常用柱色谱分离技术2010

FCC特点
• 快速柱层析（FCC）可克服普通柱分离的缺 陷，它具有快速省时、分离效率高、简单易 行的优点，所以国内外实验室基本都倾向于 用此法。 • 对于0.01-10g的样品，Rf值>0.15。 • 该法首先由still于1978年详细介绍，1981年获 专利保护。
一、层析条件 1、 吸 附 剂 硅 胶 ： 选 用 60 埃 ， 粒 度 为 40-63um
总之：溶剂极性不能比洗脱剂极性太大，否则将 影响层析行为和分离效果或分不开。 • 极性小的溶剂一般指在溶剂极性顺序中,极性小 于二氯甲烷的溶剂; 另外溶剂量不能太多，以近 饱和为宜。
3．被分离混合物样品为难溶性固体 a.可选择极性大的溶剂溶解。如氯仿，丙酮，乙 醇 ， 甲 醇 ， 四 氢 呋 喃 ， 吡 啶 ， 免 用 DMSO, DMF沸点较高溶剂。 b.再加入适量的硅胶于溶剂中（一份样品 + 约5 份柱填料），用旋转蒸发仪减压蒸去溶剂至干， 让样品均匀地涂布在固定相表面上，然后通过
（1）化合物谱带的最前面的边缘或称 前沿应是水平的，或者说应是垂于柱 的长轴的。 • 如果填充料填充不水平，或柱子末被 夹持在两个平面中(即前—后，左—右 两个平面)完全垂直的位置，第二条谱 带的最前面的边缘在第一条谱带洗脱 完毕之前就将开始洗脱出来了．那么 想分离每一组分是不可能的。
（2）若吸附剂表面有任何不平整性，或在填充 料中有任何不平整性或有空气泡时；谱带前沿
（二）．样品的制备与上样
1．被分离混合物为液体 • 将其中极性溶剂尽可能的用旋转蒸发仪去除后， 加入少许流动相稀释。 • 待将吸附剂上面的多余洗脱剂放出，直到柱内液体表面降至 石英砂表面时，停止放出洗脱剂。 • 将样品用滴管或漏斗沿柱子内壁直接加入柱中。 • 样品稀释要尽可能用少的洗脱剂，然后用最少量洗脱剂洗涤 器皿与层析柱内壁，洗涤完毕，开放活塞，使液体渐渐放出， 液面降至石英砂下端时，再加入流动相洗脱。
(1) 干法装柱
在柱子上端放一漏斗，直接加入硅胶. 轻轻 敲打层析柱，或上下震动层析柱，使填装均匀， 再加一层石英砂，然后加入洗脱剂，使硅胶润 湿（溶剂化）。必要时加压或减压以除去气泡， 加速溶剂化速度。
(2) 湿法装柱
将吸附剂硅胶与一定量溶剂调成悬浆状，快速倒入 柱管中，打开活塞，使溶剂慢慢流出，吸附剂慢慢 下降而均匀沉入色谱柱底。 • 吸附剂填料完毕,一般再覆盖0.5cm厚的石英砂。
*以硅胶和氧化铝等为吸附剂的吸附柱色谱
一．常压柱色谱
（一）色谱柱 • 色谱柱的大小，取决于被分离样品的量和吸附 剂的性质，要根据实际应用而定
1．玻璃色谱柱 2．装柱 干法/湿法装柱
无论干法或湿法装柱都要均匀，不能干柱
*所用吸附固定相一般为硅胶，氧化铝，粒度要求 100-160目或160目以上。 *吸附剂粒度越小，分离度越大，但洗脱速度越慢。 *Rf值相差较大时，应用硅胶100-160目，可上样 30mg/g硅胶，更多的情况下硅胶量为10mg/g硅 胶（即分离1g 样品需要100g 硅胶）。 *应用氧化铝时，粒度要求100－150目，分离1g样 品需要20－50g氧化铝。
3、干法/湿法装柱 4、上样、洗脱与收集
• 40-63um硅胶为吸附剂时，柱的大小、硅较用量、 加样量、每次收集的体积见表
5、压力泵 • 一般要求0.4-0.3Kg/cm2 即可。 约2bar/30psi • 可通过控制流速来实现。与层析柱上端 相接的塞子是一个压力控制伐，可调节 压力而调节流速 如图所示。
柱色谱法
柱色谱分离技术分类 层析柱的制备 样品的制备与上样
洗脱与分离 注意问题
柱色谱分离技术
• 柱色谱分离与薄层色谱类似，是靠洗脱剂把分 离的各组分逐个洗脱下来的过程，故也称洗脱 色谱。 • 由于色谱柱填充的吸附剂的量远远大于薄层板， 因而柱色谱可用于分离量比较大（克数量级） 的物质。所以作为较大量样品的制备分离，柱 色谱优于薄层色谱。 • 在柱色谱分离过程中,一般利用薄层色谱摸索柱 色谱的分离条件; 利用薄层色谱鉴定、分析和 分段收集洗脱出的洗脱液中的成分。
的一部分就从谱带的主体部分向前伸出，此时
发生的现象称为流动或称沟流。 于是正在往 前推进的前沿的一部分就利用这种沟流越过其
它部分而超前了，使分离变得困难。两种沟流
现象见图示
干柱色谱法
Dry Column Chromatography
• 始于60年代中期，是指用填充剂干装成柱， 然后进行层析分离的一种方法。 • 分离条件可用薄层层析探索，并直接用于干柱 层析。实际上是制备薄层的一种改进。即由薄层 板改为柱状，采用塑料薄膜或玻璃柱。 • 将吸附剂填充到塑料薄膜柱中，把欲分离混合物 置于柱子顶端，加展开剂展开，当展开剂到达柱 底部时即完成分离。用小刀沿着分离部位将柱子 切开或将吸附剂推出，从分段的吸附剂中用溶剂 提取所需的化合物。 • 该方法没有洗脱液从色谱柱流出，色带明显分开。 干柱色谱法所需时间短（大约15-30min）, 消耗溶剂少。
(230-400目)。过大、过小都会使分离度减少。 • 在给定的标准条件下，常用硅胶（70－230 mesh, or 63-200um） 表 现 出 最差的 分 辨 率， 而 硅 胶 （40－63um 230-400mesh）的固定相可得到最 好的分辨率。
2、流动相
A、通常以TLC层析条件为依据，对被分离成分 ， 要求Rf值在0.35左右 B、选择在TLC板上对混合成分有良好的分离。 要求△Rf>0.15 △Rf值>=0.1时，上样量小时也 能分离。 C、流速：由实验证实，使用硅胶60 （40－ 63um）作为固定相，流速为5cm/min时，可得 到最好的分辨率
2．被分离混合物样品为极性较小的固体 • 尽可能使其溶于流动相后上柱。但应注意，样品 在流动相中的溶解度一般较小。如果样品体积太 大，分辨能力就会降低。另一方面，如果样品浓 度过浓，就可能在柱顶部形成沉淀。
• 可选择极性较小的溶剂溶解后上柱. 可选用的溶 剂: CH2Cl2, CCl4, 甲苯，环己烷，石油醚。
三、实验示例
• 对于光学异构体1和2的分离，选择5％的乙酸 乙酯/石油醚为洗脱剂，Rf值分别为0.35和0.24， △ Rf ＝ 0.11， 1g的 1与 2的混合物， 用直径的 40mm层析柱，65ml为一个流分，在7分钟内， 可迅速分离。洗脱剂总体积为500ml.
Bu3Sn 1
Bu OH
Bu3Sn 2
3．洗脱液收集 洗脱液采用等份法收集，例如5， 10，20，30或50ml为一份。根据分离样品多寡 而定。用小试管或小三角烧瓶收集。
4．控制洗脱液流出速度。不能太快，太快柱中 交换来不及平衡，从而影响分离效果。一般以 1-2滴/秒为宜。 5．洗脱液TLC检测与合并。将每一个小接收瓶 按编号点样展开，将Rf值相同者合并，浓缩-蒸 干，最后进一步纯化（蒸馏或重结晶等）。
漏斗装于柱子上端。
旋转蒸发时，一定要加防爆球，以防样品硅胶 爆沸。
（三）．洗脱与分离
1．洗脱剂的选择应以TLC检测为依据。
• 被分离物质的最佳 Rf值应在0.2-0.5 内 。
• 被分离的2个点之间△Rf值应尽可能的大，越 大越好。否则分离效果差或难以分离。
2．洗脱剂应不断加入，保持一定高度。
或加一储液瓶，以免流干。
OH Bu
低压液相色谱（LPLC ) ――液相层析预制柱法
• 本法是用直径、高度不同的玻璃柱，二端制成螺纹接口。 内装粒度较小填充剂，配成一定机械附件，用含氟塑料细 管相连，使操作半自动化。 • 它不需要HPLC那样的高精密度输液泵(< 5bar/75psi )，却 具有HPLC的某些优点，层析柱可反复应用，可根据被分 离物的不同，制备不同规格层析柱，包括反相层析的填料， 分离效果高于一般的柱层析。
快速柱层析 （FCC法） （Flash Column Chromatography ）
• 应用普通柱分离法解决了所制备化合物不能用 重结晶、分馏、蒸馏等方法分离纯化的问题。 • 然而传统的柱分离往往是非常耗时，当样品 >1g or 2g，一天、两天、一星期是经常的。同 时伴随着时间增长， ①造成拖尾现象而收率降低； ②敏感的化合物易分解。
• 上样量高于HPLC，无须特别设备，实用省时，易于普及 等优点。Lobar柱可分离g数量级样品，其分辨效果有时 可接近HPLC分辨率。
Lobar 色谱柱中装有不同的 固定相，可反复使用，色谱 柱固定相的粒度较大，因此 在低压下，流动相可保持较 高流速。
• 除了自制的色谱柱外，使用最广泛的制备型低压液相色 谱系统是Lobar系列产品（MERK公司），其中包括多 种规格的预制柱（商品化）。
1．Hale Waihona Puke Baidu附剂
• 常用氧化铝或硅胶为吸附剂。 • 粒度大小影响分离度。太小流速减慢，则传质缓 慢，移动相线速度缓慢，引起纵向扩散，增加洗 脱时间。粒度太大，流动相来不及与吸附剂交换 平衡，影响分离效果。 • 一般干柱层析吸附剂粒度200～300目较好（硅 胶），干柱色谱样品与吸附剂比例1：300～1： 500（一般薄层色谱1：500）
加压液相柱色谱法
为加快柱分离的速度和/或增加分离度， 通常采用在柱前加压和柱后减压的方法进 行柱层析与分离。 —柱前加压法通常称为加压柱色谱 —柱后减压法通常称为减压柱色谱
根据制备型分离中所用压力的大小，可分为： 一、快速色谱 约2bar/30psi 二、低压液相色谱 <5bar/75psi 三、中压液相色谱 5-20bar/75-300psi 四、高压液相色谱 >20bar/300psi (1 bar ＝ 105Pa = 100kPa = 760mmHg) 低、中、高压液相色谱的压力范围之间会存在 一定交叉，只是为了区分方便，才如此划分。
柱色谱分离技术按色谱原理可分为： • 吸附柱色谱 • 分配柱色谱 • 离子交换柱色谱 • 分子排阻柱色谱 • 亲和柱色谱等
柱色谱分离原理
• 利用欲分离的混合物中各组分分配在固定 相和洗脱剂之间，被吸附、分配、交换的 性质不同，而相互得以分离。 • 化合物被吸附、分配、交换的这种作用越 强，该化合物溶解在洗脱剂中越少，沿洗 脱剂移动的距离则越小。反之，越多。
4 检查与分离：
A. 有色混合物的分离：可按色带用小刀将柱子切 开，将各段吸附剂分别放在索氏提取器中，溶 剂提取。 B．对无色化合物 （a）由于尼龙柱对UV不吸收，可观测到化合物 紫外下的色带。 （b）经UV照射，发出荧光，分别定位。 （c）采用硅胶GF254作吸附剂，紫外下观察化合 物的暗斑，分割后提取。 （d）按Rf值（TLC检测）逐段切开，洗脱后再用 TLC显色剂法鉴别。
实验室常用的柱色谱有：
• 以硅胶和氧化铝为吸附剂的吸附柱色谱； • 以硅胶、纤维素和聚酰胺为载体（支持剂，担 体），以其吸收较大量的液体作为固定相的分 配色谱（这里支持剂本身不起分离作用）。 • 以葡聚糖凝胶为固定相的分子排阻柱色谱； • 以离子交换树脂为固定相的离子交换柱色谱， • 以生物大分子亲和相为固定相的亲和色谱等。
五．注意问题
1．吸附剂表面加石英砂的目的是使加洗脱剂 时不至把吸附剂冲起，影响分离效果。若无 石英砂，也可用玻璃纤维。 2．层析法中最关键性的操作之一就是装柱 （向柱内充填吸附剂）操作。固体吸附剂如 硅胶、氧能铝等柱填充料，柱子在充填时必 须装得非常均匀，绝不可装得不整齐、出现 空气泡、存在隙缝等。
2. 装柱： 3. 上样与展开：
• 与一般柱层析一样。
• 将混合物溶于展开剂或低极性溶剂中; 或将样 品溶于溶剂中，加入5倍量的吸附剂，在旋转 蒸发仪上蒸干后。均匀地加载于柱子上端，上 面再覆盖少量石英砂。加入展开剂，使柱的顶 端保持有3－5厘米厚的液面。展开时展到柱 子底端即可，然后去除色谱柱支撑物－塑料柱 （尼龙）。
二、小结 快速柱色谱的条件与步骤：
（1）选用对欲分离成分在TLC板上有较好的分离效能的 洗脱剂，Rf值＝0.35；△Rf>0.15 （2）选择合适的层析柱，内装粒度40-63um（230-400 目）的硅胶。 （3）加入洗脱剂，在压力下快速将硅胶中空气排除。 （4）上样后，加洗脱剂洗脱，控制(压力)流速约 5cm/min