土壤微生物计数法
实验五 土壤中微生物的分离计数
（四）悬液稀释
无菌操作采用－4，－5，－6 稀释液涂布牛肉膏蛋白 胨平板;每个稀释度2个重复。每人用剩下的1个平板做 划线分离，从三角瓶中取土壤悬液作划线分离。
10-1 10克 土样
90毫升 无菌水
10-2
10-3
10-4
10-5
(五)平板涂布
Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod.
一、实验目的：
学习微生物稀释平板计数及划线分离技术 二、实验原理: 采用适宜（选择）培养基和培养条件，或加入某种抑 制剂有利于目标微生物的生长，从而分离获得目标微
生物的纯培养：常用稀释平板分离法和划线分离法
在固体培养基上形成单个菌落。
依据一个单细胞在固体培养基上培养后可以长成一菌
落从而推算样品中含有多少细菌的活菌数目。
简单易行，但易 造成机械损伤
（六）培养：
将平板用报纸包好（每个平板方向一致），
写上班级和姓名，皿底朝上，置于培养箱 培养(温度37℃) 。
（七）细菌计数结果
稀释度 平板 10-5 1 2 10-6 度平 均菌落数
土壤中含 细菌数量
四、平皿划线 分离法
特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）
五、试管斜面接种
1.两支试管呈“V”字形 3.火焰上微烧一周
2.拔下试管塞
4.接种环灼烧、冷却 6.塞上塞子，灼烧接种环
5.接种、划线
六、思考题
(1) 要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关 键?为什么?
(2)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而
实验九土壤微生物的分离与计数
五、思考题
平板计数
1、记录利用稀释涂布法对土壤样品进行活菌计数的结果。
平板中的CFU数
重复
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1
2
3
平均
稀释度细菌
10-4
10-5
10-6
稀释度 放线菌
10-2
10-3
10-4
稀释度 真菌
10-2
10-3
10-4
每克含菌样品中细菌/放线菌/真菌 活细胞数＝ （同一稀释度平板上菌落平均数× 10×稀释倍数） 含菌样品克数
0.1ml菌悬液，涂布法分离
放线菌
10-3 、10-4、 10-5
0.1ml菌悬液，涂布法分离
霉菌
10-2、 10-3、 10-4
0.1ml菌悬液，涂布法分离
4、涂布：取0.1ml适当浓度的稀释液涂布于相应平板，每个 稀释度做3个平行，每种菌需要做9块平板，及时 标记，涂布后静置10分钟。
02
三、实验材料
1、倒平板 2、土壤菌悬液的制备
四、实验方法
3、梯度稀释 取1ml土壤菌悬液移入含9ml无菌水的试管中，吹吸均匀，为稀释10倍的样品，依次进行梯度稀释10-1~10-6
分离对象
稀释度
分离方法
细菌
10-4 、10-5、 10-6
5、培养 将细菌、真菌、放线菌培养基倒置于30℃培养箱中培养3-5d。 6、计数 7、挑菌（纯化） 将培养后长出的单菌落数量、形态、培养特征进行观察，分别挑取单菌落于相应平板上划线、分离， 培养，检查菌落是否一致、单纯（也可以用显微镜涂片染色镜检是否是单一的微生物），如有杂菌需进一步纯化、分离。
实验四 土壤微生物的分离和计数
牛肉膏蛋白胨培养基； 高氏1号培养基； 马铃薯葡萄糖培养基（添加有抗生素）；
灭菌水、移液器、吸头、接种针、涂布器、灭 菌离心管、消毒酒精、试管架、记号笔、吸水 纸、酒精灯、平皿、漩涡振荡器、天平等。
实验内容
土壤微生物的分离和纯化 系列稀释法 划线法（讲解） 分离微生物的形态观察 （3天后） 细菌 放线菌 真菌
记录系列稀释法分离土壤微生物的结果：
真菌菌落的种类和数量，菌落特征描述； 细菌菌落的种类和数量，菌落特征描述； 放线菌菌落的种类和数量，菌落特征描述；
通过试验和查阅资料，独立完成思考题。 实验中出现问题的分析和讨论。
3天后观察记录分离试验结果，上交实验报告。
思考题：
在分离真菌时，有哪些方法可以避免或减少 细菌的污染？
称取土壤样品0.5~1.0 g加入含30ml灭菌水的塑料离心管 中振荡3～5分钟（旋涡振荡器），形成土壤悬浊液； 取0.1ml加入装有0.9ml灭菌水试管中，振荡均匀。依次稀 释，共5次。 细菌的分离：取第3，4，5 ，6四个稀释水平的样品分别 取0.1ml，均匀涂布在牛肉膏蛋白胨培养平板上； 放线菌的分离：取第1，2，3 ，4四个稀释水平的样品分 别取0.1ml，均匀涂布在高氏1号培养基； 真菌的分离：取第2，3，4 ，5四个稀释水平的样品分别 取0.1ml，均匀涂布在含抗生素的PDA平板上； 菌液被培养基吸收后，反转放置，做好标记，28℃培养。
细菌菌落的共同特征
湿润 粘稠 质地均匀 较透明 易挑取（与培养基结合不紧密） 菌落正、反面、边缘、中心颜色一致
注意事项：
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法常规培养法是最早也是最常用的土壤微生物量测定方法之一、该方法是将土壤样品经过稀释后接种到含有特定培养基的培养皿中，经过一段时间的培养，根据培养皿上的菌落数量计算土壤中微生物的数量。
常用的培养基有营养琼脂培养基、土壤细菌培养基和土壤真菌培养基等。
常规培养法的优点是简单易行，可以同时测定不同类型微生物的数量，但该方法有一些局限性，如只能测定能够在培养基上生长的微生物，不能测定需异养条件才能生长的微生物，而且该方法容易低估土壤中微生物的真实数量。
生物量测定法是一种利用土壤微生物的生物学过程测定微生物量的方法。
该方法一般分为碳饥饿法和氮饥饿法两种。
碳饥饿法是将土壤样品暴露在低碳条件下（如0.01%葡萄糖溶液中）一段时间后，测定土壤中的微生物的生物量。
氮饥饿法是将土壤样品暴露在低氮条件下（如0.01%硝酸铵溶液中）一段时间后，测定土壤中的微生物的生物量。
这两种方法都是利用微生物的生物学特性，通过测定微生物对不同养分的响应来估计微生物的数量。
生物量测定法的优点是准确度较高，可以测定土壤中广泛类型的微生物，但该方法也有一些局限性，如需要较长的试验周期，测定过程中需要严格控制温度、湿度等环境条件，且操作较为繁琐。
生物学特征法是一种通过测定土壤微生物的生物学特征来评估微生物群体数量的方法。
该方法常用的特征包括土壤酶活性、呼吸作用速率、微生物生长速率和微生物群体的磷脂脂肪酸组成等。
这些特征的测定可以通过色谱、酶反应和分子生物学技术等手段进行。
生物学特征法的优点是操作简便，消耗土壤样品较少，时间短，结果可靠。
但该方法也有一些问题，如不同微生物对环境的响应不同，结果受环境因素影响较大。
综上所述，土壤微生物量的测定方法有常规培养法、生物量测定法和生物学特征法等。
不同的测定方法各有优缺点，使用时可以根据具体的研究目的和所需数据的准确度进行选择。
此外，单一的方法往往无法全面准确地评估土壤微生物量，因此常采用多种方法综合分析，以得到更准确的结果。
土壤微生物计数法
土壤微生物计数法土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。
土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。
1.1培养计数法1.1.1概要在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。
因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。
这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。
稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。
最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。
根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。
1.1.2稀释平板法一、试剂配制常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。
按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。
凝固后的培养基可加热溶解后使用。
二、仪器设备广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。
（1）土壤系列稀释液制备取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。
土壤微生物数量测定方法
土壤微生物数量测定方法土壤微生物是指生活在土壤中的微小生物，包括细菌、真菌、放线菌、古菌等。
土壤微生物在土壤的生物地球化学循环、有机质分解、养分转换和植物健康等过程中起着重要的作用。
因此，对土壤微生物数量的准确测定具有重要意义。
本文将介绍一些常用的土壤微生物数量测定方法。
1.瓶培法：将适量的土壤样品与适量的培养基混合，在37°C下培养约24小时，然后通过平板计数法或最凼稀释法进行测定。
2.膜过滤法：将土壤提取液通过特定孔径的膜过滤器滤过，然后将膜放置在培养基上进行细菌的生长，最后进行计数。
3.间接法：通过测定土壤样品的可培养细菌指标，如氧化还原酶、脱氢酶等的活性，从而推算出土壤中的细菌数量。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的细菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行细菌数量的测定。
1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的真菌，通过计数来估算真菌的数量。
2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使真菌生长形成菌落，最后进行计数。
3.膜过滤法：与细菌数量测定相似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行真菌的生长，最后进行计数。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的真菌基因，如18SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行真菌数量的测定。
1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的放线菌，通过计数来估算放线菌的数量。
2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使放线菌生长形成菌落，最后进行计数。
3.膜过滤法：与细菌和真菌数量测定类似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行放线菌的生长，最后进行计数。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的放线菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行放线菌数量的测定。
通过上述方法测定土壤中微生物的数量，可以了解土壤微生物对土壤生态系统功能的影响，并为土壤质量评价和科学合理利用提供依据。
土壤微生物数量测定方法
土壤微生物的分离鉴定及数量测定（一）培养基的制备Ⅰ测定微生物总量培养基：1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）牛肉膏Beefextract5.0g蛋白胨Peptone10.0gNaCI5.0g蒸馏水H201000m1琼脂15～20gPH7.2~7.4制备步骤：⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解.⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌.⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL.⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH 调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。
一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。
⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。
注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。
如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。
，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。
⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min.2.放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基）可溶性淀粉20gKNO3 1gK2HPO40.5gMgSO4• 7H2O 0.5gNaCl 0.5g原0.05gFeSO4• 7H2O 0.01gpH 7.2-7.4制备步骤：（1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。
（2）称量准确称量各种成分。
（3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。
土壤微生物测定方法
土壤微生物测定方法
目前常用的土壤微生物测定方法主要包括直接计数法、培养法、DNA
分析法和生化方法等。
1.直接计数法：直接计数法是指通过显微镜观察和计数土壤中微生物
的数量。
这种方法简单直观，可以快速测定土壤中微生物的数量。
但是，
由于土壤微生物数量庞大，直接计数方法需要大量的样品和时间，且对操
作者的要求较高。
2.培养法：培养法是指通过将土壤样品接种在富含营养物质的培养基上，并在一定温度和湿度下培养一段时间，通过观察和计数可见的菌落来
测定土壤中微生物的数量和种类。
这种方法可以有效地测定土壤中常见的
细菌和真菌等，但是对于无法培养的微生物种类相对有限。
3.DNA分析法：DNA分析法是指通过提取土壤中微生物的DNA，并通
过PCR扩增和DNA测序等技术来测定土壤中微生物的种类和多样性。
这种
方法可以检测到所有存在的微生物，无论是否可以培养。
因此，DNA分析
法可以更全面地测定土壤中微生物的多样性和种类。
但是，这种方法对实
验条件和技术要求较高。
4.生化方法：生化方法是指通过测定土壤中微生物代谢产物的含量或
活性来测定土壤中微生物的数量。
例如，通过测定脲酶、葡萄糖酶、氧化
还原酶等土壤微生物常见的酶活性来评估微生物的活性和数量。
生化方法
可以快速测定土壤微生物的数量和活性，但是受土壤理化性质的影响较大。
总之，以上所述的方法各有优缺点，可以根据实际情况选择合适的方
法或多种方法相结合来测定土壤微生物的数量和多样性。
此外，测定方法
的选择还要考虑实验所需的样品数量、可行性和经济性等因素。
土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法
土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法土壤酶活性测定取样工具及取样方法在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或者塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。
土样在自然条件下烘干装入袋中备用。
所需试剂：酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、配置方法：铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100µg N。
往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。
醋酸缓冲液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。
硼酸缓冲液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）与0.2mol/l的硼酸混合。
纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱与水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。
加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱与溶液1ml，加水至200ml。
静置，取上层清液，贮于棕色瓶中酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳固，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳固后，570nm比色绘制标准曲线。
测定方法磷酸酶活性测定一、试验原理土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。
土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法1.直接计数法：直接计数法是通过显微镜观察土壤样品中微生物数量来测定土壤微生物生物量。
常用的直接计数法包括滴定法、薄层计数法和电镜计数法。
滴定法是将土壤样品溶解后，通过滴定法来计数微生物细胞的数量。
滴定法主要包括用荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）作为参比菌，将细菌与土壤样品混合，经一系列稀释后进行滴定。
通过观察滴定液中菌落的数量，可以推算出原始土壤样品中微生物的生物量。
薄层计数法是将土壤样品制成薄层，然后在显微镜下进行计数。
这种方法可以直接观察微生物的形态特征，通过计算单位面积上微生物的数量来估算微生物生物量。
电镜计数法是利用电镜的高分辨率特性，观察土壤样品中微生物的形态和数量。
这种方法可以观察到更小的微生物和微生物的形态细节，但是操作复杂，成本较高。
2.间接测定法：间接测定法通过测定土壤中微生物活性代谢产物来估算微生物生物量。
常用的间接测定法包括ATP测定法、细胞膜脂肪酸测定法和氮素代谢产物测定法等。
ATP测定法是通过测定土壤中的三磷酸腺苷(ATP)含量来估算微生物生物量。
微生物的ATP含量与其生物量有一定的关系，因此可以通过测定ATP含量来间接估算土壤微生物生物量。
细胞膜脂肪酸测定法是通过测定土壤样品中微生物细胞膜中的脂肪酸含量来估算微生物生物量。
微生物细胞膜中的脂肪酸种类和含量与微生物群落的组成和数量有关，因此可以通过测定脂肪酸的含量来间接估算微生物生物量。
氮素代谢产物测定法是通过测定土壤样品中微生物氮素代谢产物的含量来估算微生物生物量。
微生物的氮素代谢活动与其生物量有关，因此可以通过测定氮素代谢产物的含量来间接估算微生物生物量。
3.分子生物学方法：分子生物学方法是利用PCR技术对土壤样品中微生物的DNA或RNA进行扩增和测定来估算微生物生物量。
常用的分子生物学方法包括引物扩增法、荧光原位杂交法和高通量测序法等。
引物扩增法是通过设计特定的引物对微生物的DNA或RNA进行扩增，并通过PCR反应的产物数量来估算微生物生物量。
医学：实验土壤中细菌总数的测定-平板计数
本实验的应用前景
本实验所采用的平板计数法具有广泛的应用前景，可 用于研究不同环境条件下土壤中细菌总数的变化规律。
通过深入探究土壤中细菌总数与环境因素之间的关系， 可以为农业生产、土壤保护和土地资源可持续利用提 供科学依据。
实验误差分析
随机误差
由于随机因素引起的误差，如取样不均匀、计数 误差等。
系统误差
由于实验方法、仪器或操作不当引起的误差，如 培养基质量、培养条件等。
误差来源分析
分析误差的来源，提出相应的改进措施，以提高 实验的准确性和可靠性。
结果可靠性评价
重复性检验
通过重复实验，比较实验结果的一致性和稳定性。
可信度评估
03
CHAPTER
实验步骤
土壤样品的采集与处理
1
ห้องสมุดไป่ตู้
采集具有代表性的土壤样品，并记录采样点的环 境信息。
2
将采集的土壤样品进行筛选和研磨，去除其中的 石块和杂质。
3
将处理后的土壤样品进行称重，记录其质量。
土壤样品的稀释与接种
根据土壤样品的质量， 计算所需的稀释液量。
将稀释后的土壤样品 接种到培养基中，确 保均匀分布。
制备菌悬液
将处理后的土壤样品与无 菌水混合，制备成菌悬液。
稀释菌悬液
将菌悬液进行适当稀释， 使每个菌落来源于一个细 菌。
接种培养
将稀释后的菌悬液接种到 培养基上，放入恒温培养 箱中培养。
掌握平板计数法测定土壤中细菌总数的操作步骤
计数菌落
培养一定时间后，观察并计数培养基 上的菌落数。
结果计算
【精品】实验四 土壤微生物的分离和计数
【精品】实验四土壤微生物的分离和计数实验目的：1.掌握土壤微生物的分离方法。
2.利用平板计数法和涂布法等方法进行土壤微生物的计数。
实验原理：1.微生物分离法微生物分离法是将微生物从混合物或样品中分离出来的方法，是微生物学中最常用的一种基本方法。
常用的方法有稀释平板法、涂布法等。
2.平板计数法平板计数法又称菌落计数法，是通过数目测定评估微生物数量的方法。
通常在固体培养基上用微生物悬液接种，培养出菌落，以评估菌群密度。
计算微生物数量时应选择符合菌落特征的一个菌落，如颜色、密度、大小等，并使用总体积、稀释因子及加样体积计算。
3.涂布法涂布法又称涂布分离法，是一种快速、容易、简单、实用的微生物分离和计数方法。
方法是取少量样品加入到无菌的琼脂培养基中，将琼脂培养基均匀地涂布在培养皿中，然后在恰当的温度下和时间内使菌落正常增殖及显像，最后计算菌落单位体积的数量。
实验材料和设备：1.土壤样品；化学试剂：蒸馏水、1%碳酸氢钠溶液、1%双氧水溶液、1.5%琼脂等。
2.培养皿；吸管；移液管；吸胶头；灭菌器；微量注射器等。
实验步骤：1.准备样品：取土壤样品，干燥，粉碎，筛选出粒径较小的部分备用。
2.制备0.1g/ml的悬液：取粉碎好的土壤样品0.1克，加入到10ml的蒸馏水中，用吸管吸取混合后的液体，摇匀后待沉淀，取稠泥状上清液，稀释成0.1g/ml的土壤悬液。
3.平板法计数：取一定体积的土壤悬液接种在称量好的琼脂平板上，进行涂布，涂布均匀后，放置在恰当的温度下，培养约24小时，以单个菌落的数量（单位：cfu/ml）计数，并使用公式计算微生物数量。
4.涂布法计数：用吸管吸取一定体积的土壤悬浊液，加入到10ml的液体琼脂培养基中，均匀地涂布在培养皿中，在适当的温度下和时间内使菌落正常增殖及显像，然后计算菌落单位体积的数量。
实验记录和数据处理：1.记录实验过程、结果和分析。
2.计算平板菌落数量和涂布法菌落数量。
3.对实验结果进行分析比较，得出结论。
土壤酶活性及土壤微生物计数测定办法
土壤酶活性及微生物测定配置方法：铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100µg N。
往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。
醋酸缓冲液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。
硼酸缓冲液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）和0.2mol/l的硼酸混合。
纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。
加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1ml，加水至200ml。
静置，取上层清液，贮于棕色瓶中酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳定，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳定后，570nm比色绘制标准曲线。
七、八、实验步骤取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中，用0.8(16滴)毫升甲苯处理，15分钟后，加入5毫升苯磷酸二钠溶液（6.75克苯磷酸二钠溶于水，并稀释至1升）和5毫升相应的缓冲液（碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸缓冲液）。
仔细混合后，将反应物置于37摄氏度恒温箱中培养12小时，然后用蒸馏水定容至刻度，摇匀过滤，用5毫升水代替基质以设置对照。
为了测定反应混合物中的酚量，取1毫升滤液于100毫升容量瓶中，加5毫升硼酸缓冲液（pH9.0），再加入3毫升2.5%的铁氰化钾和3毫升0.5%的4-氨基安替吡啉，摇动，溶液呈粉红色，然后再加水定容，待颜色褪到稳定时（约需20~30分钟），在分光光度计上于波长570纳米处测定溶液的光密度，根据用酚制备的标准曲线查出供试滤液中酚的含量。
土壤微生物的分离和计数
一,实 验 设 计 请你根据实验流程图和提供的三个资料以及" 请你根据实验流程图和提供的三个资料以及"操作 提示" 在思考有关问题的基础上, 提示",在思考有关问题的基础上,设计出一个详细的 实验方案. 实验方案. 土壤取样 选择培养 梯度稀释
将样品涂布在鉴别纤 维素分解菌的培养基上
筛选产生透 明圈的菌落
2.选择培养 选择培养需要的仪器有: mL锥形 2.选择培养 :选择培养需要的仪器有:250 mL锥形 无菌称量瓶,药匙, mL和 mL的移液管 天平, 的移液管, 瓶,无菌称量瓶,药匙,1 mL和10 mL的移液管,天平, 摇床,温度计等. 摇床,温度计等. mL锥形瓶中装入 锥形瓶中装入30 mL选择培养基 选择培养基, 在250 mL锥形瓶中装入30 mL选择培养基,用8层纱 布做成瓶塞,将瓶口塞紧,再在瓶塞外包裹两层包装纸, 布做成瓶塞,将瓶口塞紧,再在瓶塞外包裹两层包装纸, 用线绳扎紧, ℃下高压蒸汽灭菌 下高压蒸汽灭菌20 min. 用线绳扎紧,在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min. 选择培养的操作:称取土样20 g, 选择培养的操作:称取土样20 g,在无菌条件下加 入装有30 mL培养基的摇瓶中 将摇瓶置于摇床上, 培养基的摇瓶中. 入装有30 mL培养基的摇瓶中.将摇瓶置于摇床上,在30 下振荡培养1 d,至培养基变混浊, ℃下振荡培养1～2 d,至培养基变混浊,重复上述方法 再培养一次,然后再进行梯度稀释和涂布平板. 再培养一次,然后再进行梯度稀释和涂布平板.
3.刚果红染色法分离: 3.刚果红染色法分离:纤维素分解菌这一步所需要的 刚果红染色法分离 仪器有:无菌培养皿,涂布器, mL移液管 装有9mL 移液管, 9mL无 仪器有:无菌培养皿,涂布器,1 mL移液管,装有9mL无 菌水的20 mL大试管 温箱等. 大试管, 菌水的20 mL大试管,温箱等. 培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制. 培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制.在500 mL三角瓶中装入200 mL培养基 培养基, ℃下高压蒸汽灭菌 mL三角瓶中装入200 mL培养基,在121 ℃下高压蒸汽灭菌 三角瓶中装入 min. 20 min. 倒平板操作:将灭菌后的固体培养基熔化, 倒平板操作:将灭菌后的固体培养基熔化,按无菌 操作的要求,在无菌的培养皿中倒入15～ mL培养基 培养基, 操作的要求,在无菌的培养皿中倒入15～20 mL培养基, 15 凝固后待用. 凝固后待用.
土壤中细菌总数的测定
土壤中细菌总数的测定摘要在生态学、农业科学、环境科学和微生物学等领域中，土壤细菌数量的测定是非常重要的研究内容。
本文介绍了两种主要的土壤细菌数量测定方法：菌落计数法和直接计数法，讨论了各自的优缺点以及操作步骤。
菌落计数法菌落计数法是一种通过在培养基上培养细菌，再进行菌落计数的方式来测定土壤中细菌总数的方法。
其操作步骤如下：1.取一定量的土壤样本，将其加入到含有特定培养基的培养皿中，如TSA、PCA或NA培养基等；2.将培养皿置于适宜的温度下(通常为30℃)，培养一定时间(一般为24~72小时)；3.统计培养皿上出现的菌落数；4.根据不同培养基的菌落特点来进行分类鉴定。
如直径、颜色、质地、形态等；5.计算细菌数量。
此方法的优点是可以准确地测定土壤中特定细菌种群的数目，并且操作简便。
但缺点是需要培养时间长、部分细菌难于培养、还有会产生空心菌落、部分共生细菌会在菌落中互相竞争等。
直接计数法直接计数法是通过使用显微镜对土壤样本中的细菌数量进行计数的方式来测定土壤中细菌总数的方法。
其操作步骤如下：1.取一定量的土壤样本，将其在缓冲盐水中适当稀释；2.取一部分稀释后的样本，在显微镜下观察，并开始计数；3.根据计数结果，计算细菌在原土壤样品中的数量。
此方法的优点是测定速度快，一般只需要数分钟就可以得出结果，并且操作简单，适合于快速测量。
但缺点是对于不同形态的细菌很难区分，不能确定某些细菌是否存活，容易发生误差。
无论使用什么方法，测定土壤中细菌的数量都是非常重要的。
在实验中，根据具体研究需要选择合适的方法，保证实验可重复性。
以上，就是土壤中细菌总数的测定方法的简单介绍。
土壤微生物数量的测定方法
土壤微生物数量的测定方法土壤微生物数量的测定方法是指用来确定土壤中微生物的数量的一系列方法。
微生物在土壤中的数量是影响土壤肥力、健康状态以及生物多样性的主要因素，所以对土壤微生物数量的测定十分重要。
目前，有几种常用的测定土壤微生物数量的方法，包括计数法、分子生物学方法和非分子生物学方法。
一、计数法计数法是目前最常用的测定土壤微生物数量的方法。
该方法通过对样本中的细胞进行数目和形态的观察，来获得关于微生物数量的信息，然后通过计算微生物数量来估计土壤微生物总数。
1. 总体计数法总体计数法是使用显微镜观察和计数样品中的微生物，把检测到的微生物总数乘以一定的系数，就可以估算出土壤中的总微生物数量。
该方法是实时性强，耗时少，易于操作，但是由于细胞大小不一，活性差异大，难以检测到的微生物会影响准确性，因此不能精确测定土壤中的微生物数量。
2. 半定量计数法半定量计数法是通过将土壤样品进行细胞悬液制备，然后用显微镜观察和计数，来估算土壤中的微生物总数。
该方法也是实时性强，耗时少，易于操作，但是由于细胞大小不一，活性差异大，难以检测到的微生物会影响准确性，因此也不能精确测定土壤中的微生物数量。
二、分子生物学方法分子生物学方法是指使用基于DNA或RNA的技术来测定土壤中的微生物数量的方法。
目前，常用的分子生物学方法有PCR方法、qPCR方法、FISH方法、DGGE方法和pyrosequencing方法。
1. PCR方法 PCR方法是使用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术来检测土壤中的微生物数量的方法。
PCR方法可以快速检测出土壤中的微生物，但它不能检测出细菌的种类。
2. qPCR方法 qPCR方法是使用定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）技术来检测土壤中的微生物数量的方法。
qPCR技术可以检测出微生物的种类，并且可以准确测定土壤中的微生物数量。
土壤生物菌数计算方法
土壤生物菌数计算方法
土壤生物菌数计算方法有两种，一种是基于菌落的形成，另一种是基于土壤样品的重量。
基于菌落形成的计算方法需要从最后的稀释液中取一定量的样品（例如毫升）涂布在平板上，观察形成的菌落数量。
然后，通过乘以一个适当的倍数来计算每毫升或每克土壤样品中的细菌数量。
具体来说，每克样品中的菌株数可以通过以下公式计算：每克样品中的菌株数= c × V × M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（毫升），M代表稀释倍数。
另一种方法是通过称重土壤样品来计算其中的细菌数量。
具体来说，将一定量的土壤样品（例如10克）放在已知容量的锥形瓶中，然后加入适量的无
菌水（例如90毫升）稀释。
从稀释液中取一定量（例如1毫升）涂布在平
板上，观察形成的菌落数量。
然后，通过乘以一个适当的倍数来计算每克土壤样品中的细菌数量。
具体来说，每克土壤样品中含有的菌体数可以通过以下公式计算：每克土壤样品中含有的菌体数 = 某稀释液中的菌落数× 10 × 稀释倍数× 100 ÷ 土样重量（克）。
需要注意的是，这两种方法都需要进行适当的实验设计和操作，以确保结果的准确性和可靠性。
同时，还需要对实验数据进行适当的统计分析，以得出可靠的结论。
土壤微生物量及土壤酶活性测定方法
土壤微生物量及土壤酶活性测定方法土壤中的微生物是维持土壤生态系统健康的重要组成部分，土壤酶活性则可以作为评价土壤肥力和生物活性的重要指标。
因此，在土壤微生物量和土壤酶活性测定方面的研究非常重要。
本文将介绍几种常用的土壤微生物量和土壤酶活性的测定方法。
一、土壤微生物量测定方法1.铺平法：将土壤样品铺平在玻璃板上，使用显微镜对土壤中的微生物进行直接观察和计数。
这种方法的优点是简单易行，但需要大量的时间和人力。
2.累积碳法：通过测定土壤中的有机碳含量来间接估算土壤微生物量。
有机碳水平与微生物量密切相关，所以可以通过测定土壤中的有机碳来推测微生物的数量和活性。
3.培养法：将土壤样品接种到适当的培养基上进行培养，然后通过菌落计数或直接计数来估算微生物的数量。
这种方法适用于数量较多的微生物，如细菌和真菌。
4.傅里叶变换红外光谱法（FTIR）：通过测量土壤样品的傅里叶变换红外光谱，分析土壤中的微生物量。
该方法具有快速、准确、非破坏性等优点。
1.浊液法：通过观察测定液中的混浊度来测定土壤中的脲酶、过氧化氢酶等氧化酶的活性。
这种方法简单易行，但对于不同种类的土壤酶效果不一样。
2.比色法：采用酶底物与酶催化产物之间的化学反应，通过测定反应产物的颜色来估算土壤酶活性。
比色法可以用于测定脱氢酶、脱氢酶、脱氧核苷酸酶等酶的活性。
3.荧光法：将有机物和荧光试剂一起加入土壤样品中，经过反应后，在荧光分析仪中测定产生的荧光强度来测定土壤酶的活性。
荧光法适用于测定蔗糖酶、酚氧化酶和脱氢酶等酶的活性。
4.比浊法：通过加入酶底物后，观察土壤样品的混浊度来测定土壤中酶的活性。
比浊法适用于黄酶、脱氢酶等酶的活性测定。
5.电导法：通过测定土壤样品溶液中的电导率变化来估算土壤中酶的活性。
电导法适用于磷酸酶和脱氢酶等酶的活性测定。
总结起来，土壤微生物量和土壤酶活性的测定方法多种多样，选择合适的方法需要考虑样品特性和实验条件等因素。
每种方法都有其优点和局限性，研究者应根据需要选取合适的方法进行测定。
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土壤微生物计数法土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。
土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。
1.1培养计数法1.1.1概要在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。
因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。
这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。
稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。
最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。
根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。
1.1.2稀释平板法一、试剂配制常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。
按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。
凝固后的培养基可加热溶解后使用。
二、仪器设备广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。
（1）土壤系列稀释液制备取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。
迅速用灭菌的移液管吸取10-1土壤稀释液10ml，放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中，塞上橡皮塞，混合均匀，此为10-2土壤稀释液。
再如此依次配制10-3、10-4、10-5和10-6系列土壤稀释液。
上述操作均在无菌条件下进行，以避免污染。
（2）平板制备和培养从两个稀释倍数的土壤稀释液中（细菌和放线菌通常用10-5和10-6土壤稀释液，真菌用10-2和10-3稀释液）吸取1.00ml（吸前摇匀），分别放入五套培养皿中（注意每变换一次浓度，须更换一支移液管）；再向培养皿内注入45～50℃的培养基10ml，立即混合均匀，静置凝固后，倒置放于培养箱中培养。
细菌和放线菌在28℃下培养7～10d，真菌在25℃下培养3～5d。
（3）镜检计数尽管使用不同的培养基，但细菌、放线菌和真菌都可能在同一个培养基上生长，所以必须用显微镜做进一步的观察。
明显有菌丝的一般是真菌，真菌的菌丝为丝状分枝，比较粗大；而放线菌菌丝呈放射状，比较细。
细菌有球状和杆状，有些细菌也形成细小的菌丝。
酵母菌的菌落与细菌的菌落很相似，但在显微镜下容易分辨。
酵母菌个体比较大，一般有圆形、椭圆形、卵形、柠檬形或黄瓜形，有些还有瘤状的芽。
在两级稀释度中，选细菌和放线菌的菌落数为30～200个、真菌菌落数为20～40个的培养皿各5个，取其平均值计算出每组的菌落数。
如果菌落很多，可将其分成2～4等份进行计数。
微生物生物量可以通过微生物细胞个体大小和密度计算得到。
（4）计算土壤微生物数量（cfu·g-1）=MD/W式中M为菌落平均数：D为稀释倍数；W为土壤烘干质量（g）。
1.1.3最大或然计数法（MPN）一、试剂配制培养基配制与稀释平板法基本相同，采用试管培养时，培养基中不需加琼脂。
试管（2㎝×18㎝），其他同稀释平板法。
三、操作步骤（1）土壤系列稀释液中制备按稀释平板法制备土壤系列稀释液，一般配制10-1～10-6的稀释液。
（2）接种和培养从上述土壤系列稀释液中各取1ml接种到平板培养基或试管液体培养基中，每个稀释度重复3～5次，同时设置空白对照，以检验是否被污染。
因微生物类型和生长速度不同，所要求的稀释倍数、培养基和培养时间都有差别(表1-1)。
根据微生物类型分别在28～30℃培养7～30d。
培养结束时，记录出现菌落的平板数量或出现特征反应的试管数。
表1-1 几种主要土壤微生物生理群MPN计数方法（3）计算通常将有微生物生长的最后3个稀释度中出现微生物菌落的平板数作为微生物生长指标，从最大或然数表中查出最大或然数近似值，按下列公式计算样品中的微生物数量：土壤微生物数量（cfu·g-1）=MD/W式中M为最大或然数近似值；D为全部出现菌落的最高稀释倍数；W为土壤烘干质量（g）。
例如，某土壤系列稀释液1ml接种到5个平板，经培养后，10-3～10-5的稀释液全部出现菌落；接种10-6稀释液的5个平板只有4个出现菌落；接种10-7稀释液的只有1个出现菌落；接种10-8稀释液的全部没有菌落。
由此得到土壤的微生物生长指标为541，查最大或然数表（见附录三，表三）得到其最大或然数近似值为17，乘以第一位数的稀释倍数105，再除以土壤烘干质量即可得到土壤微生物数量。
微生物生长的数量指标都应当是三位数。
但是不管重复数多少，第一位数字如重复数相等，即代表全部重复都出现菌落的最高稀释倍数的数值。
后两位数字依次是以下两个稀释度出现菌落的平板数量。
如果以下稀释液还出现了微生物菌落，则将其出现微生物菌落的重复数加到第三位数上。
例如，10-3～10-8系列稀释液（4个重复）出现菌落的平板数分别为4，4，3，2，1和0.这里10-7稀释液出现菌落的平板数为1，将其加到前一稀释液（10-6）的平板数上，即得该土壤的微生物生长指标为433，查表得最大或然数近似值为30，计算得到每克土壤（新鲜重）的微生物数量为3.0×105。
应注意：如果出现微生物生长的稀释度比没有出现微生物生长的稀释倍数低，则说明微生物在稀释液中不是均匀分布的，在这种情况下就需要对实验方案进行核查。
1.1.4方法评论最初研究土壤微生物的方法是培养计数法，该方法的优点在于可测定土壤中可培养的、不同类型的微生物数量，包括细菌、真菌和放线菌，特别是可用于测定可培养的、具有特殊功能的微生物种群，如氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、解磷菌和固氮菌等。
该方法存在的问题是，仅能测定在培养基上迅速生长繁殖，并能够形成菌落或有某种特征的土壤微生物种群，而大部分土壤微生物种群不能在培养基上生长。
另外，在培养基上所形成的菌落可能来自多个细胞，也有可能由菌丝（或多个细胞）发育成菌落。
因此，培养计数法所测定的微生物数量，通常不到土壤中微生物实际数量的1%，故不能作为土壤微生物的真实数量。
此外，该方法即使用于测定土壤中可培养的微生物数量，测定结果的精确度和重复性较差。
1.2直接镜检计数法1.2.1概要由于土壤微生物的特性和培养基的局限性，通过在培养基上生长的菌落数量来间接地计算土壤微生物数量，一般只能测量出土壤中很少的一部分微生物。
因此，一些研究者提出了直接镜检计数法，主要包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法。
使用一般的染色剂进行涂片染色，镜检时很难区别死的微生物细胞和土壤颗粒，这里仅介绍FDA染色涂片测定活菌丝数和FITC染色测定活细菌数的方法。
涂片法的基本原理：将一定量的土壤悬浮液涂抹在载玻片上，风干染色后进行镜检计数，从而计算出单位质量土壤的微生物数量。
由于使用特别的染色剂可着色活细胞，从而可测定土壤活体微生物数量。
琼脂薄片法的基本原理：在制备土壤悬浮液时加入一定量琼脂，在进行土壤分散的同时进行加热，取一定量的土壤-琼脂悬浮液制成琼脂薄片，染色后进行镜检计数，再计算出单位质量土壤的微生物数量。
膜过滤的基本原理：将土壤悬浮液用无菌水稀释，取一定量的稀释液染色后，用微孔膜过滤，对微孔膜上的微生物进行镜检计数，再计算出单位质量土壤的微生物数量。
1.2.2 FDA染色涂片法测定活菌丝数一、试剂配制磷酸盐缓冲液（0.06mol·L-1）：8.28 g 溶于1L去离子水，10.68g 溶于1L去离子水；将两种溶液按28﹕72的比例混合，调节pH值使其与土壤pH值大致相同。
FDA染色液：见附录二。
琼脂溶液（1.5%）：1.5g琼脂溶于100ml磷酸盐缓冲液中（pH7.6）。
二、仪器设备三角瓶（200ml），试管（15ml），振荡机，载玻片（图1-1），盖玻片，荧光显微镜等。
图1-1 染色-镜检法涂片外圆面积1cm2，半径5.64㎜，内圆半径3.64㎜，镜检必须在外圆边缘约1.7㎜以内的区域进行三、操作步骤（1）土壤分散取10.00g新鲜土壤（＜2㎜）于200ml三角瓶中，加入95 ml 0.06 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液，充分振荡15 min。
（2）染色取1 ml 土壤悬浮液于15 ml的试管中，加入4 ml 磷酸盐缓冲溶液，再加入1 ml FDA染色液。
室温下培养3 min 后，加入1 ml 琼脂溶液，混匀。
（3）涂片和镜检取0.1 ml 上述土壤-染色液-琼脂混合液均匀地涂于如图1-1所求的载玻片上，盖上盖玻片，迅速用荧光显微镜进行镜检计数。
镜检计数方法见下文的琼脂薄片法。
（4）计算土壤活菌丝的生物体积及生物量碳计算方法同琼脂薄片法。
1.2.3 FITC染色涂片法测定活细菌数一、试剂配制Tris-盐酸溶液I ：6.35 g 三羟基氨基甲烷溶于800 ml 去离子水，用浓盐酸调节pH值至7.5，定溶至1 L。
Tris-盐酸溶液II ：25.4 g 三羟基氨基甲烷溶于800 ml 去离子水，用浓盐酸调节pH值至7.5，定溶至1 L。
INT溶液：2 g 氯化2-（p-碘苯基-3-p-硝基苯）-5-苯四氮唑溶于1 L Tris-盐酸溶液II中。
NADH-NADPH混合溶液：0.4 g NADH和0.4 g NADPH溶于100 ml Tris-盐酸溶液II中。
FITC染色液：见附录二。
碳酸盐-重碳酸盐缓冲液（0.5 mol·L-1）：42 g 溶于1 L去离子水；53 g 溶于1 L 去离子水。
吸取80 ml 和100 ml 溶液混合，加去离子水500 ml并调节pH值至9.6，定容至1 L。
焦磷酸钠溶液（5%，）：8.39 g 焦磷酸钠（）溶于100 ml去离子水。
碳酸钠溶液：10.6 g 碳酸钠溶于100 ml去离子水。
甘油溶液：量取45 ml 甘油于5 ml 1 mol·L-1碳酸钠溶液中，摇匀。
磷酸盐缓冲液（0.01 mol·L-1,pH 7.2）：1.38 g 溶于1 L去离子水中，1.78 g 溶于1 L去离子水，将两种溶液按28﹕72的比例混合。