酶工程第四章PPT幻灯片

❖2）离子吸附 定义：酶蛋白在解离状态下因静电引力而固着 于带有与酶蛋白电荷相反的离子交换剂上的固定 化方法。 主要缺点：离子强度增加或者介质pH， 温度改 变时，离子吸附不稳定，酶与载体解离。
❖ 3）疏水吸附 N－烷基（疏水）琼脂糖 黄嘌呤氧化酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酯酶、脲酶（疏水 性强）。
五 固定化菌体或细胞的优缺点
优点
缺点
省去酶分离过程
细胞内蛋白酶对
辅因子再生及多酶反应
所需酶的分解
稳定性提高
副产物
细胞壁和膜阻碍底物
111111111111111和产物的渗透、扩散
1973年，日本在工业上成功固定化大肠 杆菌菌体，利用菌体中的天门冬氨酸酶， 连续催化反丁烯二酸为L-天门冬氨酸。
❖第一节 概述 ❖第二节 固定化方法 ❖第三节 固定化酶性质 ❖第四节 固定化酶反应动力学 ❖第五节 固定化酶的应用
第一节 概述
一 游离酶在应用中所存在的问题 1 酶在水溶液中参与反应，难以回收酶，导致 应用生产成本高，而且应用过程难于连续化； 此外酶蛋白残留给产物的分离纯化带来困难。 2 酶的稳定性一般较差，易受环境影响（物理 因素、化学因素、生物因素），活力下降甚至 失活。
1）物理吸附 定义：使用对蛋白质具有高度吸附能力的硅胶、 活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂， 将酶吸附到其表面上使酶固定化的方法。 优点：价廉，易操作易再生 缺点：易泄漏，易受污染
• 静止法
• 反应器上直接吸附法
• 混合浴或振荡浴吸附法 例：高岭士吸附胰凝乳蛋白酶;皂土吸附过氧化氢 酶,－淀粉酶; 纤维素粉吸附糖苷水解酶; 火棉胶吸附木瓜蛋白酶，碱性磷酸酶，酯酶，葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶。
❖ 4）亲和吸附 伴刀豆球蛋白A （利用此蛋白与糖蛋白的专一性结合）－ 琼脂糖吸附糖蛋白。 5）螯合吸附 利用酶蛋白上的金属离子与载体基团的螯合吸附。
❖2 包埋法
❖1）定义：将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透 膜微胶囊中的方法。 该方法不需要化学修饰，反应条件温和，适合 大多数酶，粗酶制剂，甚至完整的微生物细胞。
❖ 三．反应的最适pH 1 载体性质
载体（-）
微环境 吸引H＋，pH↓
载体（＋）
吸引OH-，pH↑
最适pH 偏高
偏低
2 产物性质
产物（酸性） 产物（碱性）
微环境 pH↓ pH↑
最适pH 偏高 偏低
❖ 四. 底物特异性 底物专一性：由于空间位阻效应，固定化酶对高分子量底 物的活性降低，对低分子量底物的反应速率变化不大。
❖2）根据载体材料和方法的不同，可分为格子 型包埋法和微胶囊法。
格子型包埋法 常用凝胶：聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，海藻酸钙凝胶， 角叉菜胶，明胶等。 为防止包埋固定化后酶从凝胶中泄漏出来，凝胶孔径应控 制在小于酶分子直径的范围内。因而对于大分子底物的进 入和大分子产物的扩散出去不利。
❖ 微胶囊法（半透膜包埋法） 定义：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的半透 性小球内，制成固定化酶。 小球直径一般只有几微米至几百微米，称为微胶囊。
第三节 固定化酶性质
一．稳定性 储存和操作过程中稳定性增强，主要表现在： 1热稳定性，2蛋白质水解酶的抗性，3变性剂的耐
受性，4保存期延长。
二．反应的最适温度 最适温度比天然酶高。 用CM-纤维素迭氮衍生物固定化的胰蛋白酶和糜 蛋白酶的最适温度比游离酶高5～15℃。 采用不同固定化材料，最适温度不同，如氨基酰 化酶，天然酶最适温度60℃，分别用DEAE-葡 聚糖凝胶、DEAE-纤维素固定化的酶 的最适温 度分别为72℃和67℃。
❖ 2 无机载体 ❖ 优势:高压稳定性 ❖ 硅载体:多孔玻璃;硅土 ❖ 矿物原料:粘土,斑脱土(火山
灰分解成的一种粘土)
❖3 无机合成载体 ❖ 优势:化学及机械稳定性高 ❖离子交换树脂
❖ 功能基团的共聚物
❖三 固定化方法
❖1 吸附法:通过弱的相互作用吸附到硅土,粘土,离 子交换树脂表面,如离子键,氢键,疏水作用力及静 电等.
第二节 固定化方法
一固定化方法： 吸附法， 共价结合法， 交联法， 包埋法
❖二 载体类型 ❖1 来自于自然的有机载体
❖ 优势:与酶有很好的相容性 ❖ 多糖类物质及其衍生物(多孔,亲水) ❖ 纤维素及其衍生物(DEAE,CM) ❖ 葡聚糖(Dextran) ❖ 琼脂糖(agarose) ❖ 淀粉(starch) ❖ 壳聚糖(chitosan) ❖ 蛋白质(明胶gelatin )
❖ 五．酶活力 ❖ 活力回收：固定化酶活力/溶液酶活力; ❖ 相对活力：固定化酶活力/溶液酶活力-残留酶活力
酶经固定化后大部分活力下降！
❖六 米氏常数Km
❖固定化酶的表观米氏常数Ｋｍ 随载体的带电性能 而变化。
第四节 固定化酶反应动力学
❖ 固定化酶催化系统是一种非均相的反应系统。以 微胶囊包埋法为例，反应过程包括:①底物从反应 液主体移向载体表面 (底物外部扩散);②从载体 表面移向酶、作用位点 (底物内部扩散);③底物 被催化生成产物;④产物从反应位点移向载体表面; ⑤产物再移至反应主体液。
❖3 共价法 定义：通过共价键将酶与载体结合的固定化 方法。 优点；稳定性好 缺点：反应条件激烈，操作复杂，控制条件 苛刻，相对酶活力较低。
❖ 4．交联法 定义：借助双功能或多功能试剂使酶分子之间发生交联作 用，制成网状结构的固定化酶的方法。
第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶 得到一种分子间交联的 固定化酶 双官能团能试剂：戊二醛，已二胺，顺丁烯二酸酐，双偶 氮氮苯 优点：结合牢固，可长时间使用 缺点：交联法单用时，所得到的固定化酶，颗粒小，机械 性能差，酶活性低。 常与吸附法或包埋法联合作用，制备出酶活性高，机械强 度又好的固定化酶或固定化菌体。
❖二．固定化酶概况 定义:凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用
的酶。源自文库
发现：1916年Nelson和Griffin，骨粉吸附转化酶
研究：1953年，Grubhofer和Schloith，重氮化树酯，羧 肽酶，淀粉酶，蛋白酶，核糖核酸酶
工业化：1969年千钿一郎，固定氨基酰化酶，D,L-氨
基酸 不溶于水——水不溶性酶，固相酶和固着酶 1971年，第一届国际酶工程会议，“固定化酶”名称