高效毛细管电泳及其在蛋白质_多肽分析中的应用

tion of ceriv astatin in mice,rats,and do gs in vivo[J].

Dr ug M etab D ispos,1998,26(7) 640 652.

[19]L indon JC,Nicholson JK,Sidelman U G,et al.Directly

coupled HPL C N M R and its application to drug metabolism[J].Dr ug M etab Rev,1997,29 705 746.

[20]Sidemann UG,Braumann U,Hofmann M,et al.Direct

ly coupled800MHz HPLC N MR spectroscopy of ur ine and its application to the identification of major phase

metabolites o f tolfenamic acid[J].A nal Chem,1997,69 607 612.

[21]William JE,Joseph M W,T odd M B,et al.L iquid chro

matography/nuclear magnetic resonance spectrosco py and liquid chr omatog raphy/mass spectrometry identification of novel metabolites of the mult idrug resistance modulator LY335979in rat bile and human L iver microsomal incu bat ions[J].Dr ug metab D isp os,1998,26(1) 42 51.

高效毛细管电泳及其在蛋白质、多肽分析中的应用

孔 毅, 吴如金, 吴梧桐

(中国药科大学,江苏南京210009)

摘 要:高效毛细管电泳(HPCE)是一种分离效率高、检测灵敏度高、样品用量少的分析技术。本文简述HPCE的研究进展及基本原理,着重介绍了它在蛋白质及多肽的分离、纯度鉴定、性质研究、结构分析、临床检测、药代动力学研究等方面的应用。

关键词:高效毛细管电泳;蛋白质;多肽

中图分类号:O658.9;Q51 文献标识码:A 文章编号:1001-5094(2000)04-0204-05

High Performance C apillary Electrophoresis and Its Application

in Analysis of Protein and Peptide

K ON G Yi, WU Ru jin, WU W u tong

(China Phar maceutical University,N anj ing210009,China)

Abstract:H ig h performance capillary electrophoresis(HPCE)is characterized as an analysis method, w hich show ed high selectiv ity and high sensitivity,but needed only little sample.In this article,the de velopment of HPCE and its foundamental principle were briefly introduced,and its applications to sepa ration,purity determ ination,characterization study,structural analysis,clinical monitoring and phar macokinetics of protein and peptide were emphasized.

Key words:H PCE;protein;peptide

蛋白质、多肽是生命科学中一类重要的生物大分子物质,是生物体实现其功能的物质基础。在医药领域,有许多疗效很好的蛋白质、多肽类药物,如促红细胞生成素、干扰素、白介素、重组人生长激素等都是近年开发的蛋白质类药物。在后基因组时代,蛋白质组学成为一门重要的新兴学科,其任务就是研究细胞内所有蛋白质的组成及其活动规律[1]。因此,许多研究机构和大财团都在投入人力物力对蛋白质及多肽进行研究,这些复杂的研究工作对分析手段提出了更高的要求。

高效毛细管电泳(HPCE)是近十几年发展起来的一项新的分析技术,它将电泳技术和色谱技术结合,是继高效液相色谱(H PLC)出现之后,分析科学领域的又一次革命。研究与实践表明HPCE具有以下特点:分离效率高(理论塔板数达106~107/ m);快速(20~30min内完成一次电泳操作);样品用量少(仅为纳升级,可对单细胞液进行分离分析);灵敏度高(用激光诱导荧光检测器,可达1 10 24

收稿日期:1999 10 14; 修回日期:1999 12 20

mol的超低检测限)[2]。Jorg enson和Lukacs研究发现,毛细管的柱效与分子的扩散系数呈反比,而蛋白质、多肽正具有扩散系数小的特点,这意味着毛细管电泳非常适合于蛋白质及多肽的分析研究。本文就HPCE的研究进展及其在蛋白质、多肽分析中的应用作一概述。

1 HPCE的研究进展

HPCE是在传统电泳的基础上发展起来的。1867年,H jerten采用内径3mm的石英管,内涂甲基纤维素,在旋转下分离,紫外检测,实现了自由区带电泳,这是毛细管分析实践的最初尝试。1981年,Jorgenson和Lukacs使用内径75 m的毛细管和灵敏的荧光检测器,在+30kV下电泳分离丹酰化氨基酸,标志着毛细管电泳分析方法的建立。进入90年代,以毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动毛细管色谱(MECC)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管电色谱(CEC)、非水毛细管电泳(NACE)、亲合毛细管电泳(ACE)等为代表的H PCE分离模式的发展拓宽了毛细管电泳的分离能力。运用紫外吸收、激光诱导荧光、电化学、质谱等检测手段使得H PCE 逐渐成为一种不可替代的分离分析方法,确立了其在分析科学领域的重要地位。

最早的商品化毛细管电泳仪诞生在1989年[3],之后在短短的10年中,仪器的性能不断改进,自动化程度不断提高。现在的H PCE仪大都能保证测量结果的重现性和高检测灵敏度,其主要生产厂家有Beckm an、Bio Rad、Waters、Spectra Physics等公司,它由高压电源、电极、检测器、毛细管柱系统、进样系统和数据处理系统组成。在HPCE中,离子或荷电粒子以电场(电压可达30kV)为驱动力,在毛细管(内径25~75 m,柱长14~75cm)中按淌度或/和分配系数不同而进行高效分离。目前最常用的分离模式为CZE和MECC。

CZE,当毛细管内缓冲溶液pH大于4时,柱内表面因带负电而吸引缓冲溶液中的正离子,形成带正电的双电层。给毛细管两端加电压时,缓冲溶液向负极流动,形成电渗流(EOF),溶液中带正电粒子的流动方向与EOF方向一致,首先流出。中性粒子随缓冲溶液流动,带负电粒子的运动方向与EOF方向相反,最后流出毛细管。离子迁移的速度还与离子电荷多少、离子半径大小等因素有关,稍有差异的离子,流出毛细管的顺序便出现变化,从而达到分离。但是CZE对中性粒子不具分离能力。

MECC,在缓冲溶液中加入表面活性剂,当表面活性剂的浓度超过临界胶团浓度时,形成胶束。当缓冲溶液中加入阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠时,在毛细管中形成带负电的胶束,其在电场中向正极移动。在中性或碱性条件下,EOF速度大于胶束流速,故实际上胶束的方向与EOF的方向是一致的,待测粒子依据疏水性的不同在水相和胶束相之间进行多次分配,其中疏水性强的中性粒子与胶束结合牢固,洗脱时间长,就会与水溶性中性粒子分离。在MECC中,中性粒子的分离机制是它与胶束间的疏水相互作用,而对于带电离子则有电泳迁移、静电作用、疏水相互作用等多种机制。

2 HPCE在蛋白质、多肽分析中的应用

2.1 蛋白质、多肽的分离

蛋白质、多肽尤其是结构相似的蛋白质、多肽的分离是对其进行分析研究的基础,H PCE在蛋白质、多肽分离中显示出独特的优势,目前这一领域的研究十分活跃。林炳承等[4]应用CZE在16分钟内完成了九个多肽类组分(舒缓激肽、血管紧张肽、促黑色素细胞激素、促甲状腺激素释放激素、促黄体生成激素释放激素、亮内啡肽、Bombesin、蛋白啡肽和催产素)的分离,分离条件为:涂层毛细管28cm 50 m、操作电压11kV、pH2.5的0.1mol/L磷酸缓冲液、检测波长200nm。Pessi等[5]采用CZE技术对MAP8(PGTH LPALP)2和MAP8(PGTH LP SLP)2这两种结构相似的肽进行分离,当只用磷酸缓冲液时不能分开,而加入40%乙腈后则达到完全分离。不同亚型的免疫球蛋白G(IgG)在免疫反应中扮演不同的角色,Kelly等[6]使用CZE分离了不同亚型的IgG,检测手段为毛细管柱后亲和检测法。MECC是H PCE中的一种强效分析方法,它不仅可以分离带电组分,对不带电组分也可实现分离, Yashim a等[7]运用该方法,利用含有SDS(十二烷基磺酸钠)或CTAB(溴棕三甲铵)的缓冲液分离了[Let13]胃动素和[M et13]胃动素,这种分离在CZE 中没能实现。由此看来,通过对分离模式的选择和分离条件的优化,H PCE可对结构相似的蛋白质、多肽进行分离。在一般的毛细管电泳介质中加入特殊添加剂,可获得令人满意的分离效果,Rathore等[8]在50mmol/L、pH 2.5的磷酸钠溶液中加入20mmol/L CMBCD(羧甲基 环糊精),实现了血管紧张素异构体的分离。