几种扫描电子显微镜植物样品的制备技术
扫描电子显微镜样品制备技术综述
扫描电子显微镜样品制备技术韩玉泽扫描电子显微镜样品制备技术扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子,一般扫描电镜图象均为二次电子图象.由于扫描电镜具有高分辨率,景深长等特点,故其图象层次丰富,立体感强,可显示细胞和组织的三维结构形貌,故广泛应用于生物样品表面及其断面的微细结构观察.近年来,扫描电镜所取得的迅速发展表明,仪器本身性能如分辨力和多功能等的不断提高固然重要,但样品制备技术的改良和日趋完善,对扫描电镜的应用与发展确实起到了积极促进作用,因此样品制备的质量,是直接决定扫描电镜能否发挥最佳性能并排除理想图片的关键所在.所以,自1966 年第一台商品扫描电镜诞生以来,扫描电镜样品制备技术问题,一直是电镜工作者们苦心钻研,不断创新的一个重要领域扫描电镜生物样品制备的基本要求生物样品与金属﹑矿物材料不同,它具有质地柔软,容易变形﹑导电性能差﹑二次电子发射率底以及含水量多(有的含水可达80％以上)等特点.因此,在对于高真空状态下的生物针对生物样品的特殊性,在进行扫描电镜样品制备时,一般要掌握以下原则:(一)每一操作过程,都应注意防止对样品的污染和损伤,使被观察的样品尽可能地保持原有的外貌及微细结构.(二)去除样品内水份,以利于维持扫描电镜的真空度和防止对镜(三)降低样品表面的电阻率,增加样品的导电性能,以提高二次电子发射率,建立适当的反差和减少样品的充放电效应.(四)无论观察组织细胞的表面或内部微细构造,都应注意确认和保护样品的观察面.二、SEM生物样品制备的基本操作程序在SEM生物样品制备过程中，除比较坚硬的组织（如骨骼、牙齿、指甲、毛发，贝壳、昆虫及某些植物样品）需要采用某些特殊制备技术者（如管道铸型扫描、低电压观察法等）以外，一般生物组织均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本程序处理以后，才能进行SEM观察。
SEM生物样品制备的基本程序（一）取材SEM样品的取材，与透射电镜的超薄切片法一样，是整个样品制备过程中的关键步骤之一。
光学和电子显微镜样品制备
光学和电子显微镜样品制备光学和电子显微镜样品制备制片法显微制片法一般包含切片法、整体封片法、涂片法和压片法4类。
①切片法。
光学显微镜的切片厚度在2～25微米之间，一般动植物料子的切片以厚10微米左右为合适。
切片法依据包埋剂的不同而有所不同。
常用的是石蜡切片法、棉胶切片法、冰冻切片法、乙二醇甲基丙烯酸脂法（简称GMA法）。
石蜡切片法包含固定、包埋、切片、染色、脱水和封固等步骤。
关键是把生物料子用石蜡包埋，以石蜡为支持物，把浸在蜡块中的生物料子切成理想的薄片。
操作过程为：固定→水洗→从低浓度逐级到高浓度酒精脱水→二甲苯透亮→浸蜡→包埋→切片→贴片→二甲苯脱蜡→逐级从高浓度到低浓度酒精处置，最后过渡到水→染色→逐级从低浓度到高浓度酒精脱水→二甲苯透亮→树脂胶封固。
其中的基本步骤在各种制片技术中都是相同的。
②整体封片法。
用于单细胞、微小生物体或分散的器官的整装制片方法。
此法也需要经过固定、染色、脱水、透亮和封固各个步骤。
草履虫和昆虫口器制片即用此法。
③涂片法。
把易于分散的生物标本涂布在载玻片上的制片方法。
血液涂片便是一例。
④压片法。
将天然的、易于分散的组织或经过处置后易于分散的组织，如动物的精母细胞、根尖细胞等放在载玻片上、再加盖玻片，用力压碎组织，使细胞或细胞内的结构铺展成一层的制片方法。
压片法常用于察看染色体，通常用醋酸洋红、地衣红和石炭酸复红染色。
光学和电子显微镜样品制备技术透射电子显微镜制片技术透射电子显微镜制片技术其基本要求是：①尽可能保持料子的结构和某些化学成分生活时的状态。
②料子的厚度一般不宜超出1000埃。
组织和细胞，必须制成薄切片，以获得较好的判别率和充足的反差。
③采纳各种手段，如电子染色、投影、负染色等来提高生物样品散射电子的本领，以获得反差较好的图像。
样品制备的方法随生物料子的类型以及讨论目的而各有不同。
对生物组织和细胞等，一般多用超薄切片技术，将大尺寸料子制成适当大小的超薄切片，而且利用电子染色、细胞化学、免疫标记及放射自显影等方法显示各种超微结构、各种化学物质的部位及其变更。
扫描电镜样品制备
扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。
而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。
因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。
扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。
例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。
我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。
此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。
主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。
此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。
如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。
另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。
对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。
但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。
∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。
∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。
样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。
而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。
但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。
扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。
一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。
扫描电镜样品制备生物技术
离子溅射原理
优点：
喷镀颗粒较细，不至于掩盖样品的微细结构 喷镀均匀 二次电子收获量较高
组织导电技术：
原理：金属盐类化合物与生物样品中的蛋白
质、脂类、淀粉等呈化学性结合，使样品表面 离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子之 间，使样品表面电阻降低，从而避免了样品充 电。可避免样品热损伤。
材料防止挤压，观察面做好标记
（二）样品清洁漂洗
一般：生理盐水、5％碳酸钠或与固定液相应的缓冲液 大量粘液：预固定，再用蛋白水解酶 表面形态复杂、皱折凹陷多，不易清洗的样品 ：低频超声波 观察组织、细胞内部结构（如血管等）：灌流清洗后再取材
（三）样品的固定
目的：保持生物样品的微细结构和外部形貌。
扫描电子显微镜样品制备技术
SEM结构
扫描电子显微镜原理
一、常规扫描电镜样品制备技术
样品表面必须清洁 样品要干燥而不失原形 样品要有良好的导电性能 注意辨认和保护观察面
（一）取材要点
材料大小适宜
观察表面结构：直径＜5mm，高度3～5mm 观察内部结构：直径＜2mm，高度3mm± 满足观察内容条件下，样品块尽量小。
原因： 表面张力 目的： 消除表面张力
方法： 空气干燥法 冷冻真空干燥法 临界点干燥法
临界点干燥法
原理：临界状态下表面张力为零 处理液： CO2
临界温度（31.1℃） 临界压力（73个大气压）
操作程序：
取材→双固定→丙酮脱水→中 间液（醋酸异戊酯）置换脱水 剂→液态CO2置换中间液→加 热气化（温度40℃，压力 95~100kg/cm2，3~5分钟） →缓慢放气取样→喷镀→观察。
分辨率为 25 Å （SEM 60 Å ） 4．复型膜由铂、碳粒子组成，可长期保存。
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备扫描电子显微镜是一种大型的分析仪器,主要功能是用于固态物质的形貌显微分析和对常规成分的微区分析,广泛应用于化工、材料、医药、生物、矿产、司法等领域.由于其价格昂贵及特殊的工作原理,它对样品制备有着较高的要求,样品的制备好坏,直接影响着样品分析是否成功,为此,本文着重介绍一下扫描电子显微镜应用中有关样品制备的相关知识和技术.1 扫描电子显微镜对样品的要求(1)样品必须是无毒、无放射性的物质,以保证工作人员的人身安全.(2)样品可以是块状、片状、纤维状;也可以是颗粒或粉末状,无论是什么样的样品都不能是有机挥发物和含有水分.如果将含有水分的样品放在镜筒内能产生三种严重不良后果:一是当真空达不到要求强行通高压时,其产生的水蒸汽遭遇高能电子流产生电离而放电引起束流大幅度波动,使所成的像模糊,或根本不能成像;二是造成镜筒污染;三是损坏灯丝,当高能电压通过灯丝时,温度高达2000Ο,碰到水蒸汽而氧化变质或熔断,因此,应先烘干样品中的水分.(3)无论是块状样品,还是粉末颗粒状样品,其化学、物理性质要稳定,在高真空中的电子束照射下,都要能保持成分稳定和形态不变.(4)表面受到污染的样品,要在不破坏样品表面结构的前提下,进行适当清洗、烘干.(5)无论是样品的表面,还是样品新断开的断口或断面,一般不需要进行处理,以保持其原始的结构状态.(6)对磁性样品要预先去磁,以免观察时电子束受到磁场的影响.(7)粉末样品要适量,不易过多;块状样品大小要适合仪器专用样品底座的尺寸,不能过大.一般小的样品座Φ3～5mm,大的样品座为Φ30～50mm,以分别用来放置不同大小的样品,样品的高度一般限制在5～10mm左右.2 样品的制备技术2.1 块状样品的制备对于块状导电样品,基本上不需要进行什么制备,只要其大小适合电镜样品底座尺寸大小,即可直接用导电胶带把样品黏结在样品底座上,放到扫描电镜中观察,为防止假象的存在,在放试样前应先将试样用丙酮或酒精等进行清洗,必要时用超声波清洗器进行清洗.对于块状的非导电样品或导电性较差的样品,要先进行镀膜处理,否则,样品的表面会在高强度电子束作用下产生电荷堆积,影响入射电子束斑和样品发射的二次电子运动轨迹,使图像质量下降,因此这类样品要在观察前进行喷镀导电层的处理,在材料表面形成一层导电膜,避免样品表面的电荷积累,提高图象质量,并可防止样品的热损伤。
扫描电子显微镜的样品制备一些技术
2.样品室内压力达不到要求： （1）注入液态二氧化碳量过少：可能会使样品位于二氧 化碳的气液面交界处，样品受到液体二氧化碳表面张力的 作用，尽管比水的表面张力小的多，但仍会影响样品的精 细结构。 （2）样品室密闭不良：这可能是因为垫圈老化，有裂纹， 或垫圈下有异物等。 3.注入液体二氧化碳困难：主要因为样品室的温度高，没有 事先降温。夏季室温高于30度时更易造成注入困难。降温 的办法有两种：一是用少许液体二氧化碳充盈2-3次，再 放掉气体的二氧化碳；二是用控温钮调制低于室温10度。
脱水处理：对保证金属镀膜装置和电镜的镜筒真空度和防止 样品在高真空状态下的龟裂和变形等有重要的作用。采用不 同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中的水分。
6.2.2 样品的干燥：
1. 自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于表 面比较坚硬或含水分较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、牙 齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材料如 细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到100％， 在大气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要干燥。因为 脱水剂的表面张力系数比水小所以样品在脱水剂中不会过多 变形而影响其结构。
6.1.4常规生物样品制备技术
制备过程如下： ①取材 根据需要，切取适当大小的样品。专门的SEM备有 灵活可动，范围较大的样品台，样品可大些。装在透射电 镜上的扫描附件，活动范围较小，样品直径应在3～4mm左 右。 ②漂洗 用缓冲液把组织表面洗净，否则会影响正常形态， 但以快速和轻巧为宜，尽量保护器官或组织的表面结构， 使其不致因不慎的操作造成人为损伤。 ③固定 用2.5～5％戊二醛/缓冲液在室温或4摄氏度下前固定。 具体时间可根据样品的需要而定，一般单细胞10-30分钟， 较大的或较硬的样品可达1-2h或更长时间。 ④漂洗 用缓冲液洗3次，洗去未结合的戊二醛。 ⑤重固定 1％锇酸/缓冲液4摄氏度下后固定10～60min。有 时为了提高样品的反差和固定效果，可以综合固定液，如 随意选用戊二醛、多聚甲醛、锇酸等按照不同的比例混合 使用。
一种用于扫描电镜观察的幼嫩植物的快速制样方法与流程
一种用于扫描电镜观察的幼嫩植物的快速制样方法与流程以下是一种用于扫描电镜观察的幼嫩植物的快速制样方法：
1.将新鲜植物材料放入试管中，加入FAA固定液中固定24h以上，
若植物组织过于幼嫩，可用50%乙醇配置固定液用于固定。
2.将已固定的材料用系列梯度乙醇进行脱水处理。
3.把经脱水后的材料逐步置于用无水乙醇和纯TO透明剂配成不同
比例的试剂中进行透明处理，脱水、透明的每个步骤操作均采用真空抽气机抽气20分钟，室内自然条件静置30分钟。
4.最后一次抽气完成后，将材料从纯TO透明剂中取出放入培养皿中
静置至材料中TO透明剂挥发完，即可置于扫描电镜下观察。
该方法能较好的保持不同植物包括成熟的及幼嫩组织中细胞的形态。
电镜
3 用组织导电技术制备的花粉形态
杨树
苦竹 他们在扫描电镜中其外观形态均得到了 保持,但分辨率较低,不能在高倍率状态 下观察清楚花粉纹饰
萱草
鹅掌楸
结果表明: 组织导电制备技术可用于植物花粉样品
的低倍观察;但不适用于植物花粉纹饰和突起的超微
结构观察.
4 用临界点干燥技术制备的花粉形态
外观形态和超微结构均保持良好状态
文献三：大叶补血草植物叶片泌盐结构的扫描电镜观察
实验方法：
将叶片切成 0．3 ～ 0．5 cm 长的若干小段，分别放入 4% 戊二醛固定液固定 备用。将固定好的材料采用酒精等级系列脱水，然后喷镀金属膜，在ZEO
1430VP 型扫描电镜下观察和拍照。
1． 大叶补血草叶上表皮，示盐腺 与气孔的分布( × 1 500) ; 2． 大叶补血草盐腺( × 6 000) ; 3． 大叶补血草气孔( × 7 000)
干燥法、正丁醇干燥法等用的相对较少。
几种方法的比较
结论：
在进行扫描电镜生物样品制备时，应根据生物样品的特性、观察 要求和设备条件来选择采用何种干燥方法。 一般来说，含水量较少、细胞壁和蜡质层较厚的植物组织多采用 自然干燥法，而幼嫩、含水分较多的组织则需要选择其他方法。临界 点干燥法和叔丁醇真空干燥法几乎适用于各类型的植物样品，但是考 虑到操作的复杂性，能使用更简便的干燥方法时一般不选用它们。
干燥时间。
5 真空干燥法
真空干燥法指的是将经脱水的样品置于真空容器中进行干燥的方法。
真空干燥法选用高熔点的有机材料( 叔丁醇、乙腈、六甲基二硅胺烷
、正丁醇等) 作升华介质，既保留了冷冻干燥法的优点，又不用对样 品以叔丁醇为升华介质的叔丁醇干燥法，乙腈干燥法、六甲基二硅胺烷
实验三 扫描电子显微镜样品制备及观察
四、实验内容
1．观摩学习扫描电子显微镜的样品的制备制备方 法及基本过程。 法及基本过程。 学习扫描电子显微镜下观察样品。 2．学习扫描电子显微镜下观察样品。 观看扫描电镜照片， 3．观看扫描电镜照片，了解各种不同生物体细胞 的表面空间结构。 的表面空间结构。
五、实验方法与步骤
在老师的指导下学习扫描电子显微镜的样品的制备 制备方法及基本过程， 制备方法及基本过程，并用扫描电子显微镜观察生物 样品。扫描电子显微镜的样品的制备制备的基本过程： 样品。扫描电子显微镜的样品的制备制备的基本过程： 准备样品托：用抛光膏擦净样品托， 1．准备样品托：用抛光膏擦净样品托，然后用 丙酮洗净抛光膏，电吹风吹干备用。 丙酮洗净抛光膏，电吹风吹干备用。 取材：注意保护好被观察表面， 2．取材：注意保护好被观察表面，彻底清洗干 暴露出最佳位置。 净，暴露出最佳位置。样品体积应依据观察要求及样 品托大小等酌情而定。 品托大小等酌情而定。
6．黏贴样品：用少量导电胶涂在样品托上，用镊子轻夹样 黏贴样品：用少量导电胶涂在样品托上， 品侧面，观察面朝上置于样品托上。 品侧面，观察面朝上置于样品托上。 离子溅射镀膜： 7．离子溅射镀膜：把样品托插入离子溅射仪真空实样品 台上，操作溅射仪，可使样品表面覆盖一层10~15nm 10~15nm厚的金 台上，操作溅射仪，可使样品表面覆盖一层10~15nm厚的金 属膜。溅射镀膜的基本原理是，高能粒子轰击金属靶（ 属膜。溅射镀膜的基本原理是，高能粒子轰击金属靶（金、 钯铱和金等）， ），靶金属原子获能后由靶表面逸出而沉 铂、钯铱和金等），靶金属原子获能后由靶表面逸出而沉 积在样品表面，形成连续的导电膜。 积在样品表面，形成连续的导电膜。这种金属膜不仅可以 导电，受激产生较强的二次电子发射， 导电，受激产生较强的二次电子发射，而且使样品表面具 质量—厚度 的一致性。严格地控制膜的厚度， 厚度” 有“质量 厚度”的一致性。严格地控制膜的厚度，是获 得清晰、真实的二次电子表面形貌成像效果的重要条件。 得清晰、真实的二次电子表面形貌成像效果的重要条件。
扫描电镜生物样品制备技术
三、 固定 目的：
保存样品表面的真实结构； 硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品 的损伤； 提高样品的二次电子发射率； 提高样品的耐热性和导电性。
常用的固定剂： 2.5%戊二醛 （1～3h)
1.0%四氧化锇(30’~1h)
固定温度：
室 温，一般以4℃为宜。
四、脱水
要求：不改变样品的体积和表面积的情况 下，去除样品中的水份。 常用的脱水剂：乙醇、丙酮 方法：梯度脱水 时间：视样品大小而定 注意事项：避免裸露，夹伤
缺点：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤， 费时。 适用范围：含水量较多的生物样品
叔丁醇干燥法
（1）乙醇梯度脱水至100﹪/ 2次
（2） 叔丁醇与乙醇混合液置换至100%叔丁醇
70﹪、 80﹪、 90﹪ 、95﹪和 100﹪/ 2次 5 - 10min/次 （3）在样品表面滴上 100%叔丁醇 （4）将标本置于4℃以下使样品快速固化
第五章 扫描电镜生物样 品制备技术
第一节 常规生物样品SEM 制备技术
Features of SEM
高分辨率
Features of SEM
强立体感
Features of SEM
广泛的放大倍率
Features of SEM
应用范围广
生物、医学、动物、材料、 化学、 物理、地质、冶金、矿物、污泥 (杆菌)、机械、电机及导电性样 品如半导体电子材料等
材 料 学 土 聚 水 泥
制备扫描电镜样品的总要求
在不损伤样品原始结构状态 的情况下，保证样品的体积和表 面积不发生改变，充分暴露样品 表面的微细结构 。
生物样品的特性
含水量高 质地柔软 导电性差 二次电子产率低 对热、电子束等敏感
扫描电子显微镜样品的制备
样品制备技术的重要性
样品制备工作是电镜工作中最繁重、最艰 难的工作，又是最重要的环节，熟悉和掌握样 品制备技术是应用电镜来解决问题的首要条件。 根据电镜的类型、研究目的和样品类型及状态 的不同，相应采用不同的制样方法。制样方法 的选择和制样过程的技术控制将直接影响观察 和分析的结果。
高真空扫描电镜样品制备
1. 粉末样品的制 备 湿法:用适合 的分散剂在超声波 清洗器中分散
干法:适宜于不易团聚的样品
2. 块状样品的制备
将欲观察样品的有规律地粘结在样品台上
特殊表面处理--表面蚀刻
表面蚀刻是SEM样品制备的重要方法之一。特别适用于 对大块样品内部的结构形态和多相复合体系的相分布研究。 蚀刻法样品制备主要是基于如下原理：即利用蚀刻剂 与样品中不同组份或不同结构区域之间相互作用速率或程 度的不同，因而可以有选择或优先地溶解或破坏其中的某 一相或组份而保留下另一相或组份。 因此，蚀刻法可用于研究高聚物的结晶形态，以及共 混或填充高聚物中的相分布状态和各相之间的相互作用状 况；无机复合材料的相结构形态等。
送检样品须知
1.送检样品必须为干燥固体、块状、片状、 纤维状及粉末状均可。 2.应有一定的化学、物理稳定性，在真空 中及电子束轰击下不易分解、挥发或变 形。 3.样品无腐蚀性、放射性和磁性。
选择不同的制样方法：电镜的类型(扫描电镜,
透射电镜,电子探针) 要求, 研究目的, 样品类型
形貌观察 1.环境扫描电镜二次电子图像观察的样品制备 2.高真空扫描电镜二次电子图像观察的样品制备 3.背散射电子图像观察的样品制备 成分分析 X射线微区分析的样品制备技术 结构分析 背散射电子衍射的样品制备技术
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图1. HIPS树脂SEM 像 (早期文献 照片），溶剂 蚀刻， 可见 橡胶相被溶解 后留下的空隙
几种扫描电子显微镜植物样品的制备技术
第21卷第2期2002年4月电 子 显 微 学 报Journal of Chinese E lectron Microscopy SocietyV ol 221,N o 12200224文章编号:100026281(2002)022*******几种扫描电子显微镜植物样品的制备技术闭志强,蔡炳华,梁世春3(广西省农业科学院中心实验室,广西南宁530007)摘 要:介绍几种生物样品的扫描电镜制样技术。
这些技术操作简单,快速且实用。
关键词:扫描电镜;临界点干燥;果胶酶;花粉中图分类号:Q336 文献标识码:A 作者简介:闭志强(1956-),男,高级工程师.3现在广西农业科学院水稻研究所工作 随着扫描电镜在各学科领域的广泛应用,其涉及的样品种类日趋繁多,因此需要不断地探索新的制样方法。
本文报道我们建立的几种生物样品扫描电镜特殊制样技术及获得的几张显微照片(图1～5)。
1 野生山楂品种资源分类鉴定扫描电镜制样技术 本实验目的是利用扫描电镜对山楂种子表皮的纹饰进行分类。
由于干燥后的中药山楂果实的种子外表面常附有一层果胶质和残留的果肉,给种子表面分析带来一定的因难,通常是采用酸解和超声波剥离法,但往往不易掌握而造成样品损伤。
通过细胞学观察我们发现果肉与种子皮之间有一层果胶物质,利用果胶酶可以使这层果胶物质分解,从而清除种皮外表面的残余果肉和杂质,获得干净清晰的种皮纹饰照片。
具体方法是:先将种子从果实中剥出,去掉大块的果肉。
用5%的果胶酶(pH515)在25℃酶解30min 至2h (视样品大小而定),用清水洗净凉干,将种子修成大小适宜的片段(视样品座尺寸而定)或不经修整。
经乙醇系列脱水、醋酸异戊酯置换、二氧化碳临界点干燥、离子镀膜仪镀金,在扫描电镜下观察拍照。
2 植物花粉扫描电镜观察法211 外表形态观察制样法一般情况下,我们采用干燥剂脱水法,即将新鲜的花粉收集在培养皿内。
置放于干燥器中过夜,经粘样镀金后直接用电镜观察。
扫描电镜样品制备
离子溅射镀膜法:
在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金 属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行 金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。溅射镀膜法的装置很 简单，主要由真空部分(真空泵)和溅射部分(真空罩)组成， 在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面装有用 于溅射用的金属靶(黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等)，样 品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到10～ 1Pa时，在阴极与阳极之间加上1000～3000V的直流电压， 两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下，罩内残 余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引 轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着 在样品表面而形成金属导电膜。
实验十一 扫描电镜样品制备
选作
扫描电镜即扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，简称SEM）。主要用于观察样品的表面形貌 、割裂面结构、管腔内表面的结构等。
一、扫描电镜工作原理：
主要是利用样品表面产生的二次电子成像来对物质 的表面结构进行研究，是探索微观世界的有力工具。
5. 置换乙醇
吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇1：1的混合 液，浸泡10-20分钟并适当摇动，再吸弃混合液， 加入纯醋酸异戊酯浸泡10-20分钟并适当摇动。
6. 样品的干燥
常规临界点干燥法。
临界点干燥法
• 临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是 消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面 张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如 下：
• 装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用 滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的 样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装 样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷 10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。
生物样品的扫描电镜制样干燥方法
生物样品的扫描电镜制样干燥方法一、本文概述扫描电子显微镜（SEM）是一种广泛应用于生物学、医学、材料科学等领域的高分辨率显微成像技术。
在生物学研究中，SEM被用于观察和分析各种生物样品的超微结构，如细胞、组织、微生物等。
然而，生物样品的电镜制样过程复杂且精细，其中干燥环节尤为关键，因为不当的干燥方法可能导致样品结构变形、失真，甚至破坏。
因此，本文旨在探讨和总结生物样品扫描电镜制样过程中的干燥方法，包括各种方法的原理、优缺点以及应用注意事项，以期为提高生物样品SEM分析的准确性和可靠性提供参考和指导。
二、生物样品扫描电镜制样概述扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）是一种用于观察和研究材料表面微观形貌和组成元素分布的强大工具。
在生物学领域，SEM常被用于研究生物样品的微观结构和形态，如细胞、组织、微生物等。
然而，由于生物样品往往含有大量水分，且结构复杂、易变形，因此在SEM制样过程中，干燥方法的选择和应用至关重要。
生物样品的扫描电镜制样过程一般包括前处理、固定、脱水、干燥、镀金等步骤。
其中，干燥是制样过程中的关键步骤之一。
干燥不当可能导致样品变形、结构破坏、微生物活性丧失等问题，从而影响后续的观察和分析。
因此，选择适合的干燥方法对于保证生物样品SEM制样的质量至关重要。
目前，常见的生物样品干燥方法包括自然干燥、临界点干燥、冷冻干燥等。
自然干燥方法简单易行，但可能导致样品变形和微生物活性丧失；临界点干燥通过控制温度和压力，避免样品在干燥过程中发生收缩和变形，适用于一些对结构要求较高的样品；冷冻干燥则通过在低温下将样品中的水分升华，从而避免样品在干燥过程中发生变形和破坏，适用于一些对微生物活性要求较高的样品。
在实际操作中，应根据样品的性质和研究目的选择合适的干燥方法，并结合其他制样步骤，如固定、脱水、镀金等，以确保制样质量和后续观察的准确性。
随着技术的不断进步，新型的干燥方法和技术也在不断发展，为生物样品SEM制样提供了更多的选择和可能性。
扫描电镜制样
扫描电镜常规制样方法方法一：植物叶片单固定扫描电镜制样方法1．取材将叶子切成5-10mm长方形6-10片。
2．固定放入2.5%戊二醛+2%多聚甲醛固定液中进行抽气（样品无气泡产生，全部沉于底部即可），固定12小时以上。
3．脱水用乙醇逐级脱水30%→50%→70%→80%→90%乙醇，每20 分钟更换一次（70%以前放置4°C冰箱内），100%乙醇每20分钟一次，共5次（70%乙醇以后放置室温脱水）。
4.替换将乙醇倒掉，换叔丁醇，每20分钟一次，共5次。
第5次浸过样品即可，放置冰箱冷冻层（-20°C左右）30分钟或过夜。
5.干燥用JFD-310冷冻干燥仪进行干燥。
6.粘台将上下表皮分别粘在具有双面胶带的样品台上。
7.镀膜用JFC-1600离子溅射镀铂金膜厚约10nm。
8.观察并拍照利用JSM-6360LV扫描电子显微镜进行观察并拍照。
注明：此方法适合植物根、茎样品方法二：植物叶片单固定扫描电镜制样方法1..取材将叶子切成5-10mm长方形6-10片。
2预固定放入2.5%戊二醛+2%多聚甲醛固定液中进行抽气（样品无气泡产生，全部沉于底部即可），固定12小时以上。
3．冲洗0.1M磷酸缓冲液进行冲洗3次，每40分钟一次。
4．双固定用1%四氧化锇（OsO4）进行固定2.5-3小时。
5．冲冼0.1M磷酸缓冲液进行冲洗3次，每5分钟一次。
6．脱水7.用乙醇逐级脱水30%→50%→70%→80%→90%乙醇，每20 分钟更换一次（70%以前放置4°C冰箱内），100%乙醇每20分钟一次，共5次（70%乙醇以后放置室温脱水）。
8.替换将乙醇倒掉，换叔丁醇，每20分钟一次，共5次。
第5次浸过样品即可，放置冰箱冷冻层（-20°C左右）30分钟或过夜。
9.干燥用JFD-310冷冻干燥仪进行干燥。
9．粘台将上下表皮分别粘在具有双面胶带的样品台上。
10.镀膜用JFC-1600离子溅射镀铂金膜厚约10nm。
几种典型扫描电镜生物样本制备
几种典型扫描电镜生物样本制备作者：胡春辉徐青孙璇于浩袁玉清来源：《湖北农业科学》2016年第20期摘要：总结了几种典型扫描电镜生物样本的制备方法。
结果表明，分别采用牙签直接涂抹、在合适的溶剂中超声分散后用铜片和铜网捞取的方法，得到较好的粉末样品扫描电镜图像；微生物在液体或固体培养基中培养后，经戊二醛固定，乙醇脱水和冷冻干燥等处理过程；植物样品根据含水量的不同，选择合适的固定液和干燥方法对样品进行处理；动物样品采用双固定和临界点干燥的方法进行处理；均获得较为理想的扫描电镜图片。
关键词：生物样品；扫描电镜；样品制备；干燥方法；场发射中图分类号：TB383 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5389-04DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.20.056Abstract： This paper explores and summarizes the Scanning Electron Microscope（SEM）preparation methods of several typical samples. The results showed that using toothpick direct smear method，copper and copper net gain by ultrasonic dispersion in suitable solvent to obtain excellent SEM images；Microorganisms in liquid or solid culture were fixed in glutaraldehyde using ethanol dehydration and freeze drying process to prepare the samples；Plant samples under different water content，select the applicable stationary liquid and proper drying methods for the processing of samples；Animal samples were prepared by using the method of double fixed and critical point drying processing； Above all samples are obtain ideal scanning electron microscope images.Key words： biological sample； scanning electron microscope； sample preparation； drying method； field-emission随着科学技术的发展，扫描电子显微镜技术已成为检测物质性能和表征微观结构的重要手段，被广泛应用于食品学、生物学、医学、高分子材料等领域[1]。
扫描电子显微镜样品的制备
优点 提高样品的耐受电子束轰击的能力 提高导电率 提高分辨率（２０Å） 加强固定效果 样品不易产生收缩或损伤，细胞器保存完整
环境扫描电镜样品制备
环境扫描电镜的样品室会通入气体或者水分而 处于低真空的“环境”状态，根据气体电离及 放大原理，非导体及含水样品可以不经表面喷 涂处理（喷金或喷碳）就能直接观察。 环境扫描电镜可以对各种固体和液体样品进行 形态观察和元素（C-U）定性定量分析，对部 分溶液进行相变过程观察。对于生物样品、含 水样品、含油样品，既不需要脱水，也不必进 行导电处理，可在自然的状态下直接观察二次 电子图像并分析元素成分。
止来自于样品组织内部的信息参与成像。
导电处理--真空镀膜法
原理：利用真空镀膜仪在高真空下使金属 加热到熔点以上时，蒸发成极细小的颗粒喷射 到样品上，由于金属的沉积使样品表面形成薄 金属膜。 缺点：金属颗粒粗，膜不均匀，操作费时。 目前较少使用，主要用于制碳膜、碳复型膜和 金属投影。
导电处理--离子溅射法
注意事项：
1、 由于扫描电镜对样品表面的要求非常严 格，必须清洗干净，否则，可导致观察困难或 错误判断。 2、取材时要做到“动作快、环境冷、部位 准”。固定前清洗的组织离体后应在2—3分钟 清洗完毕并投入固定液内；固定后清洗的组织 离体后应在1分钟以内投入固定液。固定液要 预冷，取材部位必须准确。 3、实验动物取材部位不宜多，否则会延误取 材时间，导致组织自溶等人为假象的发生。 4、植物样品在取了样品后要抽真空，使细胞 壁间隙的气体抽出，减少气压，有利于固定液 的渗透。
E.Coli
前固定后未彻底漂洗干净,背景为戊二醛结晶
背散射电子图像观察的样品制备
样品(粉末、块体)的准备与二次电子图像的样 品准备相似。 电子背散射图像由形貌衬度和原子序数两部分 叠加而成。如果样品表面表面存在不平整的现 象会造成了显微形貌有差异的区域，背散射电 子的产额减少，在图像中呈现暗区；但是样品 内的组成元素相差较远，其平均原子序数较高 的部位比平均原子序数较低的部位亮，通过这 一亮度上的差别，可以将原子序数低的区域和 原子序数高的区域明显区分。 由于背散射电子图像观察的样品与原子序数有 关，所以在喷镀处理时要记得不能采用喷金处 理，最好选择喷碳处理。
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第21卷第2期2002年4月
电 子 显 微 学 报
Journal of Chinese E lectron Microscopy Society
V ol 221,N o 12200224
文章编号:100026281(2002)022*******
几种扫描电子显微镜植物样品的制备技术
闭志强,蔡炳华,梁世春
3
(广西省农业科学院中心实验室,广西南宁530007)
摘 要:介绍几种生物样品的扫描电镜制样技术。
这些技术操作简单,快速且实用。
关键词:扫描电镜;临界点干燥;果胶酶;花粉中图分类号:Q336 文献标识码:A
作者简介:闭志强(1956-),男,高级工程师.
3现在广西农业科学院水稻研究所工作
随着扫描电镜在各学科领域的广泛应用,其涉及的样品种类日趋繁多,因此需要不断地探索新的制样方法。
本文报道我们建立的几种生物样品扫描电镜特殊制样技术及获得的几张显微照片(图1～5)。
1 野生山楂品种资源分类鉴定扫描电
镜制样技术
本实验目的是利用扫描电镜对山楂种子表皮的纹饰进行分类。
由于干燥后的中药山楂果实的种子外表面常附有一层果胶质和残留的果肉,给种子表面分析带来一定的因难,通常是采用酸解和超声波剥离法,但往往不易掌握而造成样品损伤。
通过细胞学观察我们发现果肉与种子皮之间有一层果胶物质,利用果胶酶可以使这层果胶物质分解,从而清除种皮外表面的残余果肉和杂质,获得干净清晰的种皮纹饰照片。
具体方法是:先将种子从果实中剥出,去掉大块的果肉。
用5%的果胶酶(pH515)在25℃酶解30min 至2h (视样品大小而定),用清水洗净凉干,将种子修成大小适宜的片段(视样品座尺寸而定)或不经修整。
经乙醇系列脱水、醋酸异戊酯置换、二氧化碳临界点干燥、离子镀膜仪镀金,在扫描电镜下观察拍照。
2 植物花粉扫描电镜观察法
211 外表形态观察制样法
一般情况下,我们采用干燥剂脱水法,即将新鲜的花粉收集在培养皿内。
置放于干燥器中过夜,经粘样镀金后直接用电镜观察。
但对于壁薄的花粉样品(如禾本科植物)就会产生收缩、变形。
为了解决这个问题我们采取固定—脱水—干燥法。
即采集新鲜的花粉粒,封在滤纸做成的小囊中,立刻用2%戊
二醛(011m ol ΠL 磷酸缓冲液配制pH712)固定2h ,用缓冲液漂洗,1%锇酸固定l h ,用缓冲液漂洗,经70%、85%、95%、100%、100%逐级丙酮脱水(每级15～20min ),过渡到醋酸异戊酯,经二氧化碳临界点干燥,镀金后电镜观察,可见花粉粒形态饱满、结构清晰。
212 花粉粒剥壳内部结构观察制样法为了给花粉分类鉴定提供更多的分析依据,我们自行设计了一种用于研究花粉粒表皮厚度和花粉内壁结构的剥壳方法。
其步骤为:采集新鲜花粉,用2%戊二醛固定l ～3h ,缓冲液漂洗2次每次15min ,1%锇酸固定1h 。
漂洗后经丙酮系列脱水,临界点干燥后备用。
取两个干净的扫描电镜样品铜座,在各样品座上表面涂一层树脂胶,待树脂半干硬时,往其中一个样品座上的树脂面撒一层经干燥的花粉粒;将另一个样品座树脂胶面向下,放在表面撒有花粉粒的样品座上。
形成铜座—树脂胶—花粉粒—树脂胶—铜座的夹心结构,置于60℃保温2～4h ,取出冷却后,将这两个粘连的铜座掰开分离,这样夹在中间的花粉粒也就被断裂成对应的两个部分,经镀金后,供扫描电镜观察、测量花粉壁厚度,甚至可看到断裂后的内含物形貌。
3 植物茎组织扫描电镜制样技术
植物茎断面组织形态的电镜观察,通常是用刀片直接截取茎段样品,经固定、脱水、干燥、镀金等步骤处理。
但一些软茎组织在切割时,容易受切削力的作用而发生组织挤压变形。
同时切割后的断面组织裸露在空气中因失水亦有不同程度的收缩,用这样的断面制成扫描电镜样品必然或多或少带有人为的假象。
为此我们通过反复试验建立了一种适合于植物茎组织扫描电镜观察制样方法。
主要步骤是:
切取大小约5mm ×5mm ,长3mm ～4mm 的茎组织块。
用3%戊二醛固定2h ,漂洗后,经35%、50%、60%、70%、95%、100%、100%各l h 的乙醇系列脱水,过
渡到纯二甲苯,在室温浸腊(溶点53℃
)24h ,移入40℃温箱逐步升温至56℃,加石腊至饱和,3h 后将样品移入溶化的石腊中(换三次,每次2h )包埋成块,迅速冷却后固定在切片机的样品座上,用切片机对需观察的面进行修整,把修整好的样品转入二甲苯中脱腊(换三次,每次1h ),从二甲苯过渡至无水乙醇,再过渡至醋酸异戊酯,经二氧化碳临界点干燥、镀金、电镜观察。
结果显示,茎组织形态学结构
完整层次丰富,立体感强而且真实。
4 红外干燥法
对于种子和某些材料质地致密的样品,可采用
红外线干燥技术进行制样,如薏米、玉米、水稻等作物种子的淀粉粒结构扫描电镜观察分析。
用此法可避免由于脱水不彻底而带来图像不稳定,分辨率低的问题。
具体做法是将种子置500W 红外线灯下距离20～30cm 处,照射6h (亦可放在红外线水份测定仪中处理),取出种子,掰断后置于铜座上,镀金后供扫描电镜观察分析。
图1 花生花粉纹饰。
图2 甘蔗叶脉表面结构。
图3 花生花粉内壁结构。
图4 甘蔗茎维管
束。
图5 薏米淀粉粒形态。
图1,图3,图5 Bar =10μm 。
图2 Bar =50μm 。
图4 Bar =100μm 。
Fig 11 P ollen ornamentation of peanut.Fig 12 Venation surface structure of sugarcane.Fig 13 Intine
structure of peanut pollen.Fig 14 Vascular bundle structure of sugarcane.Fig 15 S tarch grain shape of jobstears.
Fig 11,Fig 13,Fig 15 Bar =10μm.Fig 12 Bar =50μm.Fig 14 Bar =100μm.
412 电子显微学报 J.Chin.E lectr.Microsc.S oc.第21卷。