软骨细胞培养
实验方法
各种溶液的配制
1、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9
（1）称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4.H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g
（2）依次将各成分逐个溶解于800ml水中。
（3）用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。
（4）将酚红液（３）加入（２）中。
（5）补加水至1000ml，混匀。
（6）将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。
2、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml
（1）称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。（2）补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。
（3）冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。
（4）用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。
（5）分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。
3、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml
（1）称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。
（2）补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。
（3）用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
（4）分装小瓶，低温冰箱保存备用。
4、配制闪烁液
（1）用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。
（2）将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。
取材与培养
（1）取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。
（2）无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。
（3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。
（4）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。
（5）用加了青霉素及链霉素的Hanks液洗1次，以同样方法再离心一次。（6）过120目纱目，去除上清液。
（7）用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度至7.5X104。（8）将细胞悬液接种于24孔培养板（1ml）及96孔培养板（200μm）中，24孔板及96孔板各2板。
（9）置于37℃、5%CO2孵箱中培养48小时。
更换部分培养基
（1）用移液枪从24孔培养板中每孔吸出0.5ml旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
（2）同法从96孔培养板中每孔吸出100μl旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
加药
按照预前设计给培养孔中加A药（牛膝健步）及B药（鹿茸生长素），具体加药方法如下图。
具体加药情况
0.04%。
测定
测II胶原的合成
关节软骨细胞DNA的合成用3H TdR的掺入量来检测。
3号板加药后48小时加同位素3H TdR及3H脯氨酸
（1）用1ml注射器抽取0.1ml 3H TdR （即0.1μci）(3H TdR及3H脯氨酸购买时浓度为1mci/ml)。
（2）加DMEM至0.5ml，将3H TdR配制成0.2 mci/ml浓度。
（3）同法配制相同数量的3H脯氨酸。
（4）根据试验前设计，按每孔5μl（即1μci）的量加入同位素。
（5）置于37℃、5%CO2孵箱中培育12小时。
测定同位素的量
固定3号板细胞，测定同位素的量
1、配置0.25%胰蛋白酶溶液
（1）用电子天平称取0.25g胰蛋酶，放入烧杯内。
（2）加入少量的D-Hanks液，充分搅拌，使其成糊状。
（3）再加入D-Hanks液至100ml，不停搅拌，直至完全溶解。
2、固定细胞
（1）用移液管将3号板（加药后48小时加同位素）各孔的培养液按顺序吸出并置入相应的试管内。
（1）往各孔内加入少量的0.25%胰蛋白酶溶液，并同时吹打细胞，使贴壁细胞消化脱落，消化不少于5分钟，形成细胞悬液，将细胞悬液再依次加入上面的相应试管内。
（2）将真空泵与玻璃纤维滤膜连接。
（3）用滴管依次将试管中的液体吸尽，滴加在玻璃纤维滤膜上，真空抽吸过滤。
（4）用注射器分别依次抽取2ml 5%三氯乙酸（细胞固定）、5ml蒸馏水（洗去多余的同位素）、1ml无水乙醇（细胞脱色），依次加至滤膜，使细胞固定在滤膜上。
（5）待真空泵将滤膜上的液体吸尽后，用镊子将滤膜取下，有序的置于托盘内。（7）同上述3号板方法，根据试验前设计往4号板各培养孔中加入5μl（1μci）3H TdR或3H脯氨酸，并置于37℃、5%CO
孵箱中培育12小时。
2
（8）同昨日方法固定4号板细胞。
（9）将固定3号板及4号板细胞的滤膜依次置入对应的装有闪烁液的小塑料瓶内，闪烁
液要覆盖滤膜。
3、用美国产BECKMAN LS6500 multi-purpose 液闪仪测定各孔细胞3H
TdR或3H脯氨酸的掺入值。
MTT法测细胞增殖
MTT染色
(1) 用电子天平称量MTT染料0.02g。
（2）用DMEM溶解并稀释至4ml，PH值测定7.2。
（3）用0.22μm滤膜过滤除菌。
（4）根据试验前设计，往1号板与2号板相应的培养孔内，按0.1ml/孔加入MTT 染色液。
（5）置于37℃、5%CO2孵箱中培育5小时。
（6）按二甲基甲酰胺：Triton-X100：水=3：1：2的比例配置42ml脱色液（用柠檬酸调节PH至5～6）。
（7）按每孔1ml将脱色液加至1号及2号培养板相应的培养孔中。
（8）置于37℃、5%CO2孵箱中培育3小时，期间间歇振荡十分钟，使结晶充分溶解。
（9）用移液枪在1号板与2号板各孔中抽吸0.2ml溶液按顺序加入96板培养孔中。
（10）选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值。
甲苯胺蓝染色及蛋白多糖的测定
甲苯胺蓝染色
1、试剂配制：甲苯胺蓝乙醇液（甲苯胺蓝0.2g溶于30%乙醇100ml中）。
2、根据试验前设计，将行甲苯胺蓝染色的培养孔中的培养液吸去。
3、用PBS漂洗二次。
4、用70%乙醇固定30分钟。
5、用甲苯胺蓝乙醇液染20分钟。
6、倒置显微镜下观察并照相。
由于35-硫同位素试剂至今未买到,故软骨细胞体外培养后蛋白多糖的测定用甲苯胺蓝染色法完成。软骨2-型胶原的合成用同位素标记的脯氨酸掺入量进行检测。
组织胺诱导软骨细胞凋亡及吖啶橙染色
1 根据预前设计，往培养孔中加入30μl组织胺，置于37℃、5%CO2孵箱中继续
培育24小时。
2 细胞离心，去上清后将细胞悬浮于50μlPBS中。
3 加入100μl吖啶橙染色液，混匀，置于冰中染色30分钟。
4 加入1。85ml细胞固定液，混匀。
5 倒置显微镜观察。
6 进行流式细胞仪分析。
试剂
DMEM培养基（Gibco）
胎牛血清（FBS）：五江制药厂
Ⅱ型胶原酶：Sigma，北京吉泰联科公司分装
0.3%Ⅱ型胶原酶：取100mg胶原酶加入33ml D-Hanks液，0.22μm滤膜过滤；DMEM培养液：90mlDMEM+10mlFBS+0.1ml青霉素+0.1ml链霉素
青霉素160万u加Hanks16ml，即10万u/ml
链霉素100万u加Hanks10ml，即10万u/ml
Trypsin（胰蛋白酶）：Gibco，邦定分装
0.25%Trypsin：0.125g Trypsin加入50ml D-Hanks液中
实验过程
2002年12月13日星期五
一、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9
1、称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4﹒H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，
酚红0.02g
2、依次将各成分逐个溶解于800ml水中。
3、用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。
4、将酚红液（３）加入（２）中。
5、补加水至1000ml，混匀。
6、将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃
冰箱保存备用。
二、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml
1、称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。
2、补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。
3、冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。
4、用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。
5、分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。
三、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml
1、称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。
2、补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。
3、用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
4、分装小瓶，低温冰箱保存备用。
四、取材
1、取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射
5ml空气致死。
2、无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并
用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。
3、吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化
30分钟,中途不时摇晃。
4、吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中
继续消化3小时。每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。
5、用加了青霉素及链霉素的Hanks液洗1次，以同样方法再离心一次。
6、过120目纱目，去除上清液。
7、用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度至7.5X104。
8、将细胞悬液接种于24孔培养板（1ml）及96孔培养板（200μm）中，24孔
板及96孔板各2板。
9、置于37℃、5%CO2孵箱中培养48小时。
2002年12月6日星期一
一、更换部分培养基
1、用移液枪从24孔培养板中每孔吸出0.5ml旧的培养基，更换同等数量新的培养
基。
2、同法从96孔培养板中每孔吸出100μl旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
二、加药：按照预前设计给培养孔中加A药（牛膝健步）及B药（鹿茸生长素），
具体加药方法如下图。
具体加药情况
0.04%。
2002年12月17日星期二
一、配制闪烁液
1、用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。
2、将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。
2002年12月18日星期三
一、3号板加药后48小时加同位素3H TdR及3H脯氨酸
1、用1ml注射器抽取0.1ml 3H TdR （即0.1μci）(3H TdR及3H脯氨酸购买时浓
度为1mci/ml)。
2、加DMEM至0.5ml，将3H TdR配制成0.2 mci/ml浓度。
3、同法配制相同数量的3H脯氨酸。
4、根据试验前设计，按每孔5μl（即1μci）的量加入同位素。
5、置于37℃、5%CO2孵箱中培育12小时。
2002年12月19日星期四
一、MTT染色
1、用电子天平称量MTT染料0.02g。
2、用DMEM溶解并稀释至4ml，PH值测定7.2。
3、用0.22μm滤膜过滤除菌。
4、根据试验前设计，往1号板与2号板相应的培养孔内，按0.1ml/孔加入MTT
染色液。
5、置于37℃、5%CO2孵箱中培育5小时。
6、按二甲基甲酰胺：Triton-X100：水=3：1：2的比例配置42ml脱色液（用柠
檬酸调节PH至5～6）。
7、按每孔1ml将脱色液加至1号及2号培养板相应的培养孔中。
8、置于37℃、5%CO2孵箱中培育3小时，期间间歇振荡十分钟，使结晶充分
溶解。
9、用移液枪在1号板与2号板各孔中抽吸0.2ml溶液按顺序加入96板培养孔中。
10、选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值。
二、固定3号板细胞，测定同位素的量
（一）配置0.25%胰蛋白酶溶液
1、用电子天平称取0.25g胰蛋酶，放入烧杯内。
2、加入少量的D-Hanks液，充分搅拌，使其成糊状。
3、再加入D-Hanks液至100ml，不停搅拌，直至完全溶解。
（二）固定细胞
1、用移液管将3号板（加药后48小时加同位素）各孔的培养液按顺序吸出并
置入相应的试管内。
2、往各孔内加入少量的0.25%胰蛋白酶溶液，并同时吹打细胞，使贴壁细胞消
化脱落，消化不少于5分钟，形成细胞悬液，将细胞悬液再依次加入上面的相应试管内。
3、将真空泵与玻璃纤维滤膜连接。
4、用滴管依次将试管中的液体吸尽，滴加在玻璃纤维滤膜上，真空抽吸过滤。
5、用注射器分别依次抽取2ml 5%三氯乙酸（细胞固定）、5ml蒸馏水（洗去多
余的同位素）、1ml无水乙醇（细胞脱色），依次加至滤膜，使细胞固定在滤膜上。
6、待真空泵将滤膜上的液体吸尽后，用镊子将滤膜取下，有序的置于托盘内。
三、同昨日3号板方法，根据试验前设计往4号板各培养孔中加入5μl（1μci）
3H TdR或3H脯氨酸，并置于37℃、5%CO
孵箱中培育12小时。
2
四、甲苯胺蓝染色
1、试剂配制：甲苯胺蓝乙醇液（甲苯胺蓝0.2g溶于30%乙醇100ml中）。
2、根据试验前设计，将行甲苯胺蓝染色的培养孔中的培养液吸去。
3、用PBS漂洗二次。
4、用70%乙醇固定30分钟。
4、用甲苯胺蓝乙醇液染20分钟。
5、倒置显微镜下观察并照相。
2002年12月20日星期五
一、同昨日方法固定4号板细胞。
二、将固定3号板及4号板细胞的滤膜依次置入对应的装有闪烁液的小塑料瓶
内，闪烁液要覆盖滤膜。
三、用美国产BECKMAN LS6500 multi-purpose 液闪仪测定各孔细胞3H
TdR或3H脯氨酸的掺入值。
[题名]人关节软骨细胞培养法的改良及其特有表型的检测
[外文题名]The modified chondrocyte culture method and inspection of cell's pheno type
[作者]宋卫东, 刘尚礼, 李卫平, 沈慧勇, 黄东生, 黄建荣
[单位]广东广州中山大学附属第二医院骨科 510120
[出处]中华实验外科杂志 2003V20N2 147-148
[资助]国家自然科学青年基金资助项目 (30100188)
[关键词]软骨细胞, 培养, 表型
[摘要]目的:探讨简便、易行的人关节软骨细胞体外培养方法。方法:以0.25%胰酶消化软骨块
0.5 h,0.30%胶原酶消化4 h后,将软骨细胞与小片软骨(0.2 mm^3|大小)共同置入预涂多聚赖氨
酸的培养瓶中培养;与传统方法对照,用倒置显微镜、免疫组织化学、电镜、逆转录-聚合酶链
反应(RT-PCR)等方法，检测经7次传代后软骨细胞表型改变相伴随的形态学及分子生物学特征
。结果:改良法培养的细胞活性率可达100%。经多次传代的软骨细胞仍保持原代软骨细胞的表
型特征,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,并可观察到软骨的特有的细胞-胶原
纤维几何构像。而传统法培养的软骨细胞在第7代特有表型出现改变。结论:本改良法是一种较
方便而且有效的培养法。
[参考文献]4
[题名]软骨细胞凋亡与骨关节炎
[作者]向川
[单位]湖北武汉华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科 430022
[出处]国外医学·免疫学分册 2003V26N2 110-封三
[关键词]软骨细胞, 凋亡, 骨关节炎
[摘要]骨关节炎(OA)是一种老年人常见的关节疾患,近年研究显示,软骨细胞过度凋亡可能在
OA的发病中产生了重要影响。在OA中,软骨细胞凋亡多通过NO途径和Fas途径发生,并且受IL-1
β、TNF-α、IL-8、bcl-2等因素的影响。阐明软骨细胞凋亡在OA的发病机制中的作用,将有助
于OA的防治。
[文献类型]综述
[参考文献]19
[题名]培养软骨同生长板的比较研究
[外文题名]Comparative Study on Cultured Cartilage and Growth Plate
[作者]王建, 杨志明, 秦廷武, 解慧琪
[单位]重庆第三军医大学新桥医院骨科 400037
[出处]中国矫形外科杂志 2003V11N1 41-44
[资助]国家基础研究发展规划项目单一细胞组织工程研究 (G1999054308)
[关键词]培养软骨, 生长板, 组织工程
[摘要]目的:探讨培养软骨用作生长板移植替代物的可行性。方法:自1月龄兔分离软骨细胞,
离心管培养2周形成软骨。切取6周龄兔胫骨生长板,与培养软骨进行组织学、胰岛素样生长因
子Ⅰ型受体α链(IGF-ⅠRa)免疫组织化学、^3|H-胸腺嘧啶脱氧核苷(^3|H-TdR)掺入率检测和
电镜观察。结果:培养软骨具有一定的骺软骨组织学结构,缺乏典型的生长板软骨细胞柱状排列
。培养软骨和生长板IGF-IRa免疫组织化学染色均为阳性。培养软骨^3|H-TdR 掺入率显著高于
生长板(P<0.01)。培养软骨中细胞外基质结构疏松,5%软骨细胞呈现凋亡。结论:培养软骨具有
一些与生长板相似的性质,可能成为生长板的移植替代物。
[参考文献]8
[题名]细胞因子对关节软骨细胞作用的研究
[外文题名]A Study of the Effects of Cytokines on Joint Chondrocyte
[作者]谈志龙, 邢国胜, 李德达, 王淑云, 于顺禄, 李士民, 张凯, 王毅
[单位]天津天津医院骨科研究所 300211
[出处]骨与关节损伤杂志 2003V18N5 316-318
[关键词]细胞因子, 关节软骨, 软骨细胞, 骨关节炎
[摘要]目的:观察白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β~1|(
TGF-β~1|)对关节软骨细胞的影响,探讨骨性关节炎的发病机理。方法:应用关节软骨细胞体外
培养,分别加入细胞因子,应用酶联免疫法(ELISA)测定基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和前列腺素E
~2|(PGE~2|)水平。结果:MMP-3测定结果,细胞因子作用于软骨细胞0-24h,1、10、20ng/ml IL
-1β组,10ng/ml TNF-α组,高于对照组(P<0.01);作用24-48h,1ng/ml IL-1β组,0.1、1、10n
g/mlTNF-α组,0.1、1、10ng/ml TGF-β~1|组低于对照组(P<0.01)。10ng/ml IL-1β
和1ng/m
l TGF-β~1|组低于10ng/ml IL-1β组(P<0.01)。PGE~2|测定结果,细胞因子作用于软骨细胞0
-24h,1、10ng/ml TNF-α组高于对照组(P<0.01),1ng/ml TNF-α和1ng/ml TGF-β~1|组低于1
ng/ml TNF-α组(P<0.01);作用24-48h,10、20ng/ml IL-1β组,0.1、1、10ng/ml TNF-α组高
于对照组(P<0.01)。10ng/ml IL-1β和1 ng/ml TGF-β~1|组低于10ng/ml IL-1β组(P<0.01)
,1ng/ml TNF-α和1ng/m l TGF-β~1|组低于1ng/ml TGF-α组(P<0.01)。结论:细胞因子对软
骨细胞分泌产生MMP-3、PGE~2|有较大影响,TGF-β~1|有明显拮抗IL-1β、TNF-α的作用。
[参考文献]7
HEK293FT细胞培养
293细胞培养 293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与https://www.360docs.net/doc/7015633586.html,ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。严禁过度生长，这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。 293细胞培养特性： 1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。 2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时90%以上细胞贴壁。293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。 3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。 4、复苏293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适。刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。 5、转染：体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落，最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。 其它的经验： 1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取 2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度， 3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 The final edition was revised on December 14th, 2020.
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
微重力磁悬浮三维细胞培养仪
三维微重力磁悬浮细胞培养系统 研究复杂的细胞和组织，及其信号传导与调控可不是件容易事。而模拟细胞或组织环境，建立最接近体内天然条件的实验系统同样困难。这就是3D细胞培养所面临的挑战，3D培养系统旨在更好的模拟细胞的体内生长环境，为其创造更天然的家。近来越来越多的证据表明，3D细胞培养系统比传统2D培养系统更贴近体内的生理条件。也许3D培养系统的最大价值在于，其更接近体内环境的系统能够有效的辅助药物研发。“3D细胞培养的主要优势在于，能够在研究早期的体外实验中模拟细胞在体内的行为，”。“传统2D细胞培养往往无法了解细胞在组织内的功能和应答反应，结果可能导致以2D细胞培养为基础的药物或生物学研究出现偏颇，并且也难以预测药物在体内的效果。而3D细胞培养可以为研究者们提供药物等更真实的早期信息，从而降低像市场推出新药的研究成本。众多的科研工作者一直在寻找简单方便最天然的3D细胞培养工具？？？？？？？？Micforce米力光国际CO.,LTD The Bio-Assembler? System The Bio-Assembler? system cultures cells in three-dimensions by magnetic levitation. The Bio-Assembler?uses nanoparticle-based Nanoshuttle-PL solution to deliver magnetic nanoparticles to cells. Magnetic drives then levitate cells to create the 3D cell growth environment. Using the Bio-Assembler? is as easy as performing standard monolayer (2D) culture. Preparation time and cell manipulation requirements are equivalent to 2D culture. Advantages of n3D’s 3-Dimensional Cell Culturing System: ?Rapid formation of 3D structures and cell-cell interactions ?More accurate representation of in vivo tissue ?Compatibility with virtually any cell type including primary and stem cells ?Compatibility with any media type, standard culturing protocols, and diagnostic techniques ?3D co-culturing capabilities ?Unique capability for moving and shaping tissue, applicable to invasion studies and tissue engineering As Simple as 2D There are only two simple additional steps that differentiate the Bio-Assembler? from 2D cell culturing:
体外细胞培养
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析完整版
人体外周血淋巴细胞培 养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
细胞培养基种类
细胞培养基的选择及常用数据库 日期：2012-04-13来源：未知作者：网友点击：次细胞实验技术 经典的培养基有很多种，Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。 ◆MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的，其中增加了组分的范围及 浓度。 ◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的，现在常用于 贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L，这就是大家常说的低糖和高糖了。 ◆ aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸，它可广泛应用于各种细 胞类型，包括对营养成分要求苛刻的细胞。 ◆ Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于 克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物，这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。 ◆ RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的，现在已广泛应用于悬浮细胞 的培养。 以前经常听到有人问，这种细胞该用哪一种培养基呢?其实这个问题的答案可以很简单，也可以好复杂。此话怎讲?如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库，那很简单，问供应商就行了。或者找到相关的文献，作为参考。Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具，也很好用。选择你感兴趣的细胞类型，它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等，有时还有优化好的转染步骤，很方便。Sigma网站上也有一个Media Expert，包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等，它还
细胞培养
1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。 2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。 3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。 4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。5．取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。 6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。7．打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。 8．将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。 9．取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。 10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。 11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。 12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。 13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。 293T细胞 培养条件： 37℃，5% CO2，PH值~，无菌恒温培养。 细胞相关操作： 细胞复苏 1. 37°C水浴预热培养基（DMEM+10% FBS）； 2. 从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3. 在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4. 弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀； 5. 置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。 细胞传代 1. 当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；
三维细胞培养技术在再生医学研究中的应用
三维细胞培养技术在再生医学研究中的 应用 摘要：体外细胞培养技术已成为细胞生物学、药学、毒理学、干细胞、系统生物学和新药创制等领域必不可少的工具。传统平板细胞培养方法使细胞单层生长于二维环境，不能产生体内的细胞外基质屏障。且细胞表型也异于原代细胞，而三维细胞培养技术通过模拟机体内细胞生长的生理微环境，利用各种支架或设备来促进细胞生长和组织分化，产生具有合理形态结构和功能性的组织，具有细胞培养直观性和条件可控性的优势，故其在再生医学应用方面有着非常大的发展潜力。本文从干细胞、血管再生、器官移植、以及组织修复等方面综述了近期三维细胞培养技术在再生医学研究中的应用，并介绍了三维细胞培养技术在功能性生物材料方面研究中的作用，有助于对功能性生物材料的表面改性设计研究。 关键词：三维细胞培养技术；再生医学；干细胞；血管再生；器官与组织修复 随着生物医学的发展．疾病的治疗方式已得到了极大改进。但组织器官严重损伤后修复缓慢，或由于创伤过大而致组织器官无法修复，使得再生医学成为当今生物医学的关注焦点和研究热点。体外建立适合细胞和组织生长的生理微环境对再生医学研究至关重要，而传统的单层平面培养的细胞无论是在形态，结构和功能方面都与在体内自然生长的细胞相去甚远．由于无基质支持，细胞仅能贴壁生长。从而失去其原有的形态特征及生长分化能力，而三维细胞培养技术以其能为细胞和组织创造一个均衡获取营养物质、进行气体交换和废物排出的理想生理场所。又易于形成具有合理形态和生理功能的组织器官等特点，广泛应用于再生医学的研究[ ]。目前，三维细胞培养方式发展迅速，包括皮氏培养瓶、灌注小室、搅拌式生物反应器、中空纤维生物反应器、以及微重力旋转生物反应器等培养方式。其中微重力旋转细胞培养技术因其特有的微重力环境，使细胞与细胞、细胞与载体的交联度、沉降力、机械力、压力等发生相互作用、相互制约，模拟了近似生物体内细胞的生长状态和微环境，在再生医学领域应用中备受关注.。除再生医学以外，三维细胞培养技术也常被应用于药物载体、药物毒理、药物筛选、肿瘤治疗等方面的研究 1 三维细胞培养技术在再生医学应用中的优势 三维细胞培养技术使用三维支架或设备细胞提供类似体内生长环境的支架或基质．建立细胞问及细胞与胞外基质问的联系．促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动，形成一定的三维结构，既保留了体内细胞微环境的物质结构基础．又实现了细胞培养的直观性及条件可控制性，便于研究人体生理、病理状况，以及预防或疾病的治疗。三维细胞培养技术主要通过体内和体外两种方式。实现其在再生医学中的应用，两者皆采用从机体获得功能细胞。细胞体外扩增培养后，与三维结构的生物材料按一定比例混合。前者是直接植入体内
MRI对膝关节软骨损伤的诊断
MRI对膝关节软骨损伤的诊断一、介绍关节软骨属于透明软骨，表面光滑，呈淡蓝色，有光泽，厚度约1-5mm。关节镜检查只能看到形态，MRI是目前唯一日常性成像方式，已经发展成检查关节软骨主要的主要技术。二、关节软骨的组织结构关节软骨属于透明软骨，关节软骨根据细胞胶原介质分四层结构第一层是浅表层，也称为切线层。胶原纤维排列方向与关节面相互平行；第二层是附着层；胶原纤维成斜线排列；第三层是辐射层；胶原纤维排列方向与关节面相互垂直；第四层是钙化层；与骨性关节面紧密结合在一起。在辐射层和钙化层之间有一条线，称之为潮线，是关节软骨成熟的标志。 三、MRI对关节软骨的成像技术MRI对关节软骨的成像技术分为形态学成像技术和分子影像学成像技术。分子影像学成像技术涉及关节软骨的组织成分。分为软骨细胞、细胞外基质（包括电解液、5%蛋白多糖、20%胶原纤维等）。分子影像学从分子角度检测钠离子浓度变化、蛋白多糖变化以及蛋白多糖中糖原多糖变化情况，然后通过分子结构的改变来重建图像。从组织学上说，软骨损伤的因素包括外伤、配电以及其他非理化性因素等。软骨的损伤包括浅层、附着层、辐射层甚至钙化层的损伤。关节软骨无神经血管乃至淋巴，因此关节软骨受到创伤很难愈合。软骨损伤不是单一的疾病，还涉及邻近组织一些静态的改变，如韧带的损伤、组织下变化以及骨性关节炎的变化等。最终导致患者的功能障碍。核磁有很强的空间和密度
分辨率，能够早期探测出软骨的变化，进而做出适当的处理。因此核磁在软骨的探测方面，具有独到的优势。（一）形态学成像技术形态学成像技术，也是临床上常用的检测技术，可以清楚的显示关节软骨形态、大小以及厚度。能够提供准确的信息，对关节软骨的分度如局限性缺损、全层的缺损以及关节软骨修复术当中也起着很重要的作用。关节软骨从形态学上分类：0级：正常关节软骨。如右图A 1级：形态正常，信号略有增高。如右图 B 2级：关节软骨表层缺损，但未及关节软骨厚度的50%。如右图C 3级：关节软骨表层缺损，超过关节软骨厚度的50%但未达到100%。如右图D 4级：全层关节软骨的缺损。其中4级分为 1 累及关节软骨下骨质的缺损(如上图F)和未关节软骨下骨质(如上图E)两类形态学成像技术临床上常用的有T1WI、T2WI以及T2WI-fs。如上图。它们显示骨性结构，关节软骨和关节腔积液方面都具有各自的优势。 T1WI显示解剖细节有图特的优势。 T1WI下可以看见解剖结构序列、关节软骨以及软骨下的骨质、骨小梁以及骨髓分层的对比度都能很好地显示。因为关节积液在TI加权图像上显示低信号，关节软骨显示中等信号，低信号的关节积液和中等信号的关节软骨之间缺乏明显的对比，因此TI加权像对软骨表层浅层缺损的显示不敏感。但因为T1WI关节软骨和关节软骨下骨质对比明显，则T1WI显示关节软骨深层缺损比较敏感。 T2WI以及亚真像对关节积液和游离水的信号非常
人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理
实验原理 人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为 人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。 （2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。 （3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。 实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克 溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中 实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。实验材料 人的外周血淋巴细胞
转化医学论文——3D细胞培养技术
3D细胞培养技术的发展和应用 摘要：传统细胞培养技术在模拟细胞体内生存环境方面做得还不够。 3D细胞培养技术的发明就是为了在细胞培养过程中，为细胞 提供一个更加接近体内生存条件的微环境。本文阐述了何为 3D细胞培养技术，3D细胞培养技术的发展过程以及其最新科 学进展。主要描述3D细胞培养技术的基础理论发展到临床实 践应用的过程，让读者了解并知道什么是3D细胞培养技术以 及其临床实践应用，使3D细胞培养技术更能有效、普遍地应 用于临床治疗中去，造福处在疾病中的人们。 关键词：3D细胞培养技术 3D心脏组织人工器官 正文： 一、什么是3D细胞培养技术 体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境,该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。3D 细胞培养技术(TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成3D的细胞载体复合物。3D细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中,细胞外基质(ECM)蛋白充当生长支架,使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构,所创建的细胞生长环境,则最大程度地模拟体内环境。TDCC作为体外无细胞系统及单层细胞系统的研究与组织器官及整体研究的桥梁,显示了它既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础,又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。近几年3D细胞培养技术在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域得到了广泛的应用。 二、3D细胞培养技术的原理 利用磁性微球载体和磁悬浮技术使贴有细胞的微球载体悬浮在培养液中，确保了高质量、高密度的细胞繁殖，突破了传统有盖培养皿、培养瓶或微孔板细胞培养耗时繁琐，细胞产量微小等局限性。 三、3D细胞培养技术的临床应用 1、神经系统
分子克隆及细胞培养基本实验方法
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
3D细胞培养
3D多细胞肿瘤球的培养 原创2017-04-20医生科研助手 3D多细胞肿瘤球是在体外应用组织培养方法使肿瘤细胞以多细胞集聚体的形式生长成为具有三维结构的球体。 与传统的2D贴壁细胞培养模型相比，3D多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征。 因此，3D多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用于干细胞培养和分化、癌症研究、药物和毒性筛选及组织工程等特定应用中。 虽然3D多细胞肿瘤球模型具有更显著的实体肿瘤生理相关性，但是与2D贴壁细胞培养模型相比，获得大量相对统一的3D多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养过程和表征手段。 本文利用Liquid Overlay的制备方法，以乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7为模型制备3D多细胞肿瘤球并采用倒置显微镜、激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜对其进行详细表征。
1 实验前准备工作 1.提前24 h取12 mL DMEM和RPMI 1640完全培养基（含10%FBS，下同）于50 mL离心管内，置于4℃冰箱中预冷； 2. 将分装好的Matrigel基质胶提前24 h从-20℃放入4℃，使其融化成液体状态； 3. 将无菌的1 mL移液器枪头放入无菌50 mL离心管内，置-20℃冰箱预冷。 2 琼脂糖包被96孔板 1. 准确量取6 mL RPMI 1640培养基（或DMEM培养基）于2个10 mL的注射玻璃瓶内，加入90 mg琼脂糖，盖塞后放入80℃的水浴锅内加热溶解30 min； 2. 加热结束后，将注射瓶放入灭菌锅内，115℃灭菌30 min；
3. 灭菌完成后，迅速取出注射瓶放入超净台内。将注射瓶内的琼脂糖溶液倒入无菌的加样槽中，用多通道移液器以每孔60 μL的量加入96孔板内。 注意：由于琼脂糖溶液在室温时会凝固，因此从灭菌锅内取出琼脂糖溶液后一定要快速转移至超净台内并迅速加入至96孔板中。 此外，为保证加样时琼脂糖不冷却，需要同时灭菌加样槽和100 μL的移液器枪头。 4. 加入完成后，96孔板要保持水平约30 min使孔内的琼脂糖凝固。 3 配置含Matrigel基质胶细胞悬液 1. 取对数生长期的MDA-MB-231细胞（或MCF-7细胞），胰蛋白酶消化后进行细胞计数，用RPMI 1640完全培养基（或DMEM完全培养基）将细胞悬液浓度调整至 2.0×105cells/mL，备用。
小鼠胚胎干细胞培养体系的建立
第19卷第2期 江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997 α 小鼠胚胎干细胞培养体系的建立 汪河海1 刘红林2 范必勤1 钟 卉3 丁家桐4 (1 江苏农科院牧医所,南京 210014;2 南京农业大学动物科技学院,南京 210059;3 南京铁道医学院,南京 210009;4 扬州大学农学院动物科学系 225009) 摘 要 通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。 关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系 中图分类号:S865.1 胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。 1 材料和方法 111 动物准备 选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。 112 溶液的配制 按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。 113 胎儿成纤维细胞饲养层的制备 α
实验七+人体外周血淋巴细胞培养
实验五人的外周血淋巴细胞培养 一、实验原理 外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 二、实验目的 掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。 三、实验材料 人的外周血。 四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。 隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO， 1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。
从二维到三维细胞培养的变迁
从二维到三维细胞培养的 变迁 Newly compiled on November 23, 2020
细胞培养技术进展概述及分析 细胞培养一直是细胞生物学中基础且核心的部分。无论是进行细胞性状研究，还是进行细胞产物的研发，都需要以细胞体外扩增技术-即细胞培养技术为基础。随着生命科学的发展，细胞培养技术更是被广泛应用于生物学、、新药研发等多个领域，成为生命科学最重要的基础技术之一。 传统的细胞培养即细胞的平面培养，细胞在培养过程中只能沿平面延伸，属于细胞的二维培养技术。这种培养方式经济、便利、易操作，符合某个历史阶段对细胞培养技术的要求。但随着研究的深入，传统的二维培养技术已经不能满足细胞培养需求。盖因生物体内的细胞是在立体三维的微环境中生长的，二维培养微环境与体内微环境差异太大，影响细胞的基因表达、信号转导等，导致所培养的细胞逐渐丧失其在生物体内的生物学特性及功能，失去研究及应用价值。传统的二维培养技术，已经成为细胞学为基础的众多学科进步的壁垒之一。 科学家开始寻求更贴近自然状态的细胞培养技术。一种与活体组织内的细胞外基质相似的，能更好的模拟细胞在体内生长环境的培养技术，即细胞的三维培养技术。 目前已开发出很多细胞三维培养技术，大致可分为需要支架的三维培养技术和不需要支架的三维细胞培养技术。支架类主要是在三维空间内构建供细胞附着和生长的类似脚手架的多孔结构, 细胞依附于支架进行三维生长和迁移, 主要的支架材料有胶原和水凝胶等；而不需要支架的三维培养技术主要是通过物理方法使贴壁细胞悬浮于培养基中以达到三维培养的目的, 目前主要的技术有微载体、磁悬浮、悬滴板和磁性三维生物印刷等技术。
3D细胞培养和试验系统
简介 哺乳动物细胞培养作为一个无价的细胞生物学工具已有几十年。生长在扁平和僵硬的二维(2D)底物(如 聚苯乙烯或玻璃)上的单层贴壁细胞已成为传统细胞培养系统的中流砥柱。二维细胞培养的研究在扩宽 我们对发育生物学、组织形态发生、疾病机制、药物发现、大批量蛋白生产、组织工程和再生医学方 面的知识方面扮演了至关重要的角色。与此同时，随着2D培养系统而来的缺陷也显现了出来，尤其是 其不能模拟体内环境以提供生理相关的数据。 在体内，几乎所有组织的细胞都处在由一个复杂三维(3D)结构的细胞外基质(ECM)中，它们和相邻的 细胞通过生化和机械关系产生着相互作用1。细胞-细胞和细胞-细胞外基质间的相互作用构建成了一个 用于维持组织特异性和稳态的3D通讯网络2。细胞生命周期的关键事件通过受到周边细胞微环境的控 制3。2D培养试验中，细胞无法实现类似于体内的结构组织和连接，这使得细胞形态、存活力、增值 能力、分化、基因和蛋白表达、对刺激的反应、药物代谢及一般的细胞功能受到了限制或减弱。 2D 培养的限制对临床前基于细胞的药物和毒性筛选试验的可预测性造成了影响。超过90&的药物通过了体外临床前研究，却在随后的临床实验中未能达到预期的疗效或安全范围4。癌症药物的失败率更高 5, 12，因为2D培养系统常常无法构建有效的肿瘤生物学模型6,7。而且，在使用2D模型进行临床前药物研 发时，生物利用率和毒物学的研究严重依赖于动物模型的使用。这一高失败率表明动物模型可能并不 适用和/或并非人用治疗方案安全性评测的代表4,16,17。 为了克服这些短板，大量的3D细胞培养模型在近20年被开发了出来。由于3D模型显著促进了癌生物 学、组织工程和再生医学的研究，又得到了进一步的发展。为此，细胞生物学家们、材料科学家们、 生物医学工程师们以及其他开发更有用的模拟体内环境的3D模型来缩短2D培养与活体组织间差距的 人，携手参与了多学科的研究。越来越多的证据表明，3D培养建立起来的生理细胞-细胞与细胞-细胞 外基质相互作用可以模拟天然组织的特异性，并且比传统2D培养的生理相关性更强8-10。这在干细胞培 养和分化、癌生物学、药物和毒性筛选及组织工程中显得尤为突出。 Suparna Sanyal, Ph.D.3D细胞培养和试验系统 综述文章
MRI对膝关节软骨损伤的诊断
MRI对膝关节软骨损伤的诊断 一、介绍 关节软骨属于透明软骨，表面光滑，呈淡蓝色，有光泽，厚度约1-5mm。关节镜检查只能看到形态，MRI是目前唯一日常性成像方式，已经发展成检查关节软骨主要的主要技术。 二、关节软骨的组织结构 关节软骨属于透明软骨，关节软骨根 据细胞胶原介质分四层结构 第一层是浅表层，也称为切线层。胶原 纤维排列方向与关节面相互平行； 第二层是附着层；胶原纤维成斜线排 列； 第三层是辐射层；胶原纤维排列方向与 关节面相互垂直； 第四层是钙化层；与骨性关节面紧密结 合在一起。在辐射层和钙化层之间有一条 线，称之为潮线，是关节软骨成熟的标志。 三、MRI对关节软骨的成像技术 MRI对关节软骨的成像技术分为形态学成像技术和分子影像学成像技术。分子影像学成像技术涉及关节软骨的组织成分。分为软骨细胞、细胞外基质（包括电解液、5%蛋白多糖、20%胶原纤维等）。分子影像学从分子角度检测钠离子浓度变化、蛋白多糖变化以及蛋白多糖中糖原多糖变化情况，然后通过分子结构的改变来重建图像。 从组织学上说，软骨损伤的因素包括外伤、配电以及其他非理化性因素等。软骨的损伤包括浅层、附着层、辐射层甚至钙化层的损伤。关节软骨无神经血管乃至淋巴，因此关节软骨受到创伤很难愈合。软骨损伤不是单一的疾病，还涉及邻近组织一些静态的改变，如韧带的损伤、组织下变化以及骨性关节炎的变化等。最终导致患者的功能障碍。 核磁有很强的空间和密度分辨率，能够早期探测出软骨的变化，进而做出适当的处理。因此核磁在软骨的探测方面，具有独到的优势。 （一）形态学成像技术 形态学成像技术，也是临床上常用的检测技术，可以清楚的显示关节软骨形态、大小以及厚度。能够提供准确的信息，对关节软骨的分度如局限性缺损、全层的缺损以及 关节软骨修复术当中也起着很重要的作用。 关节软骨从形态学上分类： 0级：正常关节软骨。如右图A 1级：形态正常，信号略有增高。如右图B 2级：关节软骨表层缺损，但未及关节软骨 厚度的50%。如右图C 3级：关节软骨表层缺损，超过关节软骨厚 度的50%但未达到100%。如右图D 4级：全层关节软骨的缺损。其中4级分为