2菌种生产
发酵工艺 第2章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV
CAF
IFFI
ID IV CIVBP
名称 中国农业微生物菌种保藏管理中 心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中 心 轻工业部食品发酵工业科学研究 所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
最常用的工业微生物
放线菌
– 链霉菌属 – 小单孢菌属 – 地中海诺卡氏菌 – 米苏里游动放线菌
藻类
藻类包括数种不同类以光 合作用产生能量的生物。 它们一般被认为是简单的 植物，并且一些藻类与比 较高等的植物有关。虽然 其它藻类看似从蓝绿藻得 到光合作用的能力，但是 在演化上有独立的分支。 所有藻类缺乏真的根、茎、 叶和其它可在高等植物上 发现的组织构造。藻类与 细菌和原生动物不同之处， 是藻类产生能量的方式为 光合自营性 ；琼脂（棕 藻）
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
三、生产中常用菌种的分离、选 育（screening ）
（一）微生物菌种的分离 四步骤： 样品采集 增值培养 纯种分离 生产性能的测定
1.施加选择压力分离法
施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营 养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、 氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微 生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到 使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如 可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物 分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生 物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在 分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加 选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗 生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术-PPT
筛选一些具有特殊性质得微生物时,需根据该微生物独特 得生理特性到相应得地点采样(极端环境)。如:
高温酶产生菌:温度较高得南方,或温泉、火山爆发处 及北方得堆肥中采集样品;
低温酶产生菌:寒冷得地方,如南北极地区、冰窖、深 海中采样;
耐压菌:海洋底部采样。 耐高渗透压酵母菌:通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处
菌种纯化就是指在特定环境中只让1种来自同一祖先得微生物 群体生存得技术。
菌株分离、筛选虽为两个环节,但却不能绝然分开,因为分离中 得一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌得筛选 一般包括两大部分:一就是从自然界分离所需要得菌株,二就是 把分离到得野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
3、分离思路
从自然界筛选
B、采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
C、采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取 离地面5-15cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑 料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等, 以备查考。为了使土样中微生物得数量与类型尽少变 化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。
别出来。
抗生素筛选
6、生产性能得测定
由于纯种分离后,得到得菌株数量非常大,如果对每 一菌株都作全面或精确得性能测定,工作量十分巨大, 而且就是不必要得。一般采用两步法,即初筛与复筛, 经过多次重复筛选,直到获得1～3株较好得菌株,供 发酵条件得摸索与生产试验,进而作为育种得出发菌 株。这种直接从自然界分离得到得菌株称为野生型 菌株,以区别于用人工育种方法得到得变异菌株(亦 称突变株)。
采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖得耐 高渗透压得酵母菌。
(3)含微生物样品得富集培养(优化得过程) ----施加选择性压力分离法
二、三级菌种制作技术 Microsoft Word 文档
二、三级菌种制作技术二、三级菌种营养条件相同，制作方法一致，所不同的是二级菌种(原种)是由一级菌种(母种)扩大培养来的，而三级菌种(栽培种)是由二级菌种扩大培养来的。
因此，相同内容一起介绍。
二、三级菌种生产的工艺流程为：配料(配制培养基)→装瓶(栽培种可以用塑料袋) →灭菌→接种→培养一、二、三级菌种培养基的配制(一)二、三级菌种培养基配制原则1．选择适宜的营养物质。
2．营养物质间配制的比例要恰当。
3．选择经济实用、来源广泛的原料。
4．适宜的pH值和含水量。
(二)二、三级菌种培养基常用的配方1．木屑培养基：阔叶树木屑78%，麸皮(或米糠)20%，蔗糖1%，石膏粉1%。
这是常见的木屑培养基配方。
适于制作香菇、平菇、黑木耳、金针菇、滑菇、灵芝、猴头菇等多种木腐型菌种。
2．棉籽壳培养基：棉籽壳78%，麸皮(或米糠) 20%，蔗糖1%，石膏粉1%。
适用于制作金针菇、平菇、凤尾菇、草菇、银耳、黑木耳、猴头菇等菌种。
注：其它配方参见课本。
(三)二、三级菌种培养基配制的具体方法及步骤1．称料：先称主料，再称辅料2．拌料：(1)将不溶性主料和辅料拌匀。
(2)将可溶性辅料加水制成母液，用时稀释。
(3)二者混合均匀，堆放片刻，使其吸足水分。
(4)检查含水量(手测法、称重法)3．调节pH值：因灭菌和代谢酸会使pH值下降，故灭菌前应将pH值比指定要求调高1左右。
pH值测定方法：用pH试纸测定并用1%的石灰水上清液或1%过磷酸钙澄清液调节。
4．分装培养料：分装容器：750ml菌种瓶，500ml罐头瓶，菌种袋分装要求：上紧下松，外紧内松，中间一个洞(直径 1～1.5cm)5. 清洁(洗或擦)瓶、袋外壁。
6．封口：菌种瓶用二层报纸或一层牛皮纸外加一层薄膜封口；菌种袋用袋口环套封口。
二、二、三级菌种培养基的灭菌1．灭菌方法及要求高压蒸汽灭菌：压力1.5kg/cm3，温度126～128℃，时间1～1.5h(谷粒和经过堆制发酵的粪草培养基应达到2～2.5h)。
第二章生产菌种的来源
32
工业发酵菌种必须具备的基本特征
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并能生成较 多的发酵产物； 培养条件如温度、渗透压等易于控制； 抗杂菌和抗噬菌体能力较强； 遗传稳定性高、不易退化； 不产生有害的生理活性物质或毒素（食品或医药微生 物菌株）
33
4、性能测定（毒性试验）
自然界的一些微生物在一定条件下会产毒； 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作 为食用无须作毒性试验外，其他均需 2年以上的毒性试 验； 医药卫生上的产品，还须通过安全试验和临床试验，获 得国家的药品生产许可证，方能使用； 生产性能测定； 生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、温度、 pH值、提取工艺等； 经自然界分离筛选获得的有价值的菌种进一步进行人工 选育。
具体方法： 在固体选择培养基中加入酶作用的底物培养微生物，能够 利用此底物的酶产生菌得以生长，并且往往会在其菌落周 围形成一透明圈。 透明圈的大小与酶活力的高低成正相关，可以作为菌种初 筛的判断标准。 如：蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤 维素酶等
22
目的微生物筛选方法的研究进展 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。 微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干 年的研究重点。 －－陈文新院士 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定 目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作 用。如 :16SRNA同源性分析，基因序列分析及 DNA/DNA杂交技术等。
30
几种重要生物活性物质产生菌的分离方法 抗病毒药物产生菌：用小平板测定由病毒引起的细胞 变性效果，是一种有用的筛选方法；检测病毒复制中 特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶抑制剂，是另一 种选择性更高的筛选方法。
31
生长因子产生菌：通过观察分离菌能否促进营养 缺陷型菌株的生长来检出。 免疫激活剂产生菌：可以用细胞表面酶的抑制法， 筛选免疫激活剂产生菌； 多糖产生菌：可以通过菌落外观的观察来识别 （黏稠)
2发酵工业菌种制备原理和技术(1)
这些纯种培养物称为种子。
13
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段
14
9
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中 国 缩写 ACCC SH IA CCGMC AS-IV CAF IFFI ID 名称 中国农业微生物菌种保藏管理中心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中心 轻工业部食品发酵工业科学研究所 中国医学科学院皮肤病研究所 缩写 ISF CACC SIA AS CFCC CICC CMCC 名称 中国农业科学院土壤肥料研究 所 抗菌素菌种保藏管理中心 四川抗菌素工业研究所 中国科学院微生物研究所 林业微生物菌种保藏管理中心 工业微生物菌种保藏管理中心 医学微生物菌种保藏管理中心
4
最常用的工业微生物
细菌
枯草芽孢杆菌 醋酸杆菌 棒状杆菌 短杆菌 大肠杆菌
5
最常用的工业微生物
酵母菌
酿酒酵母 假丝酵母属
产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母
毕赤酵母属、汉逊酵母属
6
最常用的工业微生物
霉菌 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 根霉属 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉
7
最常用的工业微生物
放线菌
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
8
微生物工业对菌种的要求
能在廉价原料制备的培养基上迅速生长 和生成所需的代谢产物产量高。 培养条件易于控制 生长迅速，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体能力强 菌种不易变异退化 安全性（不是病源菌，不产毒素）
实验二 生产菌株发酵条件的优化 - 副本
实验二生产菌株发酵条件的优化实验时间：10.23 10.25 实验班级：生物1601B 实验组号： 6实验报告人：同组成员：刘文白李仕清1、实验目的（1）了解发酵条件对产物形成的影响，用单因子试验找出筛选所得菌株的最佳发酵条件。
（2）掌握发酵培养基的配制原则，熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法。
2、实验原理发酵条件对产物的形成有着非常重要的影响，其中培养基pH、培养温度和通气状况是三类最主要的发酵条件。
培养基pH 一般指灭菌前的pH，可通过酸碱调节来控制，由于发酵过程中pH会不断改变，所以最好用缓冲溶液来调节；通气状况可用培养基装量和摇床转速来衡量，另外，瓶口布的厚薄也会影响到氧气的传递，为了防止杂菌污染，瓶口布以8层纱布为好。
发酵培养基是指大生产时所用的培养基，由于发酵产物中一般含有较高比例的碳元素，因此培养基中的碳源含量也应该比种子培养基中高，如果产物的含氮量高，还应增加培养基中的氮源比例。
但必须注意培养基的渗透压，如果渗透压太高，又会反过来抑制微生物的生长，在这种情况下可考虑用流加的方法逐步加入碳氮源。
培养基组分对发酵起着关键性的影响作用。
工业发酵培养基与菌种筛选时所用的培养基不同，一般以经济节约为主要原则，因此常用廉价的农副产品为原料。
选择碳源时常用山芋粉、麸支、玉米粉等代替淀粉。
而用豆饼粉、黄豆粉等作为氮源。
此外，还应考虑所选原料不至于影响下游的分离提取工作。
由于这些天然原料的组分复杂，不同批次的原料成分各不相同，在进行发酵前必须进行培养基的优化试验。
发酵培养基中的原料多是大分子物质，微生物一般不能直接吸收，必须通过胞外酶的作用后才能被利用，所以是一些“迟效性”营养物质。
而微生物分泌的胞外酶有不少是诱导酶，为了使发酵起始阶段微生物能快速繁殖，可适当在培养基中添加一些速效营养物。
3、实验材料（1）菌种筛选得到的高产α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌（2）培养基①种子培养基肉汤培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水100mL，pH7.2～7.4，121℃灭菌20Min。
生产菌种安全管理制度
生产菌种安全管理制度第一章总则第一条为规范和加强菌种的生产管理工作，保障菌种生产安全，维护公共卫生安全，根据相关法律法规和标准，制定本制度。
第二条本制度适用于所有从事菌种生产的单位和个人。
第二章组织机构第三条菌种生产单位应当建立健全菌种生产管理机构，具有菌种生产、监督检验和相关管理经验的人员组成的专业队伍。
第四条菌种生产单位应当设立菌种生产安全管理部门，主要负责制定和实施菌种生产安全管理制度，组织开展菌种生产管理工作。
第五条菌种生产单位应当建立由专业技术人员组成的菌种生产安全管理小组，定期进行安全生产检查和排查，及时发现和处理生产过程中可能存在的安全隐患。
第六条菌种生产单位应当配备必要的生产设备和设施，确保生产过程中的安全生产。
第三章菌种生产过程控制第七条菌种生产单位应当按照国家相关标准和规定，严格执行生产工艺和控制流程，确保菌种生产质量和安全。
第八条菌种生产单位应当建立健全菌种生产记录管理制度，对每一批次的生产过程进行详细记录，确保产品生产过程可追溯。
第九条菌种生产单位应当建立质量检验制度，对每一批次的产品进行检验，确保产品符合国家相关标准和规定。
第十条菌种生产单位应当建立健全的菌种储存管理制度，确保菌种存放在符合要求的环境中，避免污染和交叉感染的发生。
第十一条菌种生产单位应当建立菌种生产安全风险评估制度，定期评估生产过程中可能存在的安全风险，采取措施降低风险。
第十二条菌种生产单位应当建立应急预案，对各类突发事件进行预案制定和演练，保障员工生命安全和企业财产安全。
第四章菌种生产人员管理第十三条菌种生产单位应当严格要求生产人员遵守有关生产操作规程，正确使用生产设备和设施，杜绝违规操作。
第十四条菌种生产单位应当建立健全员工培训制度，定期对生产人员进行培训，提高其安全生产意识和技能。
第十五条菌种生产单位应当建立健全的员工健康监测制度，定期对生产人员进行健康检查，确保员工身体健康。
第十六条菌种生产单位应当建立严格的人员进出制度，保障生产场所的安全。
第二章 生产菌种的来源
4、其他防线菌生产的抗生素
其他生产的抗生素的防线菌有： 诺卡氏 其他生产的抗生素的防线菌有 ： 菌 形 放 线 菌 （ Nocardioform Actinomycetes ） 、 游 动 放 线 菌 （ Actinoplanetes ） 及 足 分 枝 菌 （Maduromyetes）。
5、青霉属（Penicillum） 青霉属（
6、粘细菌（Myxobacteria） 粘细菌（
粘细菌次级代谢产物中抗菌活性物质的检 出率非常高，并且许多都是新发现的抗生素。 出率非常高 ， 并且许多都是新发现的抗生素 。 如纤维素堆囊菌（ 如纤维素堆囊菌 （ Sorangium cellulosum ） 产 生的大环内酯类抗生素堆囊菌素、 生的大环内酯类抗生素堆囊菌素、
四、有机酸
柠檬酸 :黑曲霉 ,酵母 (解脂假丝酵母 、解脂 复膜孢酵母季也蒙假丝酵母 ） 乳酸 ：德氏乳杆菌 、赖氏乳杆菌 、植物乳杆 菌 、米根霉 苹果酸 ：黄曲霉 、米曲霉 、寄生曲霉 、华根 无根根霉、 霉 、无根根霉、膜醭毕赤酵母 衣康酸 ：土曲霉 、衣康酸曲霉、假丝酵母S-10 衣康酸曲霉、假丝酵母S
青霉菌属于腐生菌， 青霉菌属于腐生菌，广泛生存于土壤和 腐败的水果和蔬菜中。 腐败的水果和蔬菜中。 由于第一个工业化生产的抗生素青霉素是 中发现的， 由青霉属中的Penicillum notatum中发现的， 至今青霉素极其半合成抗生素仍是产量最大、 至今青霉素极其半合成抗生素仍是产量最大、 用途最广的抗生素， 用途最广的抗生素，因此青霉素在抗生素工 业中具有特别重要的地位。 业中具有特别重要的地位。
纤维素酶
纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的 总称。它不是单种酶， 总称。它不是单种酶，而是起协同作用的多组分 酶系。 酶系。 纤维素酶是由绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉、 纤维素酶是由绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉、 青霉和根霉等菌株经深层发酵制成的酶制剂产品。 青霉和根霉等菌株经深层发酵制成的酶制剂产品。 此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、 此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、产 黄纤维单孢菌、侧孢菌、黏细菌、 黄纤维单孢菌、侧孢菌、黏细菌、梭状芽孢杆菌 等也能产生纤维素酶。 等也能产生纤维素酶。
生产菌种的培养与保存
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面
(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；
(3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几 度的细胞冻结点(通常为-30℃)；
(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生 相变；
(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；
(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或 气相(-156℃)中 保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于-70℃冰 箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。
种子扩大培养是指将保存在砂土管、 冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入 试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种 子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质 量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子 。
种子扩培的目的
接种量的需要
菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染
(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积 20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧， 则需先用玻璃珠打散；0.5-1ml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专 用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置 于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。
双孢蘑菇品种W192工厂化二次发酵栽培技术
双孢蘑菇品种W192工厂化二次发酵栽培技术1.环境选择1.1地址选择建棚地点应坐北朝南，有相应的堆料场和符合标准的水电供应，上风向无工业污染源。
厂址应距离居民区、垃圾场500m以外；离畜牧场、医院等污染单位1000m以外，符合NY/T5333-2006《无公害食品食用菌生产技术规程》要求。
1.2用水标准必须符合GB5794－1985《生活饮用水卫生标准》。
若抽取地下水做生产用水的应符合GB5084－1992《农田灌溉水质标准》。
1.3覆土要求采用草炭土原土，pH值≤6，含氮量≤1%，灰分小于5%，持水力80%～90%，添加轻质碳酸钙进行搅拌调整pH 值为7～7.5。
通过搅拌保持覆土理化性能一致，形成粗糙块状的质地，具有良好的团粒结构性，可采用甲醛进行覆土消毒，灭杀覆土中的病原菌及孢子、害虫及卵。
1.4菇房菇房采用钢制结构，以泡沫夹心彩钢板或挤塑夹心彩钢板作为墙面建造。
菇房大小根据投资、地形环境、风向进行设计建造。
采用食用菌专用环境调节设备进行温度及湿度调节，在菇床通道设置通风管，利用通风管进行通风降温。
设置排风口，并在排风口安置防虫网。
菇房前后设置房门，靠近外部通道房门为进出料通道，靠近内部通道房内则为人员采菇及操作房门。
菇房配置自来水管道以及蒸汽熏蒸所需管道，墙壁及房顶配置照明日光灯或LED灯进行采光。
1.5菌床菌床宽度1.3～1.4m，通道宽度60～80cm。
菇床层数以5～6层为宜，底层离地面20cm，层间高60～65cm，顶层距房顶1.2~1.5m。
控制系统菇房环境控系统必须采用变频风机，同时包含加热系统、降温系统、除湿系统、增湿系统、自动控制新风联动系统，以及相对应的传感采集器。
传感采集器要求各项指标精度准确，误差范围不超过±5%。
2.材料准备2.1原材料选择工厂化栽培原料以小麦秆，稻草秸秆，鸡粪，豆粕、花生粕，尿素、硫酸铵等铵肥、石膏，轻质碳酸钙等为主，其中麦秆要求明亮的金黄色，无霉变腐败、纯正干净，含水量在15%以下，含氮量在0.5%～0.7%之间，秸秆长20～35cm，无麦壳或少麦壳。
发酵工程第2章2 菌种的选育与保藏
2.3传代保藏
将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的 生长温度下生长和保存的传代保藏方法。
可用于实验室中若干菌种的保藏。 此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。 但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。
2.3 传代培养法
实验原理：保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于 厌氧细菌）培养好后，置4C˚冰箱中存放，定期 进行传代培养、再存放。 可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体 石蜡来进一步延长保存期。
冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常 用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等。
大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久 而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻 保藏，便于运输。
培养物的冻干过程
冷冻真空干燥操作流程
配制保护剂 灭菌
菌种 培养 制备菌悬液
分装安培瓶 预冻
真空干燥 测定水分
操作方法 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，
用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置 4C˚冰箱中包藏。
保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保 存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月， 假单胞菌两周传代一次。
此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易 被污染。
加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的 稳定性。
在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检 测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。
成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括：在 保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单 位)、细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征 应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中 试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极 为重要。
蘑菇菌种的配制方法
蘑菇菌种的配制方法1、母种制作技术，一般处于保存期的大球盖菇菌种的菌丝处在缓慢生长或停止生产状态，所以在制作生产用的母种前，必须对保存的菌种进行复壮，以便将处于旺盛生长状态的菌种接入母种或原种培养基上，促进菌丝快速生长，获得菌丝粗壮、浓白、生长势旺的菌种。
（1）培养基配方：I号：PDA(马铃薯200g、葡萄糖18g、琼脂18g、水1000m1)。
Ⅱ号：PDA+硫酸镁1．5g+磷酸二氢钾3g+蛋白胨2g、水1000ml。
Ⅲ号：马铃薯100g、干杂木屑100g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml。
上述配方的培养基经高压20分钟灭菌消毒后制成试管斜面，3天内用完。
（2）制作方法：通过组织分离技术，将选取的大球盖菇组织块接入I号培养基上(或接入需复壮的保存种)。
在24到28℃条件下经10至15天培养，菌丝长至试管1：3--1：4时，挑取菌丝扩展前端浓密、粗壮的部分转入Ⅱ号或Ⅲ号培养基上，采用两点接种法，以使菌丝迅速长满培养基表面(一般15到20天)提高菌丝的质量。
经Ⅱ号、Ⅲ号复壮培养基培养的菌丝表现为浓白、粗壮、生命力强，以利原种菌丝的生长，缩短原种培养时间，提高成品率。
2、原种及生产种制作（1）配方：I号：小麦或大麦88％、米糠或麦麸10％、石膏或碳酸钙1％、石灰0．5％、含水量65％(加入米糠或麸皮主要是使培养基疏松，增加透气性，菌丝走向好)。
Ⅱ号：小麦25％、稻草64％、麦麸10％、石膏粉1％、含水量65％--70％。
Ⅲ号：杂木屑42％、杂刨木花42％、米糠或麦麸15％、硫酸镁0．2％、石膏或碳酸钙1％、含水量70％。
以上配方在1．3--1．5kg／平方米压力下，消毒2--2．5小时，3天内用完。
（2）原料选择和配制：实践证明：制作大球盖菇原种和生产种的培养基主原料以麦粒最好，木屑、刨木花次之，稻草最差。
（3）麦粒的选择：应选深黄或暗红色皮韧性大、浸泡时不易破皮的麦粒为好，从吸水率来看大麦优于小麦。
发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
发酵工程 工业生产水平的
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件
三个决定要素
生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工 业生产的第一环节。
本章内容
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
第二节 自然界中微生物菌种的选择性分离
第三节 微生物菌种的选育
第四节 微生物菌种的退化、复壮和保藏 第五节 工业微生物菌种的扩大培养 第六节 种子培养基及其制备
集的培养物到固体培养基，分离优势微生物的单
菌落。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
连续富集培养（恒化式富集培养）
改变限制性基质浓度来控制两种菌的比生长速率。 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。
固体培养基的使用
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所
需的基质，以便促使酶产生菌的生长，并在菌落
使目的微生物在种群中占优势，使筛选 1. 目的：
变得可能。
2. 两种方案：
（1）施加选择性压力分离法：采用特定的有利于 目的微生物富集的条件进行培养，使目的微生物 占优势，以实现快速分离纯化的目的。 （2）随机分离法：不能提供任何有助于筛选产生 菌的信息时，只能通过随机分离法进行分离。
（1）施加选择性压力分离法
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
发酵工程 2 发酵工业菌种
思考题
发酵工业菌种
1、常见的工业微生物包括哪些类群？
2、作为工业生产菌株应具备哪些基本特性？ 3、了解发酵工业中的细菌、酵母菌、霉菌、放 线菌及其生产的产品。 4、掌握菌种分离筛选的基本过程。
5、诱变育种及其原理。
6、常用的化学诱变剂。
7、菌种退化、原因与防治。
8、菌种保藏的方法。
广义的微生物：
5．其它 担子菌：香菇、灵芝等。 藻类：螺旋藻、单胞藻等。 基因工程菌：基因工程菌在发酵工程已得到广泛 应用，如酶制剂、胰岛素、干扰素、生长激素、 乙型肝炎病苗等的生产。
二、工业生产对菌种的要求 （1）能在廉价原料制成的培养基上生长，且 生成的目的产物产量高、易于回收； （2）生长较快，发酵周期短；
挑出高产斜面
1、自然选育 不经人工处理，利用微生物的自然突变进行 菌种选育的过程称为自然选育（spontaneous
mutation）。
自然选育最为成功的例子是目前被广泛使
用的卡介苗(BCG vaccine)。法国的卡尔密脱
(Calmette)和介林(Guerin)把牛型的结核分枝 杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上， 连续传代培养230代，前后经历13年时间，终 于在1923年获得显著减毒的结核杆菌----卡介
能力和转化蔗糖的性能，还能产生脂肪酶。能发
酵产生乳酸、反丁烯二酸。
华根霉：华根霉多出现在我国酒药和酒曲中， 具较强的耐高温性能（45℃能生长），淀粉酶液 化力强，有溶胶性，能产生酒精、芳香脂类、乳 酸及反丁烯二酸，能转化甾族化合物。
4）红曲霉属(Monascus) 菌丝呈红色以至紫色，
可由我国南方红曲中分离得到。
一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
返回本节
（二）原种、栽培种培养基 1.种类
(1)棉籽壳培养基 配方（%）
主料 辅料 棉籽壳87，麦麸10 白糖1，石灰1，过磷酸钙1
配制
棉壳、麦麸干混 余料溶于水后浇入主料 清水翻拌至含水量
返回本节
(2)颗粒培养基
主料 麦粒、玉米粒等98.5% 配方（%） 辅料 石膏粉1%,碳酸钙0.5%
情景2-1
菌种培养基
菌种概述 菌种培养基
菌种概述
一、菌种概念 二、菌种类型 三、菌种生产程序
返回本章
一、菌种概念
野生 担孢子或子囊孢子 菌种 栽培 扩大繁殖后的纯次生菌丝体 来历 野生菌驯化 原菌株改良 生物技术创新 基本 要求 优良 菌株 扩大 繁殖 用于 生产
实行纯培养 不含任何杂菌
返回本节
返回本节
返回本章
情景2-3
菌种培养与质量鉴定
一、菌种培养 （一）培养条件 （二）技术环节 二、菌种质量鉴定 （一）母种质量鉴定 （二）原种和栽培种质量鉴定
返回本章
一、菌种培养
(一)培养条件
场所清洁
空气清新 空气湿度 60%~70%
光线暗
温度约25℃
返回本节
（二）技术环节
1.母种 培养 及时挑拣污染管 分离的母种要纯化→出菇试验 →使用 控制菌龄（即将长满斜面）
返回本节
返回本章
学习情景2-2
菌种的接种
一、无菌操作 二、母种的接种
(一）分离法 1.组织分离 2.孢子分离 （二）转管法
三、原种、栽培种的接种
返回本章
概念：菌种移至新培养基上的过程 接种 关键：无菌操作
一、无菌操作
概念 在严格消毒灭菌条件下进行的操作 接种环境消毒灭菌 酒精棉球消毒双手 要点 开启的管口、瓶口靠近灯焰 拔出的棉塞勿触及任何地方 必 动作快，接种时间勿太长 备
返回本节
2.孢子分离( 2.孢子分离(有性繁殖）
孢子 特点 单孢分离 孢 子 分离法 多孢分离
菌龄小 生命力强 变异率高 难度较大 较简易
单孢分离 的菌落
返回本节
多孢分离 使许多孢子在同一培养基上， 概念 萌发后自由交配成次生菌丝的方法 种菇消毒 步骤 整菇插种法 采收孢子 钩悬法 孢子印法 接种孢子
返回本节
1.种菇 消毒
菌柄去2/3 有：75%酒精棉球擦 苞被 无 0.25%新洁尔灭浸2~3min 无菌纱布吸干表面水分
返回本节
2.采收孢子 整菇 插种法 种菇插在孢子收集器中 使孢子散落于培养皿内的方法 用 前 灭 菌
25℃、24h现孢子粉 取出分离材料 培养皿盖严
返回本节
钩悬法
25℃、24h现孢子粉 取出分离材料
培养时间5~10天
返回本节
母种培养
返回本节
2.原种 栽培种 的培养
培养时间：约30天
勿堆放过挤 及时挑拣污染瓶（袋） 栽培种的菌袋缺氧时可刺孔增氧 控制菌龄（菌丝长满后7~10天使用）
返回本节
返回本节
刺孔点
返回本节
返回本节
二、菌种质量的鉴定
鉴定 项目 形态特征、生理特性、 栽培性状、经济效益等
返回本节
低温
缺营养
不利 条件
干燥
无氧
返回本节
（二）常用保藏法 以母种形式保藏 1.斜面低温法 斜面菌种置4~6℃冰箱中（3~6个月） 简便 保藏时间短 易污染及退化 不适于草菇等菌类
特点
返回本节
返回本节
2.矿油保藏法
矿油 处理 灭菌：152kpa、30min 去水：40~50℃烘至无色透明
无菌检验 ？ 淹没斜面约1cm 注入种管 用时转管再转管 口堵胶塞
返回本节
孢子印法
返回本节
接种孢子
用接种环 蘸孢子液或孢子粉 涂布于平板上
返回本节
返回本节
（二）转管法
将母种移入新的过程 概念 接种环取绿豆粒大母种 移入新斜面中部 过程 种块勿太大 原老种块勿再接入
传代次数勿太多
注意
返回本节
转管
返回本节
三、原种、栽培种的接种
接 原 种
用接种耙取蚕豆大母种 放于瓶中料面上
黄 水
返回本节
思考、讨论题
1.菌种培养的条件有哪些 2. 母种、原种、栽培种怎样培养 3.怎样鉴定菌种质量
课外学习资源
1.黄毅.食用菌栽培. 北京：高等教育出社，1998 2.中国食用菌菌种网
返回本节
参考资料
1.中国食用菌杂志. 云南：《中国食用菌》编辑部 2004.1~6， 2005.1~6 2.杨新美.食用菌栽培学.第6章.北京：中国农业出版社，1996 3.张金霞.食用菌生产技术.第4~8章.北京：中国标准出版社， 1999 4.黄毅.食用菌栽培.第二版.上册.第4章.北京：高等教育出版社， 1998 5.张松.食用菌学.第6章.广州：华南理工大学出版社，2000 6.中国食用菌菌种网 7.中国食用菌信息网 /
特点 菌丝多而壮、适应性强
返回本节
返回本节
生产总过程
子实体 母种
栽培 原种
栽培种
返回本节
返回本节
（二）状态不同的菌种 概念 用固体基质培养的菌种 1.固体 菌种 设备、工艺简单 特点 菌龄长而不一 发酵率较低
概念 用液体基质培养的菌种 2.液体 设备、工艺较复杂 菌种 菌龄短而一致 特点 发酵率高 易老化和自溶
二、菌种类型
保藏用种 目的 实验用种 生产用种 一级菌种 级别 二级菌种 三级菌种 状态：固体菌种、液体菌种
返回本节
按
（一）级别不同的菌种
1.一级种（母种） 用分离法首次得到的 概念 纯次生菌丝体 培养环境 试管、斜面培养基 概况 扩大原种 用途 再生母种 保藏用种 特点 菌丝弱而少、不可直接栽培
返回本节
粉状
返回本节
二、各级菌种的培养基
（一）母种培养基 1.通用配方 马铃薯200g、葡萄糖20g PDA 琼脂15~20g、水1000m1
2.配制过程
返回本节
制马铃 薯滤液 融化琼脂 调解pH 分装试管 扎捆
煮沸20min，取定量滤液
滤液沸时加入，融后加余料 10%NaOH或HCL 勿污管口，控制装量 准备灭菌
返回本节
返回本节
3.自然基质保藏法
麦粒浸透、煮熟 基质的处理 麸皮拌湿 灭菌 接种 培养 装管
干燥器去水
防衰老 特点 保藏时间长 转接后生长旺 易污染，灭菌要彻底
返回本节
（三）保藏注意
用保种培养基 及时保藏（菌丝占斜面2/3） 最好换胶塞 用时活化 严防棉塞受潮
返回本节
二、菌种的复壮
概念 确保或恢复菌种优良性能的措施 （一）菌种的衰退 表现 形态改变、生长慢、 抗逆性差、产量及质量下降 内因 菌种的遗传物质发生了负变 根源 外因 传代过多，条件不适宜
要 求
营养种类、比例、水分、pH适宜； 保持无菌状态。
返回本节
（二）培养基的类型
原料 来源
天然：天然有机物 合成：已知成分的化学药品 半合成：？
类 型
液体：营养液 状态 固体：天然固体原料 固体 固化：加1.5%~2%琼脂 表面 斜面培养基 形状 平板培养基
返回本节
特性
条状
属天然植物多糖 融点96℃以上 凝点40 ℃以下 冷水中不溶 透明度好、粘着力强 不被微生物分解利用
返回本节
返回本节
2.二级种（原种）
将母种扩大至粗放培养基上 概念 形成的菌种 大口瓶、较粗放的 培养环境 概况 液体或固体培养基 用途 扩大栽培种 特点 菌丝较多而壮、适应性较强
返回本节
返回本节
3.三级种（栽培种）
将原种扩大至粗放培养基上 概念 形成的菌种 菌种袋、较粗放的 概况 培养环境 液体或固体培养基 用途 栽培生产
返回本节
返回本章
学习情景2-4
菌种保藏与复壮
一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 （二）常用保藏法 （三）保藏注意
二、菌种复壮
(一）菌种的衰退 （二）复壮方法 （三）防衰措施
返回本章
一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 目的 不死亡 不生长 不污染 使菌种 不降低或不丧失其优良性 以尽量延长使用时间 原理 创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。
返回本节
20~30min
母基灭菌与摆斜面
返回本节
（二）原种、栽培种培养基的灭菌
高压灭菌 1.5kg/cm2（152kpa、128.1℃） 灭菌1~2h
返回本节
常压灭菌 100℃灭菌10h左右→再闷12h 要求 攻头、控中、保尾
返回本节
主要内容
1.菌种类型（母种、原种、栽培种的作用） 2.高压锅、接种箱、接种室的构造及使用 3.培养基（PDA、颗粒培养基的配制方法）
课外学习资源
1.黄毅.食用菌栽培. 北京：高等教育出社，1998 2.中国食用菌菌种网
返回本节
参考资料
1.中国食用菌杂志. 云南：《中国食用菌》编辑部 2004.1~6， 2005.1~6 2.杨新美.食用菌栽培学.第6章.北京：中国农业出版社，1996 3.张金霞.食用菌生产技术.第4~8章.北京：中国标准出版社， 1999 4.黄毅.食用菌栽培.第二版.上册.第4章.北京：高等教育出版社， 1998 5.张松.食用菌学.第6章.广州：华南理工大学出版社，2000 6.中国食用菌菌种网 7.中国食用菌信息网 /
配制
颗粒洗净，1%石灰水泡胀 文火煮沸15~20min 晾至无明水后拌入余料
pH：一般为8.0左右 调pH 原种培养基装大口瓶 与分装 栽培种培养基装菌种袋
返回本节
返回本节
栽培种的装袋
返回本节
三、培养基的灭菌