

二、引物设计过程中的心得1、Primer 5.0搜索引物①Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。

当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。

②PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。

至于上限倒也不必要求苛刻。

③Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。

其它参数默认就可以了。

④搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。

当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。