反相HPLC色谱柱的清洗与再生

反相高效液相色谱柱的清洗与再生

Ronald E. Mayors, Agilent Technologies, Wilmington DelaWare, USA.

本月的”Column Watch”介绍一些实用的使被污染的色谱柱性能恢复或接近恢复至初始水平的方法。Ron Majors也会讨论一些键合硅胶和其他类型的反相色谱柱的清洗方法。

迄今为止，反相色谱是高效液相色谱中使用最广泛的技术，它能普及的原因是其能适用于绝大多数非极性化合物，很多可解离和离子化合物的分析。反相色谱中使用的固定相大多是天然存在的疏水化合物，因此，被分析物因它们与固定相之间相互作用的不同而被分离开来，同时，极性表中疏水性接近的化合物也表现出相似的色谱行为。

表1列出了与硅胶键合的最常用的固定相，固定相的亚种，比如混合固定相（如苯基-已基混合），终端封尾以及其变种和极性包合固定相也被统计在了这些硅胶键合相之中，多种其他包合材料也被用在了反相色谱中，包括高分子聚合物，聚合物包裹硅胶，氧化铝，无机-有机混合物和石墨化碳。第一种固定相都有它的优势和不足。

反相色谱柱被用于多种使用各种流动相和添加物的应用中，有一些应用中使用的添加物会改变填料的表面性质，有时这些添加物本身硅胶会污染填充物表面或键合相。

由于疏水键合相的存在，键合硅胶颗粒的表面会有一些特性。残留的硅醇会存在于所有键合硅胶颗粒的表面。图1显示了硅醇可能存在的多种形式。在弱酸性环境中，这些硅醇能和特定的化合物和基质成分特别是碱性化合物发生相互作用。因为硅醇的PKa大约为4.5，在中等PH条件下会发生解离，因此有可能与阳离子组分发生静电相互作用。传统的A型硅胶的金属离子含量会很高（有时高达100ppm甚至更高），这些金属离子会将酸性更强的物质引入到硅胶表面中，也会与金属螯合物或清洁剂发生相互作用。残留硅胶对非终端封尾和像C2或C4这样的短链键合相的影响会更大。

用户必须清楚他们所使用的固定相的表面性质以及被分析物与固定相表面的相互作用，这样在他们开发和使用反相方法时，就可以把这些因素考虑进去，例如，像玉米油，高级芳香化合物和蜡这样的样品基质会粘附在反相填料表面并改变其性质，含有蛋白质成分的生物样品也会吸附在填料颗粒表面，即使分析师采用最好的方法来避免外来物质的污染以保护色谱柱，最终待分析物-基质仍然会影响固定相。色谱柱在被污染后，它的色谱表现会不同于未被污染的色谱柱。本期的”Column Watch”会介绍一些使色谱柱恢复或接近恢复其初始状态的实用方法。由于硅胶键合色谱柱使用最广泛，我会特别重点介绍这一方面，在本文结束的时候，我也会讨论其他类型的反相色谱柱的清洗规程。

反相色谱柱是如何被污染的？

通常，样品基质中会含有一些与目标分析物无关的物质。在使用过程中，盐，酯类，脂肪化合物，有机酸，疏水蛋白和其他生物组分是一部分可能与色谱柱发生相互作用的物质。与目标分析物相比，这些物质的保留能力可能更强，保留能力较弱的化合物，如盐，通常在死体积内被冲出色谱柱，这些预料之外的干扰可被检测器检测到，表现为色谱峰分叉，基线波动甚至是负峰。如果样品基质成分在色谱柱上的保留能力很强，而流动相的洗脱能力从来都没有强到足以将这些化合物冲出来，那么在多次进样后，这些吸附在色谱柱上的基质组分就会聚集，当足够多时，它们就会像新的固定相一样表现出性质，被分析物与这些污染物的相互作用会影响分离机制，可能导致保留时间波动和峰拖尾。如果污染物更多，则柱压可能升至很高的水平，甚至超过柱压上限，也可能造成色谱柱坍塌并形成死体积，这取决于堵塞形成的位置。

冲洗硅胶键合色谱柱

复原一根被污染的色谱柱的关键是知晓污染物的性质并找到能够将其清除的适当的溶剂。当污染来自于重复生进样后强保留物质的积累时，一些简单的能将这些物质清除的处理

方法通常能恢复色谱柱的性能。有时用相同的操作，即用20个柱体积的90%~100%B相（双通道色谱中洗脱能力更强的溶剂）冲洗色谱柱。表2列出了多种规格的色谱柱柱体积，这样读者在用非水溶剂如甲醇，乙腈或四氢呋喃冲洗色谱柱时就能很容易确定适当的冲洗体积。如果你的流动相为缓冲盐溶液，不要直接过渡到强溶剂，直接过渡到高浓度的有机溶剂会使缓冲盐在HPLC流路系统中析出结晶。这会导致更严重的后果，比如筛板堵塞，接头连接处堵塞，柱塞杆初始化失败，柱塞杆磨损或进样阀转动失败。相反，用5~10个柱体积的不含缓冲盐的流动相（即用水来替代缓冲盐）冲洗色谱柱后就可以用洗脱能力更强的溶剂来冲洗色谱柱了。

很多时候，流动相中洗脱能力更强的溶剂仍不足以清除色谱柱上的污染物，这时为了清除色谱柱上的污染物就需要使用一种或多种洗脱能力更强的溶剂了。如果这些污染物是非生物性的，那么使用者可以用一种或多种有机溶剂来冲洗色谱柱以清除掉这些污染物。可以使用的溶剂或混合溶剂有很多种，可访问一家或数家色谱柱生产厂商的网站以获取各种关于溶剂系统的建议和提醒。

总体而言，所有的清洗过程都遵循相似的原则，即所使用的溶剂的洗脱能力越来越强，常常以一种极性非常低的溶剂（比如乙酸乙酯甚至是碳氢化合物）结束，这种溶剂对清除像蜡类，油酯这样的非极性化合物很有帮助。确保冲洗过程中任何相邻的两种溶剂的混溶性是非常重要的。在冲洗完后，应当用适当的溶剂过渡后再使用初始流动相来冲洗色谱柱。举个例子，异丙醇就是一种优良的过渡溶剂，因为它既可以与像正已烷或二氯乙烷这样的有机物混溶，也可以与水溶性试剂相混溶。由于异丙醇的粘度很大，注意控制其流速以免系统压力超过压力上限。同时，如果使用了紫外检测器，则应避免使用在紫外区有吸收的溶剂，否则就需要用大量的溶剂来清除掉这些溶剂以得到稳定的基线。

对于普通的硅胶键合色谱柱并且使用的流动相中不含盐时，可用下面的程序进行清洗：·100%甲醇

·100%乙腈

·75%：25%乙腈甲醇混合液

·100%异丙醇

·100%二氯甲醇和

·100%正已烷

如果使用二氯甲烷或正已烷冲洗了色谱柱，由于溶剂的不相溶性，在恢复至水溶性流动相之前，必须用异丙醇过渡。每一种用来清洗色谱柱的溶剂至少需要10个柱体积，对于规格为250mm×4.6mm的分析柱来说，分析员可以用典型的1~2ml/min的流速来进行冲洗。为了恢复至最初使用的流动相，分析员没有必要将清洗时的整个程序反着来一遍，建议使用异丙醇过渡，然后用不含缓冲盐的溶液，最后使用最开始的流动相来冲洗色谱柱。四氢呋喃也是一种常用于清洗污染色谱柱的溶剂，如果用户怀疑存在严重污染，也可以用二甲亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺与水以50：50比例混合，然后以小于0.5ml/min的流速冲洗色谱柱，成功的反相色谱柱再生是一个特别耗时的过程，可以在夜间来运行这种梯度冲洗程序。

有一个值得考虑的问题是在冲洗过程中能否反冲色谱柱。由于绝大多数保留能力强的组分通常保留在色谱柱柱头，因此，反冲色谱柱可以大大缩短污染物离开色谱柱所需经过的距离。这时就需要考虑填充柱柱床的稳定性了，大多数现代的色谱柱是在比日常使用压力更高的条件下充填的，因此，它们的柱床通常不会被反冲的溶剂所影响。然而，如果前端筛板的孔径比后端大，这种反冲显然是不恰当的，举个例子，如果后端筛板的孔径为2μm，就足

以拦截住平均粒径为5μm（粒径差异在±2μm）的柱填料颗粒，但有些厂商为了防止样品或流动相中的微粒堵塞前端筛板，就使用了更大孔径的前端筛板，如果这种孔径比粒径分布曲线上最小的填料颗粒大，那么显而易见，在反冲时有一些填料会穿过前端筛板离开色谱柱，