固定化酶的制备
固定化酶的化学制备方法
固定化酶的化学制备方法固定化酶是指将酶在一定条件下固定在某种多肽或多糖材料中，使其具有较高的稳定性和重复使用性。
固定化酶制备方法有很多种，下面就简单介绍一下常用的几种方法。
第一种是物理固定化法。
这种方法是通过将酶分子与载体材料表面的静电作用、氢键作用等力量结合在一起，从而实现酶的固定化。
常用的物理固定化方法包括吸附、沉淀、共价键等把酶与载体结合在一起。
吸附法是一种较简便、经济的酶固定化方法，但稳定性较差，适用于临时使用。
沉淀法是一种先定制载体材料，再将酶溶液与载体材料混合沉淀制成的固定化方法，能增强酶的稳定性。
共价键法则通过选择适当的交联剂将酶与载体基质之间形成强化学键，形成高度稳定的固定化酶。
第二种是化学固定化法。
这种方法是以某种化学反应方式将酶与载体结合，常见的方法有选择性基团反应和交联剂交联反应两种方法。
选择性基团反应是先在载体表面引入一些特定的官能团，再通过这些官能团再将酶基质固定在载体上，这种方式可以提高酶的活性和稳定性。
交联剂交联反应则是将酶与载体结合的过程中，通过交联剂，形成交联的结构，这种方法稳定性较高、经济实用，但固定化酶的活性较低，不适用于活性较高的酶。
第三种是生物固定化法。
生物固定化法是通过生物体系的作用将酶基质固定在载体材料上，这种方式主要适用于多肽、多糖等含有复杂生物结构的材料。
这种方法优点是酶的活性和特异性较高，但固定化酶的稳定性一般较差。
以上三种方法都可以用来制备固定化酶，不同的固定化方法适用于不同的酶类型、活性、载体材料等。
在实际制备过程中，需要根据实际情况选取相应的方法，以获得稳定和活性高的固定化酶。
制备固定化酶实验报告
一、实验目的1. 了解固定化酶的概念、原理及其在生物催化领域的应用。
2. 掌握固定化酶的制备方法，提高实验操作技能。
3. 通过实验，了解固定化酶的催化活性、稳定性及重用性能。
二、实验原理固定化酶是指通过物理或化学方法将酶固定在固体载体上，使其在催化反应中保持酶活性的一种技术。
固定化酶具有以下优点：1. 提高酶的稳定性，延长使用寿命；2. 方便酶的回收和重复利用；3. 易于控制反应条件，提高催化效率。
固定化酶的制备方法主要有吸附法、包埋法和结合法。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、酶、底物、缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、烘箱、恒温水浴锅、显微镜、酶标仪等。
四、实验步骤1. 吸附法固定化酶（1）将纤维素或琼脂糖溶解于缓冲液中，配制成一定浓度的溶液。
（2）将酶溶液与纤维素或琼脂糖溶液混合，搅拌均匀。
（3）将混合液倒入培养皿中，置于烘箱中干燥，形成凝胶。
（4）将凝胶用离心机离心，去除未固定的酶。
（5）将固定化酶洗涤、干燥，备用。
2. 包埋法固定化酶（1）将聚丙烯酰胺溶解于缓冲液中，配制成一定浓度的溶液。
（2）将酶溶液与聚丙烯酰胺溶液混合，搅拌均匀。
（3）将混合液倒入培养皿中，置于烘箱中干燥，形成凝胶。
（4）将凝胶用离心机离心，去除未固定的酶。
（5）将固定化酶洗涤、干燥，备用。
3. 结合法固定化酶（1）将酶蛋白分子与不溶性固相支持物（如离子交换树脂）进行离子键结合。
（2）将结合后的酶蛋白分子与底物反应，观察催化效果。
五、实验结果与分析1. 吸附法固定化酶：通过吸附法固定化酶，酶的活性保持较好，但固定化酶的稳定性较差，易受外界环境因素影响。
2. 包埋法固定化酶：通过包埋法固定化酶，酶的活性保持较好，稳定性较高，但固定化酶的催化效率较低。
3. 结合法固定化酶：通过结合法固定化酶，酶的活性保持较好，稳定性较高，且催化效率较高。
六、实验结论1. 固定化酶的制备方法有吸附法、包埋法和结合法，各方法有其优缺点。
固定化酶技术及应用的研究进展
固定化酶技术及应用的研究进展一、固定化酶的制备方法研究进展固定化酶的制备方法包括物理吸附、共价键结和交联结构等。
近年来，研究者们发展了一系列新型的固定化酶制备方法，如钙凝胶法、包埋法、凝胶微球法和溶胶凝胶法等。
这些新方法不仅提高了固定化酶的稳定性和活性，还大幅度降低了制备成本，提高了酶的重复使用性。
固定化酶在生物工程领域的应用主要集中在酶催化反应、生物催化剂制备以及生物催化剂的应用等方面。
例如，固定化酶可以用于生物反应器中进行酶催化反应，实现对废水处理、医药合成和食品工业等的高效处理。
此外，固定化酶还可以用于制备各类生物催化剂，如药物微胶囊和生物传感器，用于治疗疾病和检测生物分子。
固定化酶在食品工业中的应用主要包括生产酶制剂、降解保健食品、生产高价值添加物以及改善食品品质等方面。
固定化酶可以用于生产各类酶制剂，如发酵酶、复合酶和水解酶等，以加速酶催化反应。
此外，固定化酶还可以用于生产特殊功能食品，如降解保健食品、胶原蛋白等，以满足不同人群的需求。
固定化酶在医药学领域的应用主要包括药物制剂、生物芯片、药物代谢和生物传感器等方面。
例如，固定化酶可以用于制备缓控释药物制剂，以提高药物的疗效和降低副作用。
此外，固定化酶还可以用于制备生物芯片，用于分析疾病标志物和药物代谢产物等。
固定化酶在环境保护领域的应用主要包括废水处理、大气污染控制和土壤修复等方面。
固定化酶可以用于废水处理中，加速有害物质的降解和去除。
此外，固定化酶还可以用于大气污染控制，将有害气体转化为无害物质。
固定化酶还可以用于土壤修复，加速土壤中有毒物质的降解和去除。
综上所述，固定化酶技术在多个研究领域取得了重要的进展。
通过不断创新和改进固定化酶制备方法，研究者们加强了固定化酶的稳定性和重复使用性，提高了酶的应用效果和利用价值。
固定化酶技术的进一步发展，将为生物工程、食品工业、医药学和环境保护等领域带来更多创新和突破。
固定化酶法生产l-氨基酸制作流程
固定化酶法生产l-氨基酸制作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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固定化酶的方法
固定化酶的方法
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶，具有高效、稳定、重复使用等优点。
下面是一种常用的固定化酶方法。
材料：
- 酶
- 载体（如聚丙烯脂、硅胶、玻璃等）
- 活性剂（如戊二醛、双醛、聚乙二醇等）
- 缓冲液（如PBS缓冲液）
- 洗涤液（如去离子水或PBS缓冲液）
步骤：
1. 制备载体：将载体清洗干净并消毒，然后在室温下干燥或烘干。
2. 固定化酶：将制备好的载体浸泡在含有活性剂的缓冲液中，搅拌均匀。
然后加入适量的酶，搅拌均匀并放置一段时间（根据不同的活性剂和载体类型，时间不同）。
最后用洗涤液洗净固定化酶。
3. 检测固定化酶活性：采用适当的方法检测固定化酶的活性，如比色法、荧光法等。
4. 贮存固定化酶：将固定化酶保存在干燥、阴凉、密闭的容器中，避免受潮和受热。
注意事项：
1. 活性剂的选择应根据酶的特性和载体的特点进行选择。
2. 固定化酶活性与载体、活性剂、酶的比例等因素有关，需要进行优化实验。
3. 贮存时要避免温度过高或过低，否则会影响固定化酶的稳定性和活性。
以上是一种常用的固定化酶方法，具体操作时应根据实验要求和条件进行调整。
固定化胰蛋白酶的制备研究
固定化胰蛋白酶的制备研究
一、背景介绍
固定化酶技术是指将酶固定在载体上，形成固定化酶，以提高其稳定
性和重复使用性。
胰蛋白酶是一种重要的消化酶，常用于医药和食品
工业中。
因此，制备固定化胰蛋白酶具有重要的应用前景。
二、制备方法
1. 固定化胰蛋白酶的载体选择：常用的载体有凝胶、纤维素、硅胶等。
其中凝胶是最常用的载体。
2. 固定化方法：包括物理吸附、共价键结合和交联等方法。
其中，共
价键结合法是最常用的方法。
3. 制备步骤：
（1）将选好的载体与活性胰蛋白酶混合；
（2）加入交联剂进行交联反应；
（3）去除未固定的胰蛋白酶和交联剂；
（4）测定固定化后的活性。
三、影响因素
1. pH值：pH值对于固定化后的活性有较大影响，一般选择pH 7.0-8.0为最佳条件。
2. 温度：温度也是影响固定化后活性的重要因素。
一般情况下，选择
40℃为最佳条件。
3. 固定化时间：固定化时间对于固定化后的活性也有影响。
一般情况下，选择1-2小时为最佳条件。
四、应用前景
固定化胰蛋白酶具有较好的应用前景。
在医药领域，可以应用于制备消化酶剂和治疗胰腺疾病；在食品工业中，可以应用于酿造、发酵等过程中的蛋白水解反应。
五、总结
固定化胰蛋白酶的制备是一项重要的技术，在医药和食品工业中具有广泛的应用前景。
其制备方法包括载体选择、固定化方法和测定固定化后活性等步骤。
同时，pH值、温度和固定化时间等因素也对其活性产生影响。
第五章酶的固定化ppt课件
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概念
固定化酶是指固定在载体上并在一定的 空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既 保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不 足之处，具有增强稳定性，可反复或连续使 用以及易于和反应产物分开等显著特点。直 接固定菌体或菌体碎片的，称为固定化菌体 或固定化死细胞。
（2）半透膜包埋法 将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小
球内，制成固定化酶. 制备方法： 酶， 水， 乙二胺
癸二酰氯+氯仿
包埋法 优点：结合力牢、活力回收高、底物专一性不变。
缺点：制备较难，载体无法回收、扩散限制。
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三 固定化酶的性质
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固定化酶的四种方法[整理版]
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1吸附法:利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。
通常有物理吸附法和离子吸附法。
常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。
该方法最显著的优点是操作简便，但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。
因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。
通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。
物理吸附法:酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。
从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。
该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。
离子吸附法:将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法。
该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可以得到较高活性的固定化酶。
采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、B一淀粉酶、纤维素酶等。
2交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键。
常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果.酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。
3载体结合法最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。
在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。
参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。
此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。
第三章固定化酶
活
化 载
辅基
体
连接臂
载体的选择
没有特异性吸附 具有多孔性 有适合引入配基的官能团 化学稳定性 具有适当的机械强度等。
目前使用的载体主要是琼脂糖，此外还有纤维素、玻 璃珠及合成高分子材料等。
4、化学结合法－共价结合法
原理: 酶蛋白分子上的功能基
团（酶的非活性必需侧 链基团）和固相支持物
表面上的反应基团之间 形成共价键，因而将酶 固定在支持物上。
最常用的偶联基团： -NH2、COOH、-SH、-OH、酚 基、咪唑基
两种固定方式
1. 将载体有关基团 活化，然 后此活泼基团再与酶分子上 某一基团反应形成共价键。
第三章
酶的固定化
第一节 酶的固定化 第二节 辅酶的固定方法 第三节 固定化细胞 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 第五节 固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
交联法常与吸附法结合使用，或者与 包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合 于载体上。
酶直接交联法
在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不 溶性衍生物。
固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离 子强度、温度和反应时间之间的平衡。
例：木瓜蛋白酶在0.2％酶蛋白浓度、2.3％戊 二醛、pH5.2-7.2、0℃下交联24h，可形成固 定化酶。
定向固定化方法
① 酶和抗体的亲和连接 ② 酶通过糖基部分固定化 ③ 酶和金属离子连接 ④ 分子生物学方法 基因融合法
翻译后修饰法 特定位点基因突变法
第二节 辅酶的固定方法
原因
固定化酶和固定化细胞的制作方法
固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。
是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。
4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。
多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。
（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。
(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。
固定化酶催化反应器的设计与制备
固定化酶催化反应器的设计与制备随着现代工业的发展，化学反应技术的发展也日新月异。
而其中的一种方法——催化反应技术，正日益被广泛应用于各种领域，比如生产中的石油、塑料等。
而酶催化反应是催化反应技术中的一种，由于其具有速度快、选择性好等优点，因此被广泛用于药物、生物、食品等领域。
但是，由于酶催化反应体系不稳定，易受环境因素的影响，因此常规的酶催化反应不能满足实际应用的需求。
为了克服这个问题，研究人员设计并制备了固定化酶催化反应器，以提高酶的稳定性和催化能力，从而实现酶催化反应的可持续发展。
本文将介绍固定化酶催化反应器的设计与制备。
一、固定化酶及其优势固定化酶是将酶固定在载体上，并利用化学或物理方法将酶永久性地固定在载体上的一种方法。
随着固定化酶技术的发展，越来越多的研究证明，固定化酶的具有以下优势：1. 提高酶稳定性和催化能力通常情况下，自由酶催化不稳定、失活等问题常常影响酶催化反应的效率，而固定化酶可以通过载体的微环境和共存物质来提高酶的稳定性和催化能力。
2. 重复使用和再利用的能力如今由于亚太地区的经济增长以及城市化进程加快等进程，环境污染问题显得越加突出，而固定化酶可以实现重复使用，从而减少了对环境的污染，并且减少生产成本。
3. 具有某些独特优势由于固定化酶可以变成几乎任何形状的颗粒、毛细管、膜等，因此可以应用到各种系统和过程中。
二、固定化酶催化反应器的设计固定化酶催化反应器的设计通常需要考虑以下几个方面：1. 固定化酶的选择和制备首先，需要选择适合的酶和载体，并对这两者进行固定化。
载体需要具有合适的呈色以及空间结构来保持酶的活性，同时要考虑载体的质量，因为质量差的载体往往会导致酶催化反应活性降低。
对于不同类型的酶，需要选择不同的固定化方法和载体。
2. 反应器的类型和形式反应器的类型和形式要根据所需要催化反应的条件和工艺要求来选择。
常用的固定化酶反应器类型包括固定化床反应器、滴流床反应器、流动反应器和快速氧化反应器等。
高中生物 3.2 固定化酶的制备和应用课件 苏教版选修1
探究点一 探究点二 探究点三
2.结果分析与评价 (1)凝胶珠的颜色和形状:如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色,说明海藻 酸钠的浓度偏低,固定的酵母细胞数目较少;如果形成的凝胶珠不是圆形或椭 圆形,则说明海藻酸钠的浓度偏高,制作失败,需要再作尝试。 (2)检验凝胶珠的质量是否合格,可以使用下列方法。一是用镊子夹起一 个凝胶珠放在实验桌上用手挤压,如果凝胶珠不容易破裂,没有液体流出,就表 明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠,如果凝胶珠很容易 弹起,也能表明制备的凝胶珠是成功的。
提示:固定化酵母细胞包埋在海藻酸钠内,不容易与葡萄接触。可用葡 萄糖溶液代替鲜葡萄,将固定化酵母细胞加到葡萄糖溶液中发酵,葡萄糖容 易透过海藻酸钠进入到凝胶珠内部。
探究点一 探究点二 探究点三
●名师精讲●
1.实验流程的几点提醒 (1)选用的干酵母要具有较强的活性,而且物种单一。 (2)酵母菌细胞活化时体积会变大,因此活化前应选择体积足够大的容器, 防止酵母菌细胞的活化液溢出。 (3)海藻酸钠溶液的配制是固定化细胞的关键,因为如果海藻酸钠浓度过 高,将很难形成凝胶珠,如果浓度过低,形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞的数 量少,也会影响实验结果。 (4)溶化海藻酸钠时要用小火或间断加热,避免海藻酸钠发生焦糊。 (5)将溶化后的聚乙烯醇—海藻酸钠溶液先冷却至 45 ℃,再与预热至 35 ℃ 的酵母菌培养液混合,避免高温杀死酵母菌细胞。要混合均匀,不要进入气泡。 (6)固定化酵母菌细胞时,应将酵母菌—聚乙烯醇—海藻酸钠胶液用注射 器以恒定速度缓慢滴入饱和硼酸—氯化钙溶液中,而不是注射,以免影响凝胶 珠的形成。 (7)细胞的固定要在严格的无菌条件下进行,如定容时要用蒸馏水,冲洗凝 胶珠要用无菌水。
固定化细胞 一系列酶 明胶、琼脂糖、海藻酸 钠、醋酸纤维素、聚丙烯 酰胺 包埋法
酶的固定化..
纤维素
CMC －CH2COOH
+盐酸甲醇
CMC－甲酯 ＋肼 制备酰肼 CMC－酰肼 亚硫酸钠 ＋ 盐酸 CMC－叠氮化物 ＋NH2 酶
重氮化剂、烷化
剂等反应形成共 价键制备固定化
酶。
叠氮化物
固定化酶 －CH2CO-NH 酶
羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序
共价键结合法
4.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶 固定化的方法。 载体：琼脂、海藻酸钠、明胶聚丙烯酰胺等 包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊法。 凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微
孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多 数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶 有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶 以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。
2)、制备固定化酶遵循基本原则：
（1）必须注意维持酶的催化活性及专一性。 （ 2 ）固定化应该有利于生产自动化、连续化。 （3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨 碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 （4）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能 回收贮藏，利于重复使用。 （5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与 废物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶成本要低，以利于工业使用。
微胶囊法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球
内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰 胺膜、火棉胶膜等。
包埋法
凝胶包埋法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）
丙烯酰 胺
氢气
固定化 酶
光照 切 割 聚合反应 凝胶酶块
酶液
N， N－ 双丙烯 酰胺
固定化酶技术
1.4交联法 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白 之间的交联，使酶分子和多功能试 剂之间形成共价键，得到三向的交 联网架结构，除了酶分子之间发生 交联外，还存在着一定的分子内交 联。多功能试剂制备固定化酶方法 可分为：(1) 单独与酶作用；( 2) 酶 吸附在载体表面上再经受交联；( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功 能团的载体，再连接酶。交联剂的 种类很多，最常用的是戊二醛，其 他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二 联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。 交联法的优点是酶与载体结合牢固， 稳定性较高；缺点是有的方法固定 化操作较复杂，进行化学修饰时易 造成酶失活。
用固定化酶处理受污染水体中的农药也取 得了很好的效果。
用聚丙烯负载二氧化钛膜固定农药降解酶， 降解农药甲基对硫磷。研究发现，甲基对 硫磷在30 min 内降解了70%以上。尤其等 以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，固定 化真菌漆酶对农药氯苯嘧啶醇进行降解。 研究认为，在酸性条件下，固定化漆酶对 氯苯嘧啶醇具有良好的降解作用。
4.2.3 其他应用
CO2是一种重要的温室气体。目前全球每 年排放的数十亿吨CO2需要得到妥善的处 置。固定化酶技术在固定CO2方面也取得 了成果。据报道，以工业固体废弃物为原 料， 利用固定化碳酸酐酶和超重力强化反 应可得到CO2的有效固定 固定化酶技术在清洁生产领域具有潜在的 应用价值。固定化的木聚糖酶和漆酶用于 纸浆漂白， 可以避免产生传统造纸工艺过 程中用氯漂白产生的难以生物降解的各类 氯代有机物。
包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等 多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法 比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低， 但此法对大分子底物不适用。
(1)网格型 将酶包埋在凝胶细微网 格中，制成一定形状的 固定化酶，称为网格型 包埋法。也称为凝胶包 埋法。
高中生物苏教版高二选修1课件：第三章_第二节_固定化酶的制备和应用
1．直接使用酶、固定化酶、固定化细胞的比较
项目 直接使用酶
固定化酶
固定化细胞
酶的 一种或几种
种类
一种
一系列酶
常用 载体
纤维素、琼脂糖、硝 明胶、琼脂、海藻酸
酸纤维素、聚丙烯酰 钠凝胶、角叉菜胶
胺凝胶
一分耕耘一分收获
项目 直接使用酶
固定化酶
固定化细胞
制作方法
物理吸附法、化学 包埋法、物理 结合法、包埋法 吸附法
一分耕耘一分收获
固定化酶和固定化细胞的原理、作用
[例 1] (江苏高考)下列有关固定化酶和固定化细胞的叙
述，正确的是
()
A．可用包埋法制备固定化酵母细胞
B．反应产物对固定化酶的活同
D．固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应
一分耕耘一分收获
[思路点拨]
一分耕耘一分收获
(3)某同学用图丙所示的装置来进行葡萄糖发酵。a 代表________，
b 代表________。从上端漏斗中加入反应液的浓度不能过高的原
因是__________________________________________________。
为使该实验中所用到的固定化酵母细胞可以反复利用，实验过程
质，反应效率下降
一分耕耘一分收获
酵母菌细胞的固定化技术
一分耕耘一分收获
一分耕耘一分收获
1．酵母细胞固定前要活化，原因是什么？ 提示：在缺水状态，微生物处于休眠状态。活化就是让处于 休眠状态的酵母细胞恢复正常的生活状态。 2．为什么麦芽汁可以被质量分数为 10%的葡萄糖溶液替代？ 提示：酵母菌也可以利用葡萄糖作为营养物质。 3．为什么说海藻酸钠适用于多种细胞的固定化？ 提示：用海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞，除对细胞无 毒性外，还具有操作简便、条件温和等特性。通过改变海藻酸钠 的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。
氨基树脂固定化L-苏氨酸醛缩酶及其应用
氨基树脂固定化L-苏氨酸醛缩酶及其应用
氨基树脂固定化L-苏氨酸醛缩酶（L-alanine racemase）是一种将L-苏氨酸转化为D-苏氨酸的酶。
通过将该酶固定在氨基树脂表面，可以提高其稳定性和重复使用性，并方便在工业生产中应用。
以下是氨基树脂固定化L-苏氨酸醛缩酶及其应用的一般情况：
1. 固定化酶的制备：首先，将氨基树脂悬浮于适当的缓冲溶液中。
然后，将L-苏氨酸醛缩酶加入溶液中，并在一定时间下与氨基树脂表面结合。
接着，用适当的缓冲溶液洗涤固定化酶，以去除未固定的酶分子，最终得到氨基树脂固定化酶。
2. 优点：
- 增加酶的稳定性：固定化酶具有较好的热稳定性和耐酸碱性，能够在广泛的条件下工作。
- 简化分离过程：固定化酶可在反应结束后直接从反应混合物中分离，减少离子交换或亲和层析等分离步骤的复杂性。
- 可重复使用：氨基树脂固定化酶可以多次使用，减少成本并提高效率。
3. 应用：
- 生物催化：通过将氨基树脂固定化L-苏氨酸醛缩酶应用于生物催化反应中，可实现对L-苏氨酸和D-苏氨酸之间的转化。
这在药物合成、生物工程和制药等领域中具有潜在的应用价值。
- 食品工业：固定化酶可以在食品工业中应用于副产物的转化、食品添加剂的生产等。
- 医药工业：固定化酶可以用于合成药物的中间体，或制备手性药物。
需要注意的是，具体的氨基树脂固定化L-苏氨酸醛缩酶及其应用的条件和方法可能因实际情况和需求的不同而有所差异。
在实际操作中，最好参考相关领域的专家意见，并基于实验结果和应用需求进行调整和优化。
生化技术固定化酶及微生物
●固定化酶的最大反应速度与游离酶相比，要依具体情况而定。大多数 酶经固定化以后， Vm 变化不大，但也有由于固定化方法不同而有差异 的。如：以多孔玻璃为载体共价结合的转化酶，其Vm 与游离酶相同； 但用PEAE凝胶包埋的转化酶，其Vm却只 相当于游离酶的1/10。
固定化酶稳定性提高的原因可能是： ➢带电荷载体与酶分子之间产生了静电作用，对酶的特定空间 构象起到稳定作用 ➢蛋白水解酶在固定化后避免了酶自身的消化现象发生 ➢固定化以后，由于空间位阻，降低了变性剂、解离剂、有机 溶剂等对酶的进攻破坏作用
（四）米氏常数
●米氏常数（K m ）是酶的一个特征性常数，每一种酶都有一定的K m 值，其倒数1/ K m 称为亲和常数，用来表示酶与底物的亲和力；而固定 化酶的K m 值和最大反应速度（Vm ）常因酶蛋白结构的变化和载体带电 荷的影响而变化。
缺点：这种固定化酶制品只能应用于底物和产物的分子质量都小的反 应中
四、固定化微生物的制备
目前，固定化微生物的制备方法最多的是包埋法， 其次是载体结合法和交联法；另外，还有用选择性 热变法制备固定化微生物的，就是将细胞在适当温 度下进行处理，使细胞膜蛋白变性，但不使酶变性 而使酶固定与细胞内的方法
此外，顺丁烯二酸酐或乙烯共聚物与酶分子在六 甲撑二氨作用下，相互间进行反应，亦可制成固定 化酶
3、包埋法
定义： 就是将酶包裹到高分子凝胶等物质的细微网格中，或包埋到高 分子半透膜中制成固定化酶的方法
分类：包埋法根据包埋分式不同分为网格型和微囊型
优点：由于包埋法制备固定化酶的过程中，酶本身不发生物理化学变 化，故其活力回收率较高，适用于固定各种类型的酶。目前应 用较多的是格子型包埋法，此法所用的材料有聚丙烯酰胺、聚 乙烯醇、天然琼脂糖和淀粉等，用其制备固定化酶的操作简单
第三节酶的固定化
第三节酶的固定化随着酶学研究的深入和酶工程的发展，酶的应用越来越广泛。
将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不稳定性，具有可反复或连续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。
一、固定化酶的制备方法制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交联法等（图2-3）。
1．包埋法将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。
凝胶包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。
最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。
微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。
常用的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。
2．吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。
吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。
吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，而且可反复使用。
但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不太牢固而易脱落。
3．共价偶联法利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。
这种方法的优点是酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。
缺点是制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活。
共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。
4．交联法交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之间发生交联作用而制成固定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。
其中应用最广泛的是戊二醛。
用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。
第五章固定化酶
一、固定化细胞的概念和目的
概念
细胞的固定化是利用物理、化学等因素将细胞约 束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留 其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力
目的
生产酶等各种代谢产物。可代替游离细胞进行酶 的发酵生产。具产酶率高、发酵周期短、可连续 发酵等优点
➢ 微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成 固定化细胞
6、相 对 活 力 ＝ 加 入 酶 的 总 活 固 力 定 - 化 上 酶 清 总 液 活 中 力 未 结 合 酶 活 力 1 0 0 ％
第二节结束 优点 固定化酶的优缺点
性固 质定 及化 其酶 评的 价特 指点 标、
缺点
固定化酶的性质变化
酶活力的变化 酶稳定性的变化 最适温度的变化 最适pH的变化 米氏常数(Km)的变化
4、最适pH的变化
➢ 最适pH、酶活力－pH曲线发生偏移
➢ 带负电荷载体(阴离子聚合物)，最适pH偏高， 向碱性偏移
- --
-
--
-
---
--------------------------------
+ H+ +
+++ +
H+
H+
+
+
+
+ H+
+
-
OH-
-
-
OH-
-
OH- -
-OH-
-
-
-
-
5、米氏常数(Km)的变化
（2） 考察固定化酶稳定性 （3） 考察固定化酶最适反应条件
第三节提要
固定化酶的制备原则
尽可能地保持自然酶的催化活性 载体与酶结合牢固 空间位阻较小 成本尽可能低
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固定化酶制备及酶活力测定实验者：张玲玲绿药1班 201330360126 同组者：金雨馨、管青青实验日期：2015/3/13 报告完成日期：2015/3/20实验指导：易喻摘要：酶的固定化技术是用固定材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
酶活力的测定实质是测定被酶所催化的化学反应速度。
本文通过包埋法对酶进行固定化，并利用福林酚反应测定碱性蛋白酶的酶活力。
结果表明：固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。
关键词：固定化酶酶活力包埋法Abstract：Enzyme immobilization is a kind of technology that confine enzyme to a certain area by fixed material and the enzyme can still carry out its unique catalytic reaction .Determination of enzyme activity is essentially determination of enzyme-catalyzed chemical reaction rate. In this article, we fixed enzyme by embedding and determinated enzyme by Folin phenol reaction. The result showed that enzyme immobilization can enhance the stability of the enzyme, but will reduce the enzyme activity.前言：酶的固定化（Immobiiization of enzymes）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。
与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。
依据酶的性质及用途，可通过包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固定化。
其中包埋法是将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。
所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。
分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。
它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。
酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林—酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。
正文：1.实验过程1.1试剂与仪器1.1.1试剂①海藻酸钠、3.0%氯化钙②碱性蛋白酶（1.0mg/mL）③福林试剂④1%酪蛋白溶液⑤PH10缓冲液⑥标准酪氨酸溶液⑦0.4mol/L碳酸钠溶液，0.4mol/L三氯醋酸溶液1.1.2仪器①磁力搅拌器②恒温水浴锅③注射器④烧杯（100mL,500mL）⑤布氏漏斗⑥分析天平⑦容量瓶⑧移液管⑨721分光光度计1.2操作步骤1.2.1酶的固定化称取1.00g海藻酸钠于盛有30mL蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温渐冷却至38℃左右，加入预先制备好的碱性蛋白酶溶液20mL。
用注射器抽取海藻酸钠－酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有200mL3.0％氯化钙溶液的烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化30min，倾去氯化钙溶液，用适量蒸馏水洗涤2-3次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的碱性蛋白酶。
1.2.1酶活力的测定1.2.1.1制备酪氨酸标准曲线(1) 取7支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。
（见下表）(2) 在上述7支试管中，分别加入1%酪蛋白溶液1mL，于40℃水浴中保温15 min，取出后，加入0.4 mol/L三氯醋酸3 mL，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。
(3)分别吸取滤液1mL放入另7支试管中，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL，福林试剂1mL，充分摇匀，于40℃水浴中保温15 min，然后于每管中各加入3 mL蒸馏水，充分摇匀。
(4) 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680 nm处测定光密度。
(5) 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。
试管编号酪氨酸含量（μg）1㎎/mL酪氨酸标准溶液（mL）蒸馏水( mL )0 1 2 3 4 5 6 01002003004005006000.10.20.30.40.50.62.01.91.81.71.61.51.41.2.2固定化酶活力测定上述固定化的蛋白酶或相当量的游离蛋白酶（20 mL）置于盛有20 mL pH 10缓冲液的三角瓶中，加20 mL 1%酪蛋白溶液，于40℃水浴保温15min后，取3 mL置于试管中，加3 mL三氯醋酸溶液。
对照管为1 mL 缓冲液＋1 mL 蛋白酶液＋3 mL 三氯醋酸溶液＋1 mL 1%酪蛋白溶液（顺序不可颠倒），于40℃水浴保温15min 。
摇匀后，各管分别过滤，吸取滤液1mL ，加入0.4 mol/L 碳酸钠溶液5mL ，福林试剂1 mL ，充分摇匀，于40℃水浴保温15min ，然后每管各加入3 mL 蒸馏水，摇匀。
用721型分光光度计在波长680 nm 处，以对照管为对照，测定吸光值。
2.结果与讨论2.1结果2.1.1酪氨酸标准曲线的绘制表2-1酪氨酸含量与吸光度关系表 酪氨酸含量（微克） 0 100 200 300 400 500 600 吸光度 00.1180.2020.2680.3930.5630.600图2-2酪氨酸标准曲线y = 0.001x - 0.0045R 2= 0.974700.10.20.30.40.50.60.70100200300400500600700酪氨酸含量（微克）A 680n m舍去与拟合直线差距较大的点（500,0.563），再次拟合，得到的标准曲线线性较好。
图2-3酪氨酸标准曲线y = 0.001x + 0.0051R 2 = 0.991400.10.20.30.40.50.60.70100200300400500600700酪氨酸含量（微克）A 680n my=0.001x+0.00512.1.2酶活力的测定本实验中碱性蛋白酶活力单位的定义：1克碱性蛋白酶粉在pH 10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1微克酪氨酸，定为一个酶活力单位（U ）。
本实验中碱性蛋白酶活力单位的计算： 每克碱性蛋白酶的活力单位 = m / t ×fm ： 样品所测定的光密度值，经查标准曲线求得的酪氨酸量（μg ）； t ： 酶促反应的时间（15 min ）；f ： 酶的稀释倍数，本实验中f = 1000表2-4固定酶与游离酶活力的测定比较表2.2讨论2.2.1标准曲线的分析图2-2为将实验测得的六组数据绘制的标准曲线，拟合得到的R 2＜0.99，线性关系不是很理想，因此舍去了偏离直线较远的点（500，0.563）,得到图2-3，线性关系良好。
部分数据与直线偏离较远，可能是由于比色皿没有洗干净,水浴保温时每管的水浴时间不一样等其它原因。
标准曲线是为了计算酪氨酸含量的，标准曲线越标准，计算出来的数据才有意义，如果线性不好的话，会对结果造成影响。
酶量（毫克） OD 值 酪氨酸量（微克） 碱性蛋白酶活力单位(U) 酶结合效率（%） 空白1.0 0.000 0.0 0.00 58.06%固定酶 1.0 0.269 263.9 17593.33 17626.671.00.270 264.9 17660.00 游离酶 1.00.455 449.9 29993.33 30360.00 1.00.466460.930726.672.2.2酶活力的分析表2-4为酶活力的测定以及比较。
由表中数据分析得：固定酶的酶活力要低于游离酶的酶活力，说明在酶固定的过程中有部分酶的损失。
并且从表中可发现相同酶的两组OD值还是有差距的，尤其是游离酶的两组实验数据的差距比较大，可能是在实验的过程中保温时间控制的不好，没有及时加入三氯醋酸。
实验结果表明：固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。
3.注意事项与心得总结3.1注意事项①酶液与加热溶解的海藻酸钠混合时，海藻酸钠溶液一定要冷却至40℃以下后再加入酶液，以免高温导致碱性蛋白酶酶失活。
②固定化酶颗粒制备中，海藻酸钠－酶混合物向CaCl2溶液滴加的速度不要过快，混合物要呈颗粒进入CaCl2溶液，以免形成念珠状颗粒。
③在制备酶活力测定的空白对照时要先加入三氯醋酸使酶失活，再加入酪蛋白溶液，顺序不可以颠倒。
④在酶活力测定是要严格控制水浴保温的时间一致，控制变量，减少实验误差。
3.2心得总结本实验通过包埋法进行了固定化酶的制备及固定酶与游离酶的酶活力比较，发现固定酶虽然能够增强酶的稳定性，便于酶和底物的分离，但是会造成酶量的损失，使酶活力降低。
所以需要寻求一种能提高酶结合率的固定方法。
本实验仅单纯的对游离酶和固定酶的酶活进行了比较，还可以设计系列实验对固定酶的其它性质如最适温度，最适PH等进行研究。
致谢：感谢队友们的合作以及易喻老师的耐心指导！参考文献：[1]固定化酶的制备及应用[期刊论文] 李彦锋, 李军荣, 伏莲娣, LI Yan-feng, Li Jun-rong, FU Lian-di - 《高分子通报》2001年2期[2]黑曲霉果胶酯酶固定化前后酶学性质比较研究[期刊论文] 张庆坤, LEI Ji, 付亚敏, FAN Yang, 刘刚, ZHANG Qing-kun, LEI Ji, FU Ya-min, FAN Yang, LIU Gang - 《食品工业科技》2008年7期。