蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明
总蛋白提取方法
Fish & Shellfish Immunology
2012
（IF=3.322）
● Pin Huan et al.
Comparative proteomic analysis of challenged Zhikong scallop (Chlamys
farreri): A new insight into the anti-Vibrio immune response of marine bivalves
分钟。
4. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到总蛋白。
5. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
参考文献：
● Pin Huan, Hongxia Wang et al.
Identification of differentially expressed proteins involved
有效期： 一年。
产品简介： 贝博总蛋白提取试剂盒适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、
神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等哺乳动物组织 中提取总蛋白。提取过程简单方便，可在 1 小时内完成。该试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合 物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。本试剂盒含有的独特配 方能够溶解细胞膜包括细胞质膜和核膜。提取的蛋白可用于 Western Blotting、蛋白质电 泳、免疫共沉淀等下游蛋白研究。
Fish & Shellfish Immunology
2011 Volume 31, Issue 6 , Pages 1186-1192 （IF=3.322）
● Liu Tao, Chen Suhua et al.
组织蛋白提取
鼠脑组织总蛋白提取一：蛋白提取1.脑组织称重，按照1：8（1g脑组织加8ml）的比例计算蛋白酶抑制剂的量(Aprotinin 、Pepstatin、NaF、Na3VO4、Leupeptin ，PMSF不稳定最后取出来加，都是1:100的稀释)和TNE的量，先在每个EP管中加入计算好的TNE再加蛋白酶抑制剂，每个ＥＰ管中加入３颗珠子，用匀浆器匀浆或用研磨棒研磨。
（蛋白酶抑制剂五种从-20拿到4度冰箱中溶解.各取100微升加入10毫升的TNE中（13层析柜中），TNE缓冲液（1.21g Tris,5.84g NaCl,0.37g EDTA/升），2.匀浆完毕后用枪头将混合好的溶液吸入EP管，一般大块组织加600微，小块加300微，4°离心14000转/min，20min。
3.取上清移入新EP管(最好离两次) ，溴酚蓝·甘油·SDS·巯基乙醇等组成samplebuffer（4X），Sample Buffer与蛋白比为3:1，在97度煮5分钟。
防止盖子开，最好用东西盖住。
始终在冰盒中操作，最后蛋白放入-80。
二：测蛋白浓度计算所需BCA的量，按MA:MB:MC=25：24：1的比例配好，每个孔总量为300ul,BSA:A-I各加150ul,Mix加150ul因BSA是溶解在NaCl，故加样时蛋白溶液和0.9%NaCl共加150ul(蛋白3ul,NaCl 147ul)注意加样时要加复孔。
酶标仪震荡5s37°孵育2小时Western Blot的有效检测下限为0.1-1ng蛋白提取可以分为三个步骤：第一步获取材料。
第二步分离目的细胞或组织成份并破碎。
细胞破碎的方法分为机械法和非机械法，机械法可以是振动、搅拌、研磨、压滤、超声、匀浆，非机械法可以是干燥、改变渗透压、冻融、酶解（纤维素酶、溶菌菌、蜗牛酶）等，不同来源的材料对于不同的处理方法耐受程度是不一样的，例如超声波可以很容易破碎动物细胞，但是破碎酵母细胞就困难许多。
PH0711 磷酸酶抑制剂(50×) 操作手册
Phosphatase Inhibitor (50×)
货号：PH0711 规格： 1mL | 5mL 保存：-20℃保存
产品简介
磷酸酶抑制剂(50×)为多种磷酸酶抑制剂混合液，可有效抑制酪氨酸磷酸酶、丝氨酸磷酸酶、苏氨酸磷酸酶、酸性和碱性磷 酸酶等各种磷酸酶。适用于动物细胞或组织蛋白的提取，能最大程度地保持蛋白质磷酸化，常用于动物细胞或组织中蛋白激 酶活性和信号传导的研究。该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
使用说明
按照缓冲液：磷酸酶抑制剂(50×)=49:1 的比例，配制 1×的含磷酸酶抑制剂的工作液， 或者直接把磷酸酶抑制剂加入所需 工作液中反复冻融的次数，以免失效。
（2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
1
蛋白酶体抑制剂作用机制_概述说明以及解释
蛋白酶体抑制剂作用机制概述说明以及解释引言部分内容：1.1 概述蛋白酶体抑制剂是一类能够干扰细胞内蛋白酶体功能的化合物或分子。
蛋白酶体是细胞中主要负责蛋白质降解的细胞器，通过这一过程可以清除老化、变性或异常的蛋白质，并参与调控许多生物学过程。
因此，研究和理解蛋白酶体抑制剂的作用机制具有重要的理论和实践意义。
1.2 文章结构本文主要从以下几个方面对蛋白酶体抑制剂作用机制进行探讨：首先介绍了什么是蛋白酶体抑制剂以及其在细胞中的功能和调控；接着概述了常见的蛋白酶体抑制剂及其分类，并阐述了它们在药物研发中的应用和前景展望；然后解释了蛋白酶体抑制剂对蛋白降解途径和产生效果的机理，并探讨了其对生物学意义和影响因素；最后总结了文章的主要内容，并展望了蛋白酶体抑制剂在未来研究和应用方面的发展。
1.3 目的本文旨在对蛋白酶体抑制剂的作用机制进行综述，希望通过深入探讨蛋白酶体抑制剂对细胞内蛋白酶体的影响，加深我们对这类化合物或分子的理解，并为进一步研究和开发具有潜力的药物提供参考。
相信通过本文的阐述，读者能够更好地认识和理解蛋白酶体抑制剂在生物学领域中所扮演的关键角色。
2. 蛋白酶体抑制剂的作用机制:2.1 什么是蛋白酶体抑制剂:蛋白酶体抑制剂是一类能够干扰蛋白酶体功能的化合物或药物。
蛋白酶体是细胞内起着关键作用的小囊泡结构，负责进行细胞内的蛋白质降解和回收。
2.2 蛋白酶体在细胞中的功能和调控:蛋白酶体参与了多种生物学过程，包括细胞周期调控、免疫应答、应激响应以及疾病发展等。
蛋白酶体内含有多种不同类型的蛋白水解酶（即蛋白酶），它们协同作用来降解细胞内已经老化或异常的蛋白质，并将其分解成氨基酸片段供细胞再利用。
2.3 蛋白酶体抑制剂对蛋白酶体的影响与作用机制:蛋白酶体抑制剂可以干扰或阻止蛋白酶体的正常功能。
它们通过不同的机制影响蛋白酶体，例如抑制蛋白酶体中的水解酶活性、阻止蛋白质进入蛋白酶体或干扰蛋白质在蛋白酶体内的降解过程。
蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明
蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明转自:http://www.bioas/html/980.html在与蛋白相关的检测中，最关键的一步便是蛋白质的提取。
在提取的过程中，我们要经常加入以防止。
另外在磷酸化蛋白的研究过程中，也是必不可少的。
本文详细总结了常用的P MSF、 Leupep tin亮肽素、Aproti nin抑肽酶、Pepsta tin胃、EDTA-Na2等以及NaF氟化钠、Na3VO4原矾酸钠、Beta-glycer ophos phate甘油磷酸钠、Na2P2O4焦磷酸钠等的溶液配制、贮存液与工作液浓度及保存条件。
一、蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。
溶解性：溶于异丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。
在水溶液中不稳定。
在100%异丙醇，25℃时稳定至少9个月。
分子量：174.2使用：贮存浓度200mM，工作浓度1m MLeupep tin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B。
溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。
4℃一周稳定，分成小份，冷冻在 -20℃至少6个月。
分子量：C20H38N6O4×1/2 H2SO4:475.6 C20H38N6O4x 1/2 H2SO4× H2O:493.6使用：贮存浓度1m g/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)。
Aproti nin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。
不抑制凝血酶或因子X。
溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。
胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒使用说明
胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒使用说明产品编号：C7610包装规格：50Assays产品组成:胞质提取Buffer55mL线粒体溶解Buffer5mL蛋白酶抑制剂60μL磷酸酶抑制剂300μLDTT60μL产品简介胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒提供独特的组份可以提取动物细胞及组织中的胞质蛋白和线粒体蛋白。
该方法先将完整的有活性的线粒体和胞质蛋白分离，再处理后获得高纯度的有活性胞质蛋白和变性的线粒体蛋白，不需要超速度离心，方法简单，可靠，快速。
可用于1D，2D电泳，Western Blot，Elisa等蛋白质实验。
提取的完整线粒体也可以经过活性溶解液处理，再用于免疫共沉淀，凋亡，细胞信号传导，能量代谢等生理学研究，或进行线粒体DNA提取，用于基因组学后续研究。
本试剂盒可以每次从1×107个培养细胞或200mg组织中提取所需要的蛋白质，可以使用50次。
产品特点1.整个实验过程大约只需要1小时左右。
2.可以从50×107个培养细胞或50×200mg组织中提取所需要的蛋白质或活性线粒体。
3.活性线粒体的提取量高，高效线粒体溶解Buffer提取的蛋白质，可以用于线粒体蛋白质组学研究。
4.不需要超速度离心，可以同时处理多个样品。
运输和保存条件常温下运输，收到后将线粒体溶解Buffer、DTT和蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂于-20℃保存，胞质提取Buffer于2-8℃保存，保质期1年。
操作步骤1.收集不少于1×107细胞，用冷PBS（pH7.4）洗涤细胞两次，每次3000rpm（800g）离心5min；组织样本（200mg）尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，于冰上剪碎，再用冷PBS（pH7.4）洗涤三次。
2.在上述细胞或组织样本中加入1mL胞质提取Buffer（使用前每mL胞质提取Buffer加入1μL蛋白酶抑制剂，5μL磷酸酶抑制剂和1μL DTT），置玻璃匀浆器冰上均质30～50次，置于冰上冷却。
蛋白酶抑制剂成分
蛋白酶抑制剂成分蛋白酶抑制剂是一种可以抑制蛋白酶活性的化合物。
蛋白酶是一种酶类，它在细胞内起着非常重要的作用，可以分解蛋白质分子，使其成为更小的分子。
但是，在某些情况下，过多的蛋白酶活性会导致细胞内的蛋白质被分解得过快，从而对细胞造成伤害。
因此，蛋白酶抑制剂成分可以在一定程度上保护细胞免受蛋白酶的伤害。
目前，已经发现了很多种蛋白酶抑制剂成分，其中一些已经被广泛应用于医学和生物学领域。
以下是一些常见的蛋白酶抑制剂成分：1. 蛋白酶抑制剂-1（Protease Inhibitor-1）蛋白酶抑制剂-1是一种天然存在于人体中的蛋白质，它可以抑制多种蛋白酶的活性。
研究表明，蛋白酶抑制剂-1可以对多种疾病有治疗作用，如心血管疾病、肿瘤、炎症等。
2. 甲基硫代咪唑（Methylthioadenosine）甲基硫代咪唑是一种天然存在于人体中的化合物，它可以抑制多种蛋白酶的活性。
研究表明，甲基硫代咪唑可以对多种疾病有治疗作用，如肿瘤、炎症等。
3. 金黄色葡萄球菌蛋白酶抑制剂（Staphylococcus aureus Protease Inhibitor）金黄色葡萄球菌蛋白酶抑制剂是一种可以抑制金黄色葡萄球菌产生的多种蛋白酶的化合物。
这种化合物可以用于治疗金黄色葡萄球菌感染等疾病。
4. 蛋白酶抑制剂A（Protease Inhibitor A）蛋白酶抑制剂A是一种可以抑制多种蛋白酶活性的化合物。
研究表明，蛋白酶抑制剂A可以对多种疾病有治疗作用，如肿瘤、心血管疾病等。
5. 磷酸二酯酶抑制剂（Phosphodiesterase Inhibitor）磷酸二酯酶抑制剂是一种可以抑制多种磷酸二酯酶活性的化合物。
研究表明，磷酸二酯酶抑制剂可以对多种疾病有治疗作用，如心血管疾病、哮喘等。
总之，蛋白酶抑制剂成分具有广泛的应用前景，在医学和生物学领域都有着重要的作用。
未来，随着科学技术的不断发展，相信会有更多的蛋白酶抑制剂成分被发现，并用于治疗更多的疾病。
磷酸化试剂盒使用方法
磷酸化试剂盒使用方法
1. 组织总蛋白的提取：
- 在1ml的冷裂解液中各加入10ul的磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和PMSF混匀，放置在冰上备用；
- 称取0.1g的新鲜组织，放置于玻璃匀浆器的入口缓冲处，用眼科剪将组织块尽可能的剪碎，然后加入0.5-1ml 的新配置的裂解液，研磨直至没有明显的组织块，这个过程需注意冰上操作；
- 将组织匀浆液移入1.5ml的EP管中，4 ℃ 12000g 离心30min；
- 吸取上清至新的管中；
- 进行蛋白定量或者变性进行蛋白实验。
2. 细胞总蛋白的提取：
- 裂解液的用量：107个细胞需要裂解液1ml；
- 贴壁细胞：弃去培养基，用冷的PBS 洗两次，弃去PBS，然后加入计算好的细胞裂解液；在冰上用细胞刮刀进行刮离细胞，将刮离的细胞裂解液移入EP管中，颠倒裂解20-30min；
- 悬浮细胞：4℃ 400g 离心收集细胞，用冷的PBS洗两次细胞，同样按细胞数加入裂解液，涡旋10s，放置冰上裂解10min，重复3-4次；
- 裂解完毕之后，将细胞裂解液4℃ 12000g离心30min；
- 将上清移入新的EP管中；进行蛋白定量或者变性进行蛋白实验。
请注意，在使用磷酸化试剂盒时，务必仔细阅读相关说明书和安全注意事项，严格按照操作步骤进行，以确保实验结果的准确性和安全性。
如果你还有关于磷酸化试剂盒使用的其他问题，请咨询专业人士。
免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法
免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如protein A/G特异性地结合到免疫球蛋白（抗体）FC片段的现象而开发出来的特异分离富集抗原的方法。
目前多用预先结合固化在Agarose beads上的protein A/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G 、抗体、抗原复合物，利用Agarose beads的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原。
实验步骤：1.处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好细胞模型。
一般3×106细胞/处理(即六孔板一个孔，约200ug总蛋白)。
2.配IP 裂解液：200ul/孔（6孔板），并加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。
注意抑制剂的要现加现用。
3.收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1×PBS（4度）洗1遍，每孔加入200ul IP裂解液，冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中。
4.超声：强度37％，5秒×4次（程序07）。
目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但可能会影响蛋白质之间的相互作用，进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。
5.离心细胞裂解液：4度10000rpm 10 分钟。
6.Agrose-proteinA/G清洗：一般1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G（不同公司产品可能不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量与结合抗体的用量一致。
取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul1×PBS（4度）洗两遍，5000rpm×2分钟，吸掉上清备用。
7.细胞裂解液预清洗：为去除非特异作用，细胞裂解液先用Agrose-proteinA/G预清洗。
常用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的贮存与工作液浓度
常用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的贮存与工作液浓度在与蛋白相关的检测中，首先最关键的一步便是蛋白质的提取。
蛋白质的提取过程中，我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。
另外在磷酸化蛋白的研究过程中，磷酸酶抑制剂也是必不可少的，本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF，Leupeptin 亮肽素，Aprotinin抑肽酶，Pepstatin胃蛋白酶抑制剂，EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠，Na3VO4 原矾酸钠，BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠，Na2P2O4 焦磷酸钠等。
对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制，贮存液与工作液浓度，保存都做了详细的说明。
蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶（可逆的地面处理）。
溶解性：溶于异丙醇，乙醇，甲醇和丙二醇果>10mg/ml。
在水溶液中不稳定。
在100%异丙醇，+25℃时稳定至少9个月分子量：174.2使用：贮存浓度：200mM，工作浓度：1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纤溶酶，和组织蛋白酶B 溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。
4℃一周稳定,分成小份冷冻在-20℃至少6个月分子量：C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6使用：贮存浓度：1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶，激肽释放酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶的高活性。
不抑制凝血酶或因子X。
溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如，tris，0.1M，pH8.0）。
pH约7-8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。
避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。
IP实验步骤
一原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。
抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。
建议仔细检查抗体的说明书。
特别是多抗的特异性是问题。
其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。
多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。
为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。
另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。
即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP 成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。
每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。
抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。
缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
欲速则不达，确定好比例很必要。
IP实验步骤蛋白酶抑制剂的用量：0.5%磷酸酶抑制剂的用量：1%Lysis buffer的用量：一般是细胞离心体积的5-10倍。
6孔板加200-300ul左右。
基本实验步骤（1）弃培养液，PBS清洗细胞一遍。
收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min，超声破碎3-5S，4℃离心，12,000g，30 min后取上清20ul；（置于冰上操作）给取的上清液中加入20-30ul 2×loading buffer.（2）取少量裂解液（25-30ul）以备Western blot。
IP步骤
IP(Immunoprecipitation)基本步骤1．细胞采用PBS洗涤（冰上预冷）3遍，每皿（直径=10cm）加入RIPA完全裂解液（冰上预冷）（含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂）300～500微升，刮取细胞（刮刀预冷），转移入EP管（管子预冷）中，放入冰上，裂解2h，12000rpm×30min，收上清，弃沉淀。
此时可于上清中取数十微升，与等体积2×SDS细胞裂解液混合，作为WB上样的input组。
2．其余上清与适量IP的抗体混合（每10cm皿加入1～2ug抗体），4℃结合，过夜。
3.第二天，根据抗体类型不同，如下表，根据抗体片段中IgG的类型选择。
一个简单的方式是鼠抗采用protein A，兔抗采用protein G沉淀。
（有时可两个凝胶等比例混合用），用量参照说明书或每10cm皿20ul凝胶足够。
将protein G 或（和）protein A 采用RIPA不完全裂解液（不含抑制剂和甘油）洗涤3次，每次1min×2000rpm×4℃，后采用RIPA完全裂解液（预冷）重悬，均匀分配到过夜结合的样本中，4℃结合（最短3h，也可4℃过夜）；4. 最后4℃13200rpm×30min，上清可留作，沉淀再次用RIPA半裂解液洗两次（5min×3000g×4℃），后加1×SDS煮15min，定量，保存备用，液体配方：RIPA裂解液：10ml10%去氧胆酸钠0.25mlEDTA(500mmol/L, ph 7.4) 20ul100* cocktail 相应体积100*PMSF (100mmol/L) 相应体积磷酸酶抑制剂相应体积Protein G calbiochem 货号539207Protein A invitrogen 货号404489RIPA基础液(温和型)可从大部分试剂公司购买到一下摘自网络：1.除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外，去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。
最全的WesternBlot(WB)技术手册
最全的western blot技术⼿手册蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。
本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。
A 蛋白样本提取制备1 细胞或组织裂解2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂3 蛋白定量4 电泳上样样品的准备B 电泳1 PAGE胶的制备2 蛋白分子量Marker3 阳性对照4 内参对照5 上样与电泳C 转膜与显色（Western Blot）1 胶中蛋白的检测2 蛋白转膜3 膜上蛋白的检测：丽春红4 膜的封闭5 一抗的孵育6 二抗的孵育7 显色D 常见问题分析与解决方案附录1 WB实验试剂配制方法附录2 SDS-PAGE胶的配制WB概述: 检测原理:A 蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择）3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂） 4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
A-1 细胞或组织裂解A-1-1 细胞裂解裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒全细胞NP-40 or RIPA（附录1）全蛋白抽提试剂盒细胞质（可溶蛋白）Tris-HCl（附录1）胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质（细胞骨架等不溶蛋白）Tris-Triton（附录1）蛋白分级抽提试剂盒细胞质（磷酸化蛋白）磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA（附录1）膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA（附录1）核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA（附录1）线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法：1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2）2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2 flask).3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，44℃摇动30 min54℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力）6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.A-1-2 组织裂解1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).4 4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,3A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL，或按下表配制：备注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下：所有步聚均需在通风橱中进行：1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液.2. 用盐酸HCl 调至pH 9.03. 煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发.4. 冷却至室温5. 再调pH 至 9.06. 再煮沸至无色7. 重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH 9.08. 用水定容至原体积9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用.A-3 蛋白定量Bradford 法 Lowry 法或BCA 法（均有商品化试剂盒可选择，操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。
免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程
免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的protein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer (1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法) 做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer 洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(细菌抽提用, 50X)
白酶、金属蛋白酶等)和磷酸酶(如丝氨酸/苏氨酸、酪氨酸、酸性及碱性磷酸酶等)。适用于 Western Blot 和免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质、蛋白激酶活性测定等。
使用方法： 1、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物（50X），使用时分别按照 1:50 的比例加入到裂解液中，混 匀后即可使用。含有蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物的裂解液宜现用现配，不宜配制后冻存待后续使用。 2、根据需要，0.05M 的 EDTA 也按照 1:50 的比例加入到裂解液中。
蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(细菌抽提ห้องสมุดไป่ตู้, 50X) 货号：P1264 规格：100T 保存：-20ºC 保存，有效期 12 个月。
产品组成：
产品名称 蛋白酶抑制剂混合物(细菌抽提用，50X)
磷酸酶抑制剂混合物(50X) 0.05M EDTA, pH 8.0
规格
2×1mL 2×1mL 2×1mL
北京索莱宝科技有限公司
保存 -20ºC 避光
-20ºC RT
产品说明： 细菌提取物中含有许多内源性的蛋白酶、磷酸酶等，容易导致提取物中的蛋白降解或去修饰，从而
影响后续的蛋白检测。因此在提取物中添加适当的蛋白酶、磷酸酶等抑制剂是防止蛋白降解和去修饰的 有效方法。
本产品用于细菌蛋白提取的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，包含了广谱的丝氨酸、半胱氨酸和酸性蛋 白酶抑制剂/氨基肽酶抑制剂，以及丝氨酸/苏氨酸、酪氨酸、酸性及碱性磷酸酶抑制剂。如用于检测金属 蛋白酶活性，则不宜添加 EDTA。以 1:50 的比例分别把蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(细菌抽提用, 50X)和 0.05M EDTA 加入裂解液中，即可用于细菌蛋白的提取，并有效抑制蛋白降解。
血浆蛋白提取方法
1. 提取液制备：每 200ul 蛋白提取液中加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置
冰上备用。
2. 取全血样品，4℃，3000g 条件下离心 20 分钟，留上清，弃沉淀。 3. 取上清血浆，每 100ul 血浆样本中加入 200ul 蛋白提取液，充分混匀后，在 4℃
条件下静置 5 分钟。
4. 在 4℃，14000g 条件下离心 10 分钟。 5. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到血浆蛋白。 6. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。 7. 根据相关实验要求用蛋白稀释液稀释血浆蛋白样品至所需浓度。
BB-3125
蛋白酶抑制剂混合物
BB-3301
昆虫蛋白提取试剂盒
BB-3126
真菌蛋白提取试剂盒
BB-3127
磷酸化蛋白提取试剂盒
BB-3105
磷酸酶抑制剂混合物
BB-3311
总蛋白提取试剂盒（2D 电泳用） BB-3181
细菌蛋白提取盒（2D 电泳用） BB-3182
植物蛋白提取盒（2D 电泳用）
血浆总蛋白提取试剂盒
产品组成：
产品组成 规格
蛋白提取液 蛋白稀释液 蛋白酶抑制剂混合物 使用说明书
BB-3137-1 50T 10ml 15ml 100ul 1
BB-3137-2 100T 20ml 30ml 200ul 1
产品简介： 贝博血浆总蛋白提取试剂盒适用于从各种动物血浆样本中提取总蛋白。
使用方法：
BB-3183
酵母蛋白提取盒（2D 电泳用） BB-3185
细菌膜蛋白提取盒（2D 电泳用） BB-3187
线粒体蛋白提取盒（2D 电泳用） BB-3191
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蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
全蛋白抽提试剂盒
凯基全蛋白提取试剂盒Cat Number：For Research Use OnlyStore at 4℃ for one yearExpire date：一、 试剂盒说明本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取全蛋白， 用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer匀浆裂解组织或细胞，作用温和，提取过程简便高效。
获得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀等后续研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂。
二、 试剂盒组份组份 KGP250 （50 tests） KGP2100（100 tests）储存温度 Lysis Buffer 50 mL 100 mL 4℃磷酸酶抑制剂 250 μL 500μL -20℃蛋白酶抑制剂 50 μL 100 μL -20℃PMSF（100mM）500 μL 1000 μL -20℃L三、 操作步骤Ⅰ 实体组织蛋白的提取1． 在每1mL 冷Lysis Buffer加入5 μL磷酸酶抑制剂， 1 μL蛋白酶抑制剂和 5μL 100mM PMSF，混匀。
冰上保存数分钟待用。
2． 每100mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入0.5～1 mL冷 Lysis Buffer，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作；3． 取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管，离心10000转/分，4℃离心5 min；4． 取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford法、BCA法）；5． 分装保存于-70℃,避免反复冻融。
Ⅱ 培养细胞蛋白提取1． 贴壁培养的细胞，吸去培养基后，加入10mL/150mm培养板的冷PBS洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液；2． 悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞，将细胞及培养液移至离心管中， 1000转/分离心10 min，再用10mL/150mm培养板的冷PBS，1000转/分离心5 min洗两次；3． 在每 1mL冷 Lysis Buffer加入5μL磷酸酶抑制剂， 1μL蛋白酶抑制剂和5μL 100mM PMSF，混匀。
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蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明
一、蛋白酶抑制剂
PMSF：
特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。
溶解性：溶于异丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。
在水溶液中不稳定。
在100%异丙醇，25℃时稳定至少9个月。
分子量：174.2
使用：贮存浓度200mM，工作浓度1mM
Leupeptin 亮肽素
特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B。
溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。
4℃一周稳定，分成小份，冷冻在-20℃至少6个月。
分子量：C20H38N6O4 ×1/2 H2SO4:475.6 C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 × H2O:493.6
使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)。
Aprotinin抑肽酶
特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。
不抑制凝血酶或因子X。
溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。
pH约7~8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。
避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。
分子量：6,512
使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.06~2.0 ug/ml(0.01~0.3 uM)。
Pepstatin胃蛋白酶抑制剂
特性：抑制天冬氨酸（酸）蛋白酶如胃蛋白酶、肾素、组织蛋白酶D、凝乳酶、许多微生物酸性蛋白酶
溶解性：溶于甲醇约1mg/ml；可溶于乙醇，过夜溶解可达到1 mg/ml；在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。
4℃稳定一周，分装储存于-20℃时可保存1个月。
分子量：685.9
使用：贮存浓度1mg/ml，使用浓度0.7 μg/ml(1 μM)。
EDTA-Na2
特性：金属蛋白酶抑制剂
溶解性：溶于水至0.5M，在pH8-9的条件下，4℃稳定至少6个月
分子量：372.24
使用：工作浓度0.2~0.5 mg/ml(0.5~1.3 mM)，不需现用现配，在溶液pH值调至8~9时再加入。
二、磷酸酶抑制剂
NaF氟化钠
溶解性：溶于水
分子量：41.99
使用：贮存液5M，工作浓度10~20mM。
Na3VO4原矾酸钠
分子量：183.91
溶解性：溶于水，我们购买过来的是原矾酸钠。
原矾酸钠需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠，激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用。
原因：原钒酸钠有一定程度的聚合，使用前要激活使之变成单体才有最大抑制效价
原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是：100mM 原矾酸钠激活储存液配制
(1). 取0.183克的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中，加酸调节PH至10(颜色变黄)。
(2). 煮至无色
(3). 室温冷却
(4). 重调pH至10
(5). 重复(1)(2)(3)(4)直至溶液保持无色，并且pH稳定于10，分装100ul/管，每10ml裂解液加一管。
使用：贮存液100mM，工作浓度1mM，-20度保存。
Beta-glycerophosphate 甘油磷酸钠
溶解性：溶于水
分子量：306.11
使用：贮存液100mM，工作浓度25mM。
Na2P2O4焦磷酸钠
溶解性：溶于水
分子量：265.9
使用：贮存液100mM，工作浓度1-2 mM。