K-B纸片法
杀菌动力学
9．测量抑菌环孵育后，手持平皿，从背面目测检查每块平板，用卡尺测量每个抑制环直径(包含纸片的直径)，并以mm为单位记录大小。
10．结果判断参照表6-3—1标准，根据抑菌环大小作出判断，分敏感、中介和耐药三级报告结果。
3. 接种方法将试验菌稀释成107CFU／ml细菌浓度，取一环(约2μg)接种到含有一系列抗生素的琼脂平板上。接种前平板必须相当干燥，从低浓度琼脂平板开始，在30分钟内完成接种，每次试验需点种一个不含抗生素M—H平板以及质控菌株(ATCC．25922)作质控对照。
4. 培养接种好的平板，放置室温让接种液被充分吸干后，置(35±2)℃孵箱内16～20小时，读取结果。
2. 培养基制备M．H琼脂 配制时加水量要减少1／10，以备添加稀释好的抗生素溶液。琼脂培养基经121℃灭菌15分钟，于水浴中冷却至45～50℃；在每个直径9cm平皿中，加 M—H培养基25ml，稀释好抗生素溶液2.5ml，充分混合，制备含有抗生素的琼脂平板，密封在塑料袋，4～8℃冰箱保存，可使用一周。
5．接种菌液制备? ①增菌法：选择琼脂平板上形态相同的菌落至少4～5个，用接种环挑其顶部，移种到4～5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中，35℃培养2～6小时，菌液浓度达 到或超过0.5单位麦氏比浊管浓度，用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至与麦氏单位标准比浊管相同[约(1～2)×108CFU／m1]。②细菌直接悬液法： 可直接用过夜培养的菌落在盐水或肉汤中制备接种菌液，浓度调至0.5麦氏单位标准比浊管。
1．纸片扩散法(K—B 法)药敏试验把含有抗菌药物的圆纸片放在均匀地接种了实验细菌的琼脂平板上，抗生素的浓度梯度通过从圆纸片上扩散而形成。试验细菌的生长在圆纸周围一定距 离处被抑制，抑菌圈的大小与细菌的敏感性有直接关系。回归曲线表明MIC的对数与抑菌圈的直径呈直线关系。
微生物学实验报告--第八周
年级：2009 专业：医学检验班级：一班姓名：赵富海学号：2009221792实验八、细菌的药物敏感试验【K-B法】菌种（均为幼龄菌）：金黄色葡萄球菌1.5×108/ml、大肠埃希菌1.5×108/ml药物纸片：青霉素、庆大霉素、新诺明、环丙沙星方法：1.涂菌（棋盘划线法），室温放10min；2.贴药敏纸片，注意间距（大于24mm）和边距（大于15mm）；3.置35℃ 24h判读结果。
结果如图所示：金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验评价结果实验结论：金黄色葡萄球菌对青霉素耐药，对庆大霉素、新诺明、环丙沙星敏感。
【试管稀释法】菌种：金黄色葡萄球菌1.5×108/ml、大肠b1.5×108/ml抗生素：庆大霉素32u/ml方法：1.对倍稀释抗生素2.加菌液0.1ml/管，摇均35℃ 16—18h3.判读MIC试验操作如下图所示：注意 :设立对照管(肉汤对照管,待测菌生长对照管和质控菌生长对照管) 结果判断: 不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对该细菌的MIC. 如图：实验结论：MIC=原药物浓度(32u/ml) ×稀释倍数(1:24)=2u/ml【联合药敏试验】（示教）金黄色葡萄球菌大肠b结果判断：金黄色葡萄球菌联合药敏试验结果判读：①青+链=青单+链单→相加作用②青+红=青单+红单→相加作用③青+万=青单+万单→相加作用④青+林＞青单+林单→协同作用大肠b联合药敏试验结果判读：①青+红=青单+红单→相加作用②青+链=青单+链单→相加作用③青+林=青单或林单→无关作用④青+南＞青单+南单→协同作用【实验讨论】1．K-B法原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含有的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。
K-B 纸片扩散法测定抗生素敏感试验
平板霉素类似物生物活性评价平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。
抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。
最小抑制浓度（MIC）被确定抑制细菌生长的最低浓度。
通过生物活性数据的反馈，进一步指导平板霉素类似物的合成方向，希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。
纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC：1.原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
2.仪器及试剂仪器：纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台试剂：样品溶液、培养基3.菌液的配置从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mL LB肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。
也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。
4.接种平板在超净工作台中，用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基，倒在平板中，冷却凝固。
吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中，加入4500μL的培养基，冷却到不烫手，摇匀，均匀倾倒置已凝固的平板表面，放置冷却至凝固。
5.粘贴药敏纸片用纸片分配器或无菌镊子取纸片（直径6mm，厚度1mm），贴于平板表面，并用镊子尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。
纸片扩散法药物敏感试验
纸片扩散法药物敏感试验若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。
而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。
WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。
本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。
无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。
但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
试验方法：一、试验材料：(一)培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。
多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。
此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。
若检测肺炎链球菌的敏感性时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。
测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。
在水平的实验台上倾制。
琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。
琼脂凝固后，应测一下pH。
琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。
每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。
MH琼脂培养基配方(1L)：Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5gStarch 1.5g Agar 17.0gFinal PH 7.3 at 25℃高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。
K-B纸片扩散法药敏试验
万方数据万方数据K-B纸片扩散法药敏试验作者：谭瑶， 赵清作者单位：第三军医大学军事预防医学院环境卫生教研室,重庆,400038刊名：检验医学与临床英文刊名：LABORATORY MEDICINE AND CLINIC年，卷(期)：2010,07(20)1.Andrews JM For the BSAC working party on susceptibility testing,BSAC standardized disc susceptibility testing method 2001(Suppl 1)2.池云生;李丽对影响细菌药敏试验因素的体会[期刊论文]-Chinese General Practice 2004(12)3.余修中K-B法药敏试验中菌液量的规范[期刊论文]-四川省卫生管理干部学院学报 2002(21)4.杜美华;黄本成;李华信细菌药敏试验比色法的探讨[期刊论文]-临床军医杂志 2000(28)5.张彩芳;张爱君纸片扩散法药敏试验条件的选择[期刊论文]-宁夏医学杂志 2006(12)6.倪语星抗微生物药物敏感性试验规范 20027.Annie F;Bernadette G;Philippe HL Evaluation of three techniques for detection of low-level methicillin resistant Staphylococcus aureus(MRSA):a disk diffusion method withcefoxitin and moxalactam,the VITEK2 system,and theMRSA-screen latex agglutination test[外文期刊] 2002(08)8.赵瑞珍;陈乾;刘彬头孢西丁纸片法检测mecA基因介导的MRS[期刊论文]-中华医院感染学杂志 2006(07)9.王辉;徐英春;陈民钧简要介绍美国NCCLS 药敏试验纸片扩散法法规(1993年12月版) 1995(01)本文链接：/Periodical_jyyxylc201020070.aspx。
第4章抗菌药物敏感试验
第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。
药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。
在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。
对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。
②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。
制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。
③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。
嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。
用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。
（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。
平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。
纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。
直径为90mm的平板可贴6张纸片。
纸片贴牢后应避免再移动。
平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。
（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。
培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。
实验七++细菌的药敏试验与耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
检验科细菌耐药性监测标准操作程序SOP文件
检验科细菌耐药性监测SOP文件一、耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococci,MRS）MRS是引起临床感染的常见病原菌，同时也是引起医院感染的重要病原菌之一，其耐药特点是耐受甲氧西林的同时，还对临床广泛应用的多种抗生素呈现多重耐药，因而该菌所致感染已成为临床治疗的一大难题。
（一）MRS测定方法1、纸片扩散法接种物：直接悬液法从非选择琼脂平皿上挑取少许单个菌落至无菌生理盐水调至浓度0.5 McFarland,具体操作同常规纸片法药敏试验。
苯唑西林纸片，1R g/片，检测MRS平板应置于35℃ （而不是37℃）孵育24h （而不是16〜18h）。
结果判断：金黄色葡萄球菌：S：三13mm；I：11〜12mm；R:W10mm。
凝固酶阴性葡萄球菌：S：三18mm；R W17mm。
对于苯唑西林纸片周围的抑菌圈内有任何小菌落或稀薄“菌膜”生长都应列为MRS。
2、琼脂筛选法：如果纸片试验结果中介时，可做琼脂筛选法，培养基为MH琼脂+6R g/ml苯唑西林+4%NaCl,调整菌液浓度0.5McFarland,于35℃孵育24h,凡有任何生长即使一个菌落均报MRS。
（二）MRS监测意义对于MRS,应报告对所有头抱菌素类和其他B -内酰胺酶类耐药，喹喏酮类药物，除氟哌酸外，环丙氟哌酸，氟嗪酸有较好抗菌活性（耐药率10〜23%之间），利福平敏感率在90%以上，未见耐万古霉素菌株，但已有万古霉素中介金黄色葡萄球菌。
二、高水平耐药的肠球菌（HLAR）及耐万古霉素的肠球菌（VRE）（一）药敏测定方法1、常规测定方法：采用K-B纸片扩散法，头抱菌素不用做（均为耐药），氨苄，庆大霉素，替考拉宁，万古霉素一定要做。
2、高水平氨基糖甙类耐药性测定：⑴高含量纸片扩散法：通常测定庆大霉素和链霉素的高度耐药性，具体操作如常规纸片法药敏试验。
药敏纸片：庆大霉素：120R g/片；链霉素300p g/片结果判断：R：W6mm；I：7~9mm；S：三10mm⑵含单一高浓度抗生素琼脂平皿法：稀释法：庆大霉素：R：三500R g/ml；链霉素：R：2000p g/ml3、万古霉素耐药性测定：纸片扩散法，具体操作如常规纸片法药敏试验，万古霉素纸片为：30p g/片，检测平皿置35℃24h （而不是16〜18h）,并注意抑菌圈内有无小菌落或薄膜生长。
K-B纸片法
部位感染；⑤感染流行的控制；⑤对A组抗生素
过敏、耐受或无反应。
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药敏纸片制备
C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或 对A组药物过敏的病人和某些不常见的细菌 （如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠 球菌）。 U组仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿道 外分离菌的常规药敏试验。
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细菌制备
下表为麦氏比浊管制法：
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接种平板
①制备好的接种菌液必须在15min内使用。用灭菌好
的棉试子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压几次，去掉过
多的菌液。然后用试子涂布整个培养基表面，反复几
次，每次将平板旋转60°，最后沿平皿周边绕两圈，
保证涂布均匀。
②粘贴药敏试纸
物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）
呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小
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第二部分
实验方法
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实验方法
培养基制备 药敏纸片制备 细菌制备 接种
Hale Waihona Puke 精选可编辑ppt7培养基制备
培养基的种类： 进行细菌药敏试验所用的培养基种类较多。M—H 培养基 琼脂浓度越大、抑菌圈直径越小。有研究证明3种不同 M—H 培养基进行纸片扩散法，实验结果相同。 浓度1．0 ～ 2．0 、pH 7．4左右 培养基的质量： 4 mm 厚平板，允许±1mm误差，如此控制平板厚度即 可满足试验要求。有研究证明，平板每增厚或减薄1mm， 抑菌圈相应减小或增大0．7mm。
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药敏纸片制备
精选可编辑ppt
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药敏纸片制备
微生物学检验(第3版)药物敏感试验
抗生素的种类 一.目的：
四、氨基糖苷类抗生素 按其来源分为：①由链霉菌属发酵滤液提 取获得，有链霉素、卡那霉素、妥布霉素、 核糖霉素、巴龙霉素、新霉素；②由小单 胞菌属发酵滤液中提取，有庆大霉素、福 提霉素；③半合成氨基糖苷类，有阿米卡 星、奈替米星、地贝卡星等。
抗生素的种类 一.目的：
五、喹诺酮类抗生素 第一代为窄谱抗生素，有新恶酸、奈啶 酸和恶喹酸。 第二代为广谱类抗生素，抗菌强度依次 为环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙 星、氟咯沙星、培氟沙星、诺氟 沙星。 第三代为超广谱类抗生素，有司帕沙星、 妥舒沙星、左氟沙星等。
纸片的名称，然后用棉试子蘸取菌液，在试管内
壁轻挤去多余菌液后均匀涂布于整个平板表面3次， 每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂一周。放 置约5分钟后用镊子分别挟取所选择的药敏纸片贴 上。室温放置10分钟左右，恒温箱培养24h。
验操实作
• (4)、MH平板涂布均匀，放置5分钟再贴纸 片，纸片放置应该迅速准确，不得在平板 上拖动纸片，纸片间的距离和位置要均匀。 离平板边缘不小于15mm，两纸片间距离不 小于24mm。
实验原理 1.原理：
实验操作（接种与培养）
• (1)、取待测菌平板，观察菌落形态，涂片镜检， 革兰阴性杆菌做氧化酶试验，革兰阳性球菌做触 决定选择何组、何种药敏纸片。
酶实验。并根据实验结果对该菌株作出初步判断，
药敏试验选择纸片
• 触酶阳性的G＋球菌：青、苯唑、克林、庆大、环
丙沙星、万古、红霉素、头孢唑林 庆大、环丙沙星、万古
(一）苛养菌药敏试验抗生素的选用
A组一级试验并常规报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用红霉素和青霉素。 B组一级试验有选择报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用头孢噻肟或头孢曲松 。 C组补充试验有选择报告的抗微生物药， 如肺炎链球菌用头孢呋辛 。
实验七++细菌的药敏试验及耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
《医学微生物学》细菌的分布与外界因素对细菌的影响实验
《医学微生物学》细菌的分布与外界因素对细菌的影响实验[目的]1．掌握皮肤消毒方法。
2．掌握标准纸片扩散法(K-B法)的原理、操作方法、结果的判读与解释及其临床意义。
3．掌握纸片扩散法的质量控制方法。
了解空气、水中细菌的检查方法。
4．熟悉人体皮肤、咽喉部细菌检查方法。
5．熟悉紫外线灭菌方法。
6．了解高压蒸汽灭菌方法一、细菌的分布检查[材料]普通琼脂平板，1％高层琼脂，无菌试管，1毫升无菌吸管，无菌平皿。
[方法]1．空气中的细菌检查取琼脂平板一个，打开皿盖，暴露于空气中10分钟，然后盖好，在平皿底面注明地点、班组，放入37℃温箱内培养24小时后观察结果，计算菌落数，并观察不同的菌落形态。
2．污水和净水中细菌数的检查（1）用无菌试管分别采取自来水和未经净化消毒处理的污水各一管。
取自来水样时，须先将水龙头用酒精灯烧灼灭菌，再将龙头完全开放，放水5分钟，然后用无菌试管以无菌操作采集水样。
（2）用无菌吸管吸取自来水及经适当稀释的污水各1毫升，分别放入两个无菌平皿内。
（3）将已溶化并冷至约45℃（手握琼脂管感觉热而不烫手）的高层琼脂1支，倾注入平皿内，盖好平皿，立即将皿底贴桌面轻轻摇动，使琼脂与水样均匀混合后（但勿溢出于皿外），静置桌面，待琼脂凝固。
（4）标记，皿底向上置于37℃培养24小时，取出观察结果。
比较自来水及污水内生长的菌落数。
3．皮肤及飞沫中的细菌检查材料：普通琼脂平板，血琼脂平板。
方法：（1）皮肤细菌检查取普通琼脂平板一块，用手指轻轻涂抹培养基表面，置37℃温箱中培养24小时，观察结果。
（2）飞沫中的细菌检查取血琼脂平板一个，打开皿盖，将培养基面置于口腔前约10厘米处，用力咳嗽数次，约30秒钟，然后盖上皿盖，置37℃温箱培养24小时，观察结果。
二、外界因素对细菌的影响（一）高压蒸汽灭菌法（示教）[材料] 手提式高压蒸汽灭菌器、电炉等构造：手提式高压蒸汽灭菌器是一双层金属圆桶，外层坚厚，顶端有厚盖，盖边有翅状螺旋，借此紧闭此盖，防止蒸汽外溢。
怎样做好药敏试验（K-B法）
怎样做好药敏试验（K-B法）近年来，细菌感染性疾病严重威胁着人类的健康，抗生素的合理使用是治疗和控制此类疾病的有效手段，抗生素体外药敏试验结果的正确与否对抗生素的选择至关重要，药敏试验的结果受到诸多因素的影响，如培养基、试纸片以及菌液的浓度等。
1、培养基细菌药敏试验所用的培养基种类较多，多数情况下，采用WHO 组织统一要求的M-H培养基，这种培养基中含有的低胸腺嘧啶是与磺胺类药物竞争的物质，因此进行的药敏试验效果较好。
此外，还有适量的Ca2+、Mg2+，在培养基中起到触媒的作用。
但是，有些细菌对培养基中的成分有特殊的要求，特殊的菌要用特殊的培养基才能进行药敏试验。
例如，流感嗜血杆菌的药敏试验培养基用HTM琼脂；淋球菌的药敏试验培养基用加5％羊血的巧克力M-H琼脂；肺炎链球菌的药敏实验用M-H琼脂加5％的脱纤维羊血培养基。
培养基中还有适量的Ca2+、Mg2+，在培养基中起到溶酶的作用，其含量的变化，可影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌的试验结果，含量过高，抑菌圈会变小，含量过低，抑菌圈会大得不可接受。
细菌药敏试验的培养基厚度大约为4mm，若培养基厚度大于4mm，会使细菌出现耐药；若小于4mm，本应耐药的易出现敏感。
所以，试验时一定不要把药敏纸片放在中央部位，而应均匀地排布在平皿周围的培养基上。
制作药敏试验的培养基用水，主要是Ca2+、Mg2+等矿物质离子，也在很大程度上影响着药敏试验的结果。
2、试纸片试纸片材质的好坏，对药物稳定性和活性有很大影响。
加工药敏试纸片的试纸一般是使用加厚型的滤纸，杂质少，对药物保存无太大影响。
然而，临床中很多用的是普通纸，被水浸润后会呈碱性，并且含有大量无机离子，因此使用普通纸加工的试纸片药物有较大的影响。
药敏纸片的PH值一般要求为中性，这样才适合药的活度。
药敏纸片的厚度要求大约1mm，这样才有利于细菌的生长和药物的扩散速度。
药敏纸片的直径在6.00～6.35mm之间，纸片的厚度和直径大小都会影响药敏试验的结果。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
作业指导书-K-B纸片琼脂扩散法药敏试验操作
操作顺序
检查要点
使用材料
1、试验操作前，提前把单人净化工作台的紫外灯打开，杀菌一个小时；
2、配制MH（A）培养基，121℃高压灭菌15min，取出后在净化工作台中倒入无菌平皿中，每个平皿倒入20ml左右，使培养基厚度约4mm左右；晾干后备用；
3、在净化工作台中进行试验操作，用移液枪取校正好的菌液100μl注入已制备好的MH培养基上，用玻璃涂棒涂抹均匀；
检查要点
使用材料
1）取定性滤纸，用打孔器打成直径为6mm的圆形纸片，放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎，经121℃高压灭菌30min后，放在60℃的烘箱中烘干备用；
2）试验操作前，提前把单人净化工作台的紫外灯打开，杀菌一个小时；药液配制方法参照CLSI抗微生物药物敏感性试验执行标准（2010版）中规定的配制；药液配制在净化工作台中进行；
操作安全
1.高压锅使用时禁止脱水操作、排气未尽时不要打开高压锅；2.所有带菌实验用品，须经有效的消毒灭菌处理后再洗刷。严禁污染下水道。
环境要求
外围：一般பைடு நூலகம்境
无菌操作：万级局部百级洁净
异常处理
1.操作过程中断电，已打开的物品应重新灭菌，以防污染；2.发现污染及时处理；3.操作仪器有异常，及时汇报并报修。
3.纸片在使用前1～2h从冰箱取出，暖至室温再打开，以避免出现冷凝水。纸片启封后应放入可密封的有干燥剂的容器中，纸片只能在有效期内使用，过期应弃去。
1.打孔机、手提式高压蒸汽灭菌锅、恒温干燥箱、电子天平；
2.无菌水、磷酸缓冲盐溶液等溶剂
3.新华定性滤纸
材料处理
1.将材料2及圆纸片放入高压锅，按高压蒸汽灭菌锅操作规程操作，灭菌121℃、30分钟；
纸片扩散法(k - b 法)进行药敏试验 判定标准
纸片扩散法(k - b 法)进行药敏试验判定标
准
纸片扩散法（K-B法）是一种常用的药敏试验方法，其判定标准如下：
1. 敏感（S）：抑菌圈直径≥15mm，或比阳性对照药抑菌圈增大4mm以上，且无耐药菌株出现。
2. 中度敏感（MS）：抑菌圈直径10～14mm，或比阳性对照药抑菌圈增大4mm以下，且无耐药菌株出现。
3. 耐药（R）：抑菌圈直径≤9mm，或比阳性对照药抑菌圈直径减小1mm以上，且与对照药抑菌圈边缘没有接触。
此外，如果抑菌圈与对照药抑菌圈边缘相切或相交，则判定为中介（I）。
需要注意的是，同一菌株对同一种抗菌药物的敏感度判定结果必须一致，即要么都是敏感，要么都是中介或耐药，不能出现敏感与耐药或中介与敏感的判定结果。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
药敏试验
≤13 14～22 ≥23
≥8
≤0.5
GEN 庆大霉素 10IU
≤12 13～14 ≥15
≥8
≤4
（五）药物敏感试验结果解释
“敏感”（susceptible，S）：表示测试菌可被测 定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度 所抑制；
“耐药”（resistant，R）：表示测试菌不能被在 体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制， 临床治疗无效。
二、稀释法：琼脂稀释法
将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同 浓度药物平板，使用多头接种器接种细 菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑 制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测 得MIC。
MIC：稀释法所测得的某抗菌药物能抑制 被检菌肉眼可见生长的最低浓度
琼脂稀释法具体实验步骤：
1. 抗菌药物储备液的配制：将各种抗菌药物制备 成琼脂稀释法试验需要的药物浓度。
标卡尺量取抑菌圈直径。 根据NCCLS标准，作出 “敏感”、“耐药”和 “中介”的判断。
几种抗生素抑菌环解释标准及相应的最低抑菌浓度
代号 抗生素
纸片 含药量
抑菌环直径（mm）
耐药
中介
敏感
相应的MIC（μg/ml）
耐药
敏感
P-G 青霉素G 10IU
≤20 2素
15IU
一、纸片扩散法
（一）试验原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种 测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药 物吸收琼脂中水分，溶解后不断向纸片周 围扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围 抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制， 从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的 敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负 相关关系，即抑菌圈愈大，MIC值愈小。
K_B纸片琼脂扩散法检测细菌药物敏感试验的影响因素分析
隐匿性肾炎的表现为单纯性血尿，类似于中医尿血，多因湿热下注所致。
金顺英等[14]将35例单纯血尿患者随机分组，治疗组每日服鲜车前草汁，对照组注意休息，预防感染，对症治疗。
8周后治疗组总有效率达85%以上，而对照组尿常规改变不明显，仅38.7%有效，二者有显著差异。
表明用此法治疗肾性血尿作用明显，且取材服用简便，久服未见毒副反应。
2.2.5 治疗阴道炎陈晓飞等[15]取新鲜车前草煎汁，对48例阴道炎患者进行浸泡治疗，结果29例外阴湿疹患者全部痊愈，l3例非特异性阴道炎及6例老年性阴道炎患者，治疗后症状明显减轻。
2.2.6 治疗急性乳腺炎急性乳腺炎为初产妇的常见病，分为未化脓型和化脓型两种。
陈福仁等[9]将捣烂的车前草捏成鼻孔大小的圆锥状，塞入患者鼻腔，15h/次，最多经3次治疗后，31例未化脓型者均可痊愈，但该法对化脓性乳腺炎无效。
王寿昌等[16]在10年期间对21例患者使用拍打尺泽穴加外敷车前草治疗急性乳腺炎，效果亦较好。
2.2.7 其他研究发现，车前草还可用来治疗运动性血红蛋白尿[17]、角膜翳[18]、痢疾[19]” 以及小儿迁延性肺炎、尿血、胃肠性感冒等儿科病症[20]，均取得了满意的结果。
3 小 结车前草资源丰富，用途广泛，且毒副作用小，随着现代技术的不断发展以及各学科间的不断完善，车前草会给人类带来更大的经济和社会效益。
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