实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质

分配系数：在一定的条件下，某种组分在 固定相和流动相中浓度的比值，常用K值 表示。
溶质在固定相中的浓度（Cs）
K=
溶质在流动相中的浓度（Cm）
☻K值大：被固定相吸附的牢固，随流动相的移 动速度较慢。
☻若混合物中各组分K值相差较大, 则能较易地分 离，反之，K值相差较小，分离效果差。
离子交换层析(ion exchange chromatography)
低分子量蛋白、多肽的分离
3,000~70,000 中低分子量蛋白、多肽的分离 4,000 ~150,000 中高分子量蛋白的分离 5,000 ~400,000 高分子量蛋白的分离 5,000 ~800,000
重点1
凝胶层析的原理 分子筛效应
比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部， 完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外 的空间随流动相向下流动，它们经历的 流程短，流动速度快，首先流出。
临床医学五年制本科
掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作步骤。
使用教材：
《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主 编，高等教育出版社，2008年第1版
参考资料：
《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005 年第1版
推荐网站：
1. 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室： http://192.168.4.133:8002/ 2. 美国国立生物技术信息中心：
较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部，然后再扩散出来，经历的流程长， 流动速度慢，后流出。
凝胶层析的数理关系
外水体积Vo 柱床体积Vt 凝胶体积Vg = Vg + Vo + Vi = r2h
内水体积Vi
洗脱体积（Ve）：自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所 流出的洗脱液体积（Ve） 。
数理关系
用离子交换剂（在惰性载体上引入带有电荷的活 性基团）作固定相，与流动相中离子发生可逆性离 子交换反应而进行分离的方法。 常用的离子交换剂：离子交换树脂、离子交换纤 维素、离子交换凝胶
带电荷量少，亲和力小 的先被洗脱下来，带电 荷量多，亲和力大的后 被洗脱下来。
亲和层析(affinity chromatography)
得到较好的分离效果？
Thank You!
围1500~30000），以蒸馏水为洗脱剂（流 动相）。
☻分离蛋白A（黄色，分子量在G 50的分离
范围内）与蛋白B（蓝色，分子量大于G 50 的分离范围内）的混合物。
实验步骤
一、凝胶的准备 1. 称取Sephadex G 50 2g，臵于锥形瓶中， 加蒸馏水约30ml，在沸水浴中加热1h或 浸泡24h溶胀凝胶，冷却到室温后再装 柱。 2. 溶胀处理后，对凝胶进行反复漂洗，倾 斜法除去表面悬浮的小颗粒，反复2~3 次。
小 结
凝胶层析的原理：分子筛效应 凝胶层析有效分配系数（Kav）：被分 离的化合物被凝胶排阻的程度。 层析实验操作过程中的注意事项。
实验结果：观察到蓝色蛋白洗脱快，黄
色蛋白洗脱较慢。
思考题
凝胶层析的原理是什么？ 什么是有效分配系数（Kav）？其意义是
什么？
用凝胶柱层析分离不同蛋白质，怎样才能
移液器正确使用
选择适当量程 正确安装枪头 吸液第一档，放液第二档 垂直吸液，慢吸慢放 吸液后不可将枪平放
四、样品收集
1. 样品一旦加入柱床面后马上用 烧杯收集流出液，（注意柱床上 要不断加水，保持1cm高水层） 直到两种蛋白全部洗脱。 2. 倒出凝胶，清洗层析柱。
实验注意事项
☺琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否 则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大 都以含水状态供应，并应在湿态保存。
☺琼脂糖凝胶是商品名因生产厂家不同而异。 （具体名称和型号见教材P18）
琼脂糖凝胶特点
室温下其稳定性胶葡聚糖凝胶和聚丙烯酰 胺凝胶，对样品的吸附性很小。 洗脱速度较快 排阻极限大，分离范围广，适合分离大分 子物质。
三、加样与洗脱
1. 加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出， 待凝胶床面只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出 口（注意：不可使凝胶柱表面干涸）。 2. 用移液器将200µ l样品小心加到凝胶床表面（注意： 加样时滴管垂直伸入柱内，接近液面处集中滴加， 动作要轻柔，不要将床面冲起，亦不要沿柱壁加 入）。 3. 然后打开出口，使样品进入柱床面，滴加1~2倍样 品体积的蒸馏水（沿管壁轻柔滴加），待完全流 入柱床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，直到两 条区带分开为止。
二、装柱
1. 取层析柱，将层析柱固定在 支架上，调整层析柱与水平 面垂直。 2. 烧结板下端的死区用蒸馏水 充满（注意：不得留有气泡， 可多加约1cm高水层，使柱 1cm 内凝胶通过沉积作用更加均 砂芯 匀），然后关闭层析柱的出 口。
3. 将凝胶悬液沿玻璃棒小心地徐徐灌 入柱中，待底部凝胶沉积1-2cm时， 再打开出口，继续加入凝胶悬液至 凝胶沉积约15cm高度即可（注意： 凝胶悬液尽量一次加完，以免出现 分层的凝胶带）。 4. 新柱装好后，加3-5倍体积蒸馏水流 过柱床，然后平衡10min。（注意： 始终层析柱与水平面垂直）
2. 特点
化学性质：
在水溶液、有机溶液、盐溶液中都较稳定。
在强碱和高温下易发生分解。
聚丙烯酰胺凝胶不带电荷，吸附效应小。 商品出售的聚丙烯酰胺凝胶为干凝胶形式， 使用前需溶胀。凝胶的型号见教材P18
琼脂糖凝胶
☺琼脂糖是从海藻琼脂中分离得到的天然凝 胶，由D-半乳糖和L-半乳糖经脱水构成的 多糖链。糖链间以氢键方式互相连接，形 成网状结够。
流动相(Mobile phase ) ：在色谱分离过程 中，推动固定相上待分离的物质朝着一个 方向移动的液体、气体等。
层析的分类
一、按两相所处的状态分类
气-固层析
气相层析
层析
液相层析
气-液层析 液-固层析
液-液层析
层析的分类
二、按操作方式分类
1 1 2 2
柱层析
纸层析
薄层层析
3 4层Βιβλιοθήκη 的分类柱层析（column chromatography） 将固定相装在层析柱中，使样品 朝着一个方向移动，通过各组分随 流动相流动而得到分离的方法。
层析的分类
三、按层析的分离机制分类
1. 吸附层析 2. 分配层析 3. 离子交换层析 4. 亲和层析 5. 凝胶层析
凝胶层析 (分子筛过滤、排阻层析)
2. Wash away non bound sample components from solid support
3. Elute
聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶，商品名Bio-gel-P，也是一种人
工合成凝胶，为颗粒状干粉，在溶剂中能自动吸水 溶胀成凝胶。
1. 结构：
基本骨架：单体丙烯酰胺 交联剂：甲叉双丙烯酰胺 聚合而成。
(1) Ve = Vo Kd = 0 ☻大分子完全 被排阻于凝胶 颗粒之外,故 最先流出
K d= 0
(3) Ve = Vo + Vi Text in here Kd = 1 ☻小分子不被 排阻，全进入 凝胶颗粒内部, 故最后流出。
洗脱体积
实验步骤
☻本实验中用Sephadex G 50（分离分子量范
分配系数（Kd):
某个组分在固定相和流动相的浓度关系。 Ve－Vo Kd = Vi
有效分配系数（Kav）:
Kav
Ve－Vo = Vt－Vo
重点2
分配系数与被分离物分子量之间的关系
(2) 0 < Kd < 1 Ve = Vo + ViKd ☻中等大小的 分子部分进入 凝胶内部，流 出速度居中。
0＜Kd<1 K d= 1
溶解度 分子极性 分子大小 两相 分子形状 吸附能力 分子亲合力等
物理 化学 性质
固定相
流动相
层 析
固定相(Stationary phase ) ：是色谱的基质， 可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子 交换剂等），也可以是液体物质（如固定 在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能 与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、 交换等作用。
G型（G-X: X数字代表 交联度与吸水量） LH型
Sephadex的常见规格（分级范围）
型号 分离范围 (G-X) (分子量Da)
G10 G15 G25 G-50 G-75 G100 G150 G200 <700 <1,500
1,000 ~ 5,000
应用
脱盐、短肽、小分子的分离
1,500~30,000
葡聚糖凝胶柱层析法分离蛋白质
生物化学与分子生物学教研室
教学目标:
了解：
1. 层析技术的基本原理。 2. 有效分配系数Kav的计算。
理解：
葡聚糖凝胶的选择和准备。
掌握：
1. 凝胶层析的原理和操作方法。 2. 有效分配系数Kav的意义。
教学重点：
凝胶层析的原理和实验步骤。
教学难点： 教学对象：
亲和力 生物分子间存在很多特异性的相互作用， 如抗原－抗体、酶－底物、激素－受体等， 它们之间都能够专一而可逆的结合。 分离原理 在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的 配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发 生可逆的特异性结合而进行分离纯化。
1. Incubate crude sample with the immobilized ligand
装柱时需保持柱体垂直于水平面，不可随意 晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。
加样时移液器垂直伸入柱内，接近液面处集 中滴加，动作要轻柔，不要将床面冲起。 实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶 始终处于蒸馏水中，防止蒸馏水排空。
吸附层析(absorption chromatography)
茨维特实验