二氧化硅生物荧光纳米颗粒的制备与应用

第33卷第4期湖南农业大学学报(自然科学版) Vol.33 No.4 2007年8月Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Aug．2007 文章编号：1007-1032(2007)04-0496-04

二氧化硅生物荧光纳米颗粒的制备与应用

谢文刚a，b

(湖南农业大学a.理学院；b.东方科技学院，湖南长沙 410128)

摘要：以荧光染料(联吡啶钌配合物)为核，二氧化硅为外壳制备了荧光纳米颗粒．电镜检测结果显示，合成的二氧化硅纳米颗粒粒径为(20±3) nm，分布均匀，形态规则．对荧光纳米颗粒进行生物修饰得到荧光探针，以DNA碱基配对原则为基础建立检测DNA的方法，利用激光扫描共聚焦显微镜研究玻片上的荧光信号和荧光强度．结果表明，该方法不仅可定量检测到4.4×10－8 mol/L的目标DNA3，而且可定性检测目标DNA3、单碱基错配DNA4及随机序列DNA5，为发展DNA检测技术提供了新的思路．

关键词：荧光纳米颗粒；核酸探针；DNA检测

中图分类号： O644 文献标识码：A

Synthesis and application of silicon dioxide biological fluorescent nanoparticles

XIE Wen-gang a，b

(a. College of Sciences；b. College of Orient Science Technology，HNAU，Changsha 410128，China)

Abstract：The Fluorescence-doped silicon nanoparticles were synthesized in a microemulsion system of triton-100 /cyclohexane/ ammonia hydroxide and characterized by techniques of electron microscopy.Nanoparticles were modified with biotin-DNA1 in order to obtain fluorescence probe．A method to monitor target DNA3 was set up on the basis of princile of DNA base complementary. Fluorescence signals were monitored by laser-scanning confocal microscopy for the detection of surface-bound fluorescent nanoparticles．The results showed that target DNA3 of 4.4×10－8 mol/L can be monitored by this method，which can also identify target DNA3 and single base unmatched DNA4 and random DNA5 effectively．The method potentially serves as a useful platform in a number of biomedical applications where accurate and sensitive gene analysis is critical．

Key words：biological fluorescent nanoparticles；nucleic acid probe；DNA detect

生命体内痕量活性物质的分析与检测对获取生命过程中的化学与生物信息、了解生物分子及其结构与功能的关系、阐释生命活动的机理以及疾病的诊断都具有重要意义[1-3]．生物荧光纳米颗粒的成功研制为在复杂的环境中进行最佳的单分子研究提供了条件．生物荧光纳米颗粒的粒径为1～100 nm，具有巨大的比表面、尺寸量子效应和化学反应活性，使其与生物体有特殊的相互作用，并得到了广泛应用，如可实现对SmIgG+ B淋巴细胞、HepG 肝癌细胞、WA系统性红斑狼疮疾病细胞和白血病特征细胞等的识别[4-5]．但生物荧光纳米颗粒在DNA检测方面的应用鲜有报道[6]．为此，笔者利用微乳液法制备二氧化硅纳米颗粒，并对其进行生物修饰，以DNA-DNA的特异识别与结合作用为基础，以三明治结构为模型(勿需对检测对象进行标记) ，研究了生物荧光纳米颗粒在DNA检测中的应用，旨在为发展新型DNA检测技术提供依据．

1 材料与方法

1.1 试验材料

联吡啶钌配合物([Ru(II)(bpy)3]2+.6H2O，Fluka 公司)，链霉亲和素(美国Sigma公司)，DNA片段(上海生工生物试剂有限公司合成)．所用DNA的序列如下：

收稿日期：2007-01-10

基金项目：湖南农业大学基础科学基金(62020206002)作者简介：谢文刚(1966-)，男，湖南吉首人，硕士，副教授，主要从事生物无机化学方面的研究.

第33卷第4期谢文刚二氧化硅生物荧光纳米颗粒的制备与应用497

DNA1：5′-TTATAACTATTCCTA(A10)-biotin-3′(修饰探针)；

DNA2：5′-biotin-A10CTCCCTAATAACAAT-3′(固定探针)；

DNA3：5′-TAGGAATAGTTATAAATTGTTATT AGGGAG-3′(检测目标)；

DNA4：5′-TAGGAATAGTTTTAAATTGTTATT AGGGAG-3′ (单碱基错配)；

DNA5 5′GTAATGAGTGAAAGGTATTTGTAG TTGAAT-3′ (随机序列)．

溴化氰根据文献[7]合成，其他试剂均为国产分析纯．试验用水均为二次蒸馏水．

主要仪器：日立F-2500型荧光分光光度计(激发波长290 nm，发射波长340 nm)；19HW-1型恒温磁力搅拌器；激光共聚焦显微镜FV500+IX70(日本)；高速冷冻离心机CR22G(日本)．

1.2 方 法

1.2.1 荧光纳米颗粒的合成[8]

环己烷、正己醇、表面活性剂triton-100按4∶1∶1的比例混合，加入二次蒸馏水，搅拌至清，分别加入联吡啶钌配合物溶液、正硅酸乙酯(TEOS)、氨水，持续搅拌24 h，反应结束后用丙酮、二次蒸馏水洗涤，12 000 r/min离心分离，制得荧光纳米颗粒，保存备用．

1.2.2 生物荧光纳米颗粒对DNA的检测

检测原理如图1所示．以荧光纳米颗粒标记寡核苷酸片段DNA1为检测探针，与目标DNA3和固定探针DNA2进行夹心式杂交，形成三明治结构复合

图1 DNA的检测原理

Fig.1 Schematic representation of the analytical protocol 体，用链酶亲和素化的玻片对复合体进行捕获，洗涤，用激光共聚焦显微镜检测玻片上的荧光纳米颗粒的荧光信号，并用软件(Fluoview tiempo time course software ver5)分析荧光强度，从而实现对目标DNA3的检测．

1.2.3 荧光探针的制备

把荧光纳米颗粒加入到碳酸钠溶液中，超声分散，加入溴化氰/乙腈溶液，室温下搅拌，再分别用冰水和PBS(磷酸缓冲液，pH=7.4)溶液洗涤，颗粒置于PBS溶液中保存．

向链霉亲和素溶液中加入已活化的荧光纳米颗粒，在4 ℃下搅拌24 h，用1 mol/L甘氨酸溶液封闭，离心、洗涤．向颗粒中加入生物素化的寡聚核苷酸(biotin-DNA1)(图1-a，b)，常温下反应2 h，用PBS溶液洗去多余的生物素化DNA1溶液，荧光颗粒于4 ℃保存备用．

1.2.4 链酶亲和素化玻片的制备

在醛基化的玻片上滴加0.5 mg/mL的链酶亲和素PBS(pH=7.4)溶液，4 ℃反应24 h，用1 mol/L甘氨酸封闭、洗涤，备用．

1.2.5 DNA的杂交

在10 µL杂交缓冲液(5×SSC(柠檬酸钠)，20 mmol/L NaCl，0.2%SDS(十二烷基硫酸钠) )中加入10 µL固定探针DNA2溶液，10 µL荧光探针溶液和10 µL不同浓度的目标DNA3溶液，以PBS为对照，在55 ℃杂交30 min(图1-c，d)．以单碱基错配的DNA4溶液、随机序列的DNA5溶液代替目标DNA3溶液，考察该方法的选择性．

1.2.6 杂交复合体的捕获

杂交后的溶液滴加在链霉亲和素化的玻片上(图1-e)，每一个浓度的DNA溶液点3个样，玻片置于55 ℃水浴锅中培育，再分别用2×SSC(含0.2%SDS)，70%甲酰胺(含30 mmol/L NaCl)，1×SSC (含0.1%SDS)，0.05×SSC洗涤，晾干．

2 结果与分析

2.1 荧光纳米颗粒的表征

由图2可知，荧光纳米颗粒的粒径为(20±3) nm，表面光滑圆润，且纳米粒子分布均匀．