基因捕获技术

基金项目:国家重点基础研究发展计划(973)项目(N o. 2001C B509901)

作者单位:200025,上海交通大学医学院遗传学教研室

通讯作者:王铸钢(E2mail:zhugangw@)・综述・

基因捕获技术

党素英　王铸钢

【摘要】　基因捕获技术是一种产生大规模基因突变的便利手段,对于揭示大量基因序列所对应的基因功能具有重要应用价值。本文综述了基因捕获技术的基本原理和研究方法、发展现状及远景。

【关键词】　基因捕获;　基因捕获载体;　表达筛选

“G ene2trapping”T echnique.　DANG Su2ying,WANG Zhu2gang.　(Department o f Medical G enetics,Shanghai Jiao Tong Univer sity Medical School,Shanghai200025,P.R.China)

Corresponding author:WANG Zhu2gang.　E2mail:zhugangw@

【Abstract】　G ene2trapping is an advantageous technique for generating gene mutations massively which is im2 portant to identify the functions of large quantities of gene sequence.In this review,the basic theory,study strategies, the development and future directions of gene2trap mutagenesis are discussed.

【K ey w ords】　G ene2trapping;　G ene2trapping vector;　Expression screens

随着人类和其他一些重要动、植物序列数据的快速积累,我们面临着如何鉴定这些序列数据所代表的生物学功能的巨大挑战。基因捕获(gene2trap2 ping)技术通过报告载体随机整合到基因组、标签插入位点、产生插入失活突变并揭示基因表达模式及其功能,已成为建立高通量、大规模基因突变模型的一种便利手段。随着多种新型载体及捕获策略的出现,基因捕获技术已被成功应用于克隆诸如特异组织发育相关基因、特殊信号传导途径相关基因等多种研究中,在功能基因组学研究中具有广阔的应用前景。

1　基因功能研究的策略

基因芯片、组织表达谱分析等多种传统的分子遗传学方法对于揭示基因功能及复杂的发育事件具有重要意义,但阐释某一基因功能的直接策略是基于对该基因突变后细胞或动物模型的表型分析。因此,X射线、化学诱变、逆转录病毒转染及转基因技术等多种产生突变的方法相继出现并被应用于基因功能研究。但这些方法都带有不稳定性,如经常影响多个基因或引起染色体重排,或不能提供分子标记来克隆突变基因[1]。在胚胎干细胞(embry onic stem cell,ES)内利用同源重组产生特定基因突变的基因打靶技术,即基因敲除和敲进技术(knock2out or knock2in)是目前被用来研究结构信息明确的基因功能的最重要的手段之一。然而,由于同源重组几率低、动物繁育耗时费力且产生的功能失活突变(无义突变,null mutations)常常与疾病中发现的分子损伤类型不同,因此,随机突变筛选策略更受研究者青睐。

基因捕获是一种结合随机突变与对分子信息明确的基因突变二者之优势的突变策略,即“随机基因打靶”,广泛应用于植物、线虫、果蝇及小鼠的研究中。

2　基因捕获的基本原理

基因捕获的方法酷似以报告基因为诱饵来捕获基因。其基本过程是将一含报告基因的DNA载体随机插入基因组,从而产生内源基因失活突变,并通过报告基因的表达激活提示插入突变的存在,及突变内源基因表达特点。通过筛选得到的插入突变的ES细胞克隆经囊胚注射转化为基因突变动物模型,进而分析表型来研究突变基因功能。每一种ES细胞克隆中含有不同的突变基因,在短期内可建立大量含不同基因突变的ES细胞克隆库。突变基因的序列可通过基于PCR的一些方法鉴定,同时还可能

发现一些在体内表达或不表达的新基因。

3　基因捕获载体

根据报告基因在载体中的位置及报告基因激活表达的方式,基因捕获分为3种类型。

增强子捕获(enhancer2trapping)载体含有一个最小的启动子和翻译起始位点,当载体整合到顺式增强子元件附近时,此增强子将调控报告基因的表达(见图1a)。对报告基因在体内表达的ES细胞系插入位点进行克隆鉴定发现插入位置邻近编码序列。关于增强子捕获的诱变比率还未见报道,但插入的性质预示由增强子捕获产生功能失活的突变比率较低,因此,增强子捕获载体在小鼠体系中未得到广泛应用。

启动子捕获(prom oter2trapping)载体通常由不含启动子成分的报告基因和一筛选标记基因组成,只有当载体插入到内源基因编码区序列中产生融合转录本时报告基因才可能表达(见图1c)。因而启动子捕获的致突变比率很高。然而载体插入到外显子的频率非常低,捕获效率较增强子捕获至少低200倍。故载体中通常含有一个筛选标记基因,如新霉素抗性基因(neo)或β2半乳糖苷酶(galactosidase)与neo的融合基因(β2GEO),保证载体插入的细胞克隆被筛选保留。由于插入发生在DNA转录区,克隆插入位点就可确定突变基因。

基因捕获载体中在无启动子序列的报告基因上游和下游分别含有剪接受体(splice acceptor,S A)和多聚腺苷酸加尾序列(polyA)(见图1b),当含有顺式作用的启动子和增强子元件被捕获基因转录激活时,载体中S A与内源基因剪接供体(splice donor, S D)作用产生上游内源基因编码序列与报告基因融合转录本,使内源基因发生突变,同时报告基因的表达提示内源基因的表达特点。融合转录产物可作为克隆突变基因序列的模板。由于插入发生在内含子中,基因捕获的效率较启动子捕获至少提高50倍。然而选择性剪接(alternative splicing)的发生会导致低水平的野生型转录本产生而形成减效等位基因突变[1]。

4　新型基因捕获载体的设计及应用

基因捕获载体在基因组中也有“hot”和“cold”插入位点。但是计算机模拟显示,按照单个克隆被捕获的百分比,如果以多种类型的载体进行足够多次的突变实验所获得的突变克隆就可以覆盖整个ES 细胞基因组中全部基因位点[2]。因此,新型捕获策略和载体不断被设计应用。

早期基因捕获载体的特点是当报告基因与内源基因的读码框一致时,产生由内源蛋白的N末端与报告基因蛋白融合的活性蛋白质(见图1b)。近来对这一类载体所做的改进是在报告基因与S A序列间插入一来源于脑、心肌炎病毒的IRES(internal ri2 bos ome entry site,IRES)序列[3],这样即使报告基因与捕获基因不发生融合也可产生报告基因翻译产物。尽管ES细胞中大量基因具转录活性,为了获得全基因组突变克隆必须使用不依赖于捕获基因表达的筛选策略。因此,在第一、二代基因捕获载体中应用报告基因和含自身启动子(PGK)的筛选标记基因neo,抗药性的产生不需要捕获基因的表达。不同的是,第二代基因捕获载体(polyA2trapping)中筛选标记基因3′末端没有polyA加尾信号而含有一剪接供体序列(见图1d)[4],必须由内源基因提供polyA加尾信号以产生稳定的筛选标记基因mRNA而获得筛选克隆,因此与第一代载体相比,降低了基因间插入的背景。polyA捕获载体还解决了第一代基因捕获载体突变基因信息鉴定的难题。3′2RACE可用以鉴定polyA捕获基因3′端编码序列或3′非翻译区(UTRs)序列信息,对于基因鉴定比5′2UTRs序列有用得多。

用以克隆捕获特异类型蛋白编码基因的多种新型载体也已问世,如Skarnes等[5]利用分泌蛋白的原理及β2gal活性在内质网被灭活的特点设计了一种载体专门用以捕获在ES细胞中表达的编码穿膜分泌蛋白的基因(见图2)。

一些研究小组还在载体中引入了重组位点,以实现由重组酶介导的捕获位点插入后修饰[6,7]。这种“敲进(knock2in)”的策略允许对捕获位点作进一步修饰,如“指派”捕获基因的启动子成分驱动敲入的转基因表达来进行“回复突变(rescue)”或细胞标记实验;通过敲入含不同突变的捕获基因cDNA还可产生等位基因系列;含lox位点的载体还可实现在捕获基因组条件性取代载体产生更精细的突变,包括点突变和/或选择性表型标记,可以更好地控制突变的性质。