分子生物学方法鉴定由自毙鼠分离的细菌

中国媒介生物学及控制杂志 2014 年 8 月第 25 卷第 4 期 Chin J Vector Biol & Control, August 2014, Vol.25, No.4
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仪上完成。大肠埃希菌毒素基因、志贺菌/沙门菌特异 基因、大肠埃希菌 O104∶H4 基因检测的实时荧光检测 试剂盒，由上海辉睿生物科技有限公司提供。 1.3 16S rDNA 鉴定属种 利用 16S rDNA 通用引物 （8F/1492R）对 全 长 约 1500 bp 片 段 基 因 扩 增 ，引 物 为 ：8F（AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG），1492R （GGT TAC CTT GTT ACG ACT T）。产物纯化后，进行 DNA 测 序 ，经 Blast 与 GenBank 中 的 已 知 序 列 进 行 同 源 性 比 较 ，判 定 细 菌 种 属 ，相 似 度 ≥97% 判 定 为 同 一 属 ，相 似 度 ≥ 99% 判 定 为 同 一 种［2-3］，并 构 建 进 化树。 1.4 荧光 PCR 检测 对 X175 菌株进行致泻性大肠埃 希 菌 毒 素 基 因（stx1、stx2、eae、lt/st、aggR、ipaH）、志 贺 菌/沙门菌特异基因检测、大肠埃希菌 O104∶H4 基因 检测。PCR 扩增程序：预变性 95 ℃ 5 min，循环 1 次， 变性 95 ℃ 10 s、退火、延伸及检测荧光 58 ℃ 45 s，扩 增 40 个循环。 1.5 致病性大肠埃希菌毒力基因检测 参照大肠埃 希菌 O104∶H4 型及 O157 型的 9 个毒力基因，基因名称 和引物见文献［4］，采用 PCR 检测技术对 X175 菌株进 行检测。毒力基因扩增条件：94 ℃预变性 3 min，按 94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，扩 增 30 个 循 环 ，
－－－－－－－－－
O157
＋＋＋＋－－－－－
O104∶H4 － ＋ － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
3讨论
3.1 16S rDNA 鉴定分析 16S rDNA 分子大小适中， 长度约为 1540 bp，存在于所有细菌染色体基因组中， 且突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用、最有用 的“分子钟”［5-6］，常被用作细菌种属鉴定的靶基因［7-8］。 其序列包含 9 或 10 个可变区（variable region）和 11 个 恒定区（constant region），保守序列区域反映了生物物 种间的亲缘关系，而高变序列区域则能体现物种间的 差异。16S rDNA 分子的序列特征为不同分类级别的
表 1 对 X175 菌株进行致病性大肠埃希菌 9 个毒力基因 检测结果
Table 1 Detection result of 9 EHEC virulence genes in X175 strain
菌株 stx1 stx2 eaeA ehxA aggR aatA aap wzy fliC
X175
Diseases Control and Prevention, Dali 671000, Yunnan Province, China Supported by the Plague Prevention and Control Technology of Yunnan Province Key Laboratory of Run Support（Yunke Base
注：A. ipaH 基因检测；B. O104 基因检测；图中样品 1～3 分别代表 3 个批次的样品。
图 2 采用荧光 PCR 方法对 X175 菌株检测 Figure 2 Detection of X175 strain by real⁃time PCR
2.3 毒力基因检测 对 X175 菌株进行致病性大肠埃 希菌 9 个毒力因子检测结果均为阴性（表 1）。
图 1 X175 菌株与肠杆菌科构建的最小生成树 Figure 1 Minimum spanning tree constructed with X175 strain
and some Enterobacteriaceae bacteria
2.2 荧光 PCR 检测 检测结果显示，X175 菌株 ipaH 基因和大肠埃希菌 O104 基因检测阳性（图 2）；stx1、 stx2、eae、lt、st、aggR、志贺菌特异基因、沙门菌特异基 因、H4 基因检测结果均为阴性。
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·论 著·
分子生物学方法鉴定由自毙鼠分离的细菌
郭英，陈双艳，石丽媛，董珊珊，王鹏
云南省地方病防治所，云南省鼠疫防控技术重点实验室，云南 大理 671000
Molecular identification of a bacterial strain isolated
from a rodent of natural death
GUO Ying, CHEN Shuang⁃yan, SHI Li⁃yuan, DONG Shan⁃shan, WANG Peng Yunnan Provincial Key Laboratory for Plague Control and Prevention, Institute for Endemic
基金项目：云南省鼠疫防控技术重点实验室运行经费资助（云科基发 ［2010］17 号）
作者简介：郭英，女，回族，副主任医师，主要从事鼠疫细菌检验及分子 生物学研究，Email: dbsguoying@126.com
对 X1 菌株从分子生物学的角度进行了较全面系统的 鉴定。
1 材料与方法
1.1 实验菌株及对照 DNA 被试菌株 X175 是从自 毙 鼠 脏 器 标 本 中 培 养 出 的 原 代 病 原 菌 ，由 云 南 省 地 方 病 防 治 所 提 供 ；对 照 菌 株 为 大 肠 埃 希 菌 标 准 株 O157 和大肠埃希菌 O104∶H4，DNA 样本由上海辉睿 生物科技有限公司提供。 1.2 主要试剂和仪器 LB 培养基、PCRMIX 管〔生工 生物工程（上海）股份有限公司提供〕、GoldviewTM DNA 染料（赛百盛公司），PCR 扩增在 biometra 全自动 PCR
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中国媒介生物学及控制杂志 2014 年 8 月第 25 卷第 4 期 Chin J Vector Biol & Control, August 2014, Vol.25, No.4
近缘种系，为系统分类奠定了分子生物学基础。 本研究利用 16S rDNA 鉴定技术成功鉴定 X175
菌株与大肠埃希菌高度同源，与 NCBI 数据库很多大 肠埃希菌的菌株相似度达 99%，根据判定标准可以 确定 X175 菌株为大肠埃希菌，具体型别需做进一步 分析。 3.2 ipaH 基 因 检 测 分 析 侵 袭 性 质 粒 抗 原 H （invasive plasid，ipaH）是存在于所有志贺菌属和肠侵 袭性大肠埃希菌（EIEC）质粒上的侵袭基因编码的抗 原，是侵袭力的特异标志，与患者腹泻相关［9］。本研究 应用荧光 PCR 技术，对 X175 菌株进行 ipaH 基因检测， 结果显示 3 个重复的 ipaH 基因检测结果阳性。提示： 该菌株可能为志贺菌属或 EIEC；进一步的实验显示， stx1、stx2、eae、lt、st、志贺菌/沙门菌基因检测结果均为 阴性，排除该株菌为志贺菌属和沙门菌属，确定其为 EIEC，该结果与上述 16S rDNA 鉴定结果一致，具体属 种需做进一步鉴定。 3.3 大肠埃希菌 O104 基因检测分析 结合 16S rDNA 鉴定结果，X175 菌株与大肠埃希菌 O104∶H4 的相似 度达 99%，为确定其是否为该型别的菌株，对 X175 菌 株进行了大肠埃希菌 O104 和 H4 的基因检测。
Hai［r 2010］No. 17）
Abstract: Objective To identify the genus, species, and type of a bacterial strain (X175) isolated from a ro源自文库ent of natural
death. Methods The species and genus of X175 were identified based upon 16S rDNA sequencing. Real⁃time PCR was used in the detection of toxin genes commonly detected in diarrheagenic Escherichia coli (stx1/stx2/eae, lt/st, aggR/ipaH) and genes of E. coli O104 gene and H4 gene. Nine virulence genes of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O104∶H4 were detected by PCR. Results The 16S rDNA sequence of X175 strain was 99% homogeneous to that of strains of E. spp., and was most closely related to E. coli O104∶H4 in phylogenetic analysis. E. coli O104 gene and ipaH were detected, while stx1/stx2/eae, lt/st, aggR, Shigella/Salmonella, and E. coli H4 gene were not. None of the 9 virulence genes of EHEC O104∶H4 was detected. Conclusion X175 is an attenuated strain of E. coli O104. H antigen and some other features remain to be further studied. Key words: Escherichia coli; 16S rDNA; Virulence gene
摘要：目的 对 1 株由自毙鼠分离的细菌（X175 菌株）进行属、种及型的鉴定。方法 ①采用 16S rDNA 对 X175 菌株进行 种属鉴定；②应用荧光 PCR 检测 X175 菌株是否存在致泻性大肠埃希菌常见毒素基因（stx1/stx2/eae、lt/st、aggR/ipaH）及大 肠埃希菌 O104、H4 基因；③应用 PCR 检测 X175 菌株是否存在肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O104∶H4 的 9 个毒力基因。 结果 ①经 16S rDNA 鉴定，X175 菌株与大肠埃希菌埃希菌属的一些菌株相似度达 99%，进化树显示 X175 菌株与大肠埃 希菌 O104∶H4 菌株的亲缘关系较近；②大肠埃希菌 O104 基因和 ipaH 基因检测结果均为阳性，stx1/stx2/eae、lt/st、aggR、志 贺菌/沙门菌、H4 等基因检测结果均为阴性；③肠出血性大肠埃希菌 O104∶H4 九个毒力因子检测结果均为阴性。结论 X175 菌株为大肠埃希菌 O104 弱毒型菌株，H 抗原和其他一些特性还需进一步研究。 关键词：大肠埃希菌；16S rDNA；毒力基因 中图分类号：S443；R378.2+1 文献标志码：A 文章编号：1003-4692（2014）04-0306-03 DOI：10.11853/j.issn.1003.4692.2014.04.005
1988 年，在景洪镇州种猪场内发生一起鼠类大量 死亡现象，从自毙鼠脏器标本中分离到 1 株细菌（命名 为 X175 菌株）。该菌株在光学显微镜下观察为两极浓 染的革兰阴性菌，后通过实验排除了鼠疫菌［1］。随着 第二代细菌鉴定技术的快速发展，特别是 16S rDNA 鉴 定种属方法，为鉴定该菌株提供了技术基础。本研究 通过 16S rDNA 鉴定种属，并采用荧光 PCR 方法对致泻 性大肠埃希菌的毒力因子及 O104 基因等进行了检测，
72 ℃延伸 5 min。PCR 产物在 1.0%的琼脂糖凝胶上电 泳，自动成像仪进行成像分析。 2结果 2.1 16S rDNA 鉴定种属 X175 菌株与大肠埃希菌埃 希菌属的一些菌株相似度达 99%，初步判断为大肠埃 希菌属，且与 Escherichia coli O104∶H4 菌株及 E. coli UMN026 株的相似度为 99%。选取肠杆菌科为比对 库，进行 Blast 比对并构建最小生成树（图 1）。