生化实验技术实验设计

实验设计

题目：高效液相色谱-质谱联用技术测定大米中农药的残留

课程：生物学实验技术概述

专业：生物化学与分子生物学

学号：2015116105

姓名：杨洁舒

高效液相色谱-质谱联用技术测定大米中农药的残留

一、方案必要性与可行性分析

我国是水稻种植大国，大米是我国人民的主食，占口粮消费的63％以上。大米除被制成米饭直接食用外，还被加工成米粉、甜点及酒精饮料等。我国大米人均年消费量在140kg以上。水稻生产中为了保证水稻的高产，往往不可避免地需要使用各种农药。据报道，在农药的使用过程中，真正起作用的仅占喷施量的0.1%，其余99.9%的农药都分散于环境中，中国每年受农药污染的农田面积达到6.67×106hm2。因此，在大米的进出口中，世界各主要农业大国都对大米的农药残留制定了严格的限量标准。研究大米中农药残留的检测方法，既是保障人类健康的需要，又是促进进出口贸易的需要。为了保证水稻的产量，种植者施用大量的化学农药，不仅造成环境污染，而且直接影响大米的食用安全，威胁人们的健康。

鉴于上述原因，世界各国严格规定了包括大米在内的食品中农药最大残留限（MRLs）和每日最大摄入量。目前大部分实验室监测食品中农药残留的方法是采用经典的气相色谱法，选择性检测器包括电子捕获检测器（ECD）、氮磷检测器（NPD）和火焰光度检测器（FPD），然而这些检测器限制了农药残留的检测范围。其原因是萃取共存物的干扰存在假阳性和不准确性，用单一方法检测呈阳性后，还必须做确证试验。此外，经典的预处理方法操作复杂，耗时且溶剂消耗量大，因此，有必要研究新的样品预处理及检测方法。

随着联用技术的日趋完善,高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）逐渐成为最热门的分析手段之一。特别是在分子水平上可以进行蛋白质、多肤、核酸的分子量确认,氨基酸和碱基对的序列测定及翻译后的修饰工作等,这在HPLC-MS联用之前都是难以实现的。HPLC一MS 作为已经比较成熟的技术,目前国内外己在生化分析、天然产物分析、药物和保健食品分析以及环境污染物分析等许多领域得到了广泛的应用。HPLC-MS技术除了可以分析气相色谱-质谱（GS-MS）所不能分析的强极性、难挥发、热不稳定性的化合物之外，还具有以下几个优点：(、分析范围广，MS几乎可以检测到所有化合物，比较容易的解决了分析热不稳定化合物的难题；(、分析能力强，即使被分析混合物在色谱上没有完全分离，但通过MS的特征离子质量色谱图也能也能分别给出它们各自的色谱图来进行定性定量；(、定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息；④、检测限低，MS具备高度灵敏，通过选择离子（SIM）检测方式，其检测能力还可以提高一个数量级以上；⑤、分析时间快，HPLC-MS使用的液相色谱株为窄径株，缩短了分析时间，提高了分离效果；⑥、自动化程度高，HPLC-MS具有高度的自动化。

二、技术路线

三、方法和步骤

1.材料与方法

1.1仪器和试剂

安捷伦AgilentTechnologies1200SLSeries液相色谱串联G6410A质谱仪，同时配置G1948B电喷雾离子ESI源。甲醇、乙腈等均为色谱纯，购自德国Merck公司。甲酸为色谱纯，购自美

国TEDIA公司。水取自Milli-Q超纯水系统。

1.2溶液配制

农药标准品吡蚜酮(Pymetrozine）、氧化乐果(Omethoate)、敌百虫(Trichlorphon)、啶虫脒(Acetamiprid)、乐果(Dimethoate)、多效唑(Paclobutrazol)、烯唑醇(Diniconazole)、喹硫磷(Quinalphos)和甲基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin-benzoate)均购自农业部环境保护科研检测所，标准品保存于－20℃的冰箱中。称取各农药纯品0.01g(根据标样含量折算至0.01g有效成分)，用乙腈配置各农药单标1000μg/ml，储存于冰箱中备用。

1.3流动相的配备

流动相A：准确称取0.134g乙酸铵，溶解在1000mL乙腈中，加入适量甲酸(0.15%)，过0.22mm 有机相滤膜。

流动相B：准确称取0.134g乙酸铵溶解于1000mL的水中配成浓度为2mmol/L的乙酸铵溶液，再加入1mL甲酸配制为流动相B，过0.22mm水相滤膜。

2.实验步骤

2.1样品前处理

将大米用粉碎机粉碎，称取每个待测样品各5.0g(精确到0.1g)样品于50.0ml离心管中，加入0.1%(体积分数)冰醋酸-乙腈20.0ml，盖上离心管盖，漩涡混匀，超声波处理10min，振荡提取2h。加入3g无水硫酸镁和1g无水乙酸钠，漩涡混匀。4000r/min离心5min，取出上清液，50℃水浴氮气吹干。加入含0.1%甲酸的甲醇0.5ml，漩涡30s，加入0.1%甲酸的超纯水0.5ml，漩涡30s，加入氨基柱填料0.04g，漩涡混匀，过0.22μm的滤膜到进样小瓶中，供液质测定。

2.2标准曲线与线性范围

用空白样品提取液配制各农药系列浓度在10～1000ng/ml内作标准曲线。将测得的农药浓度和农药峰面积作直线回归，求曲线回归方程和相关系数。

2.3回收率与变异系数的测定

把各农药标准储备液的标准工作液加入5.0g各个大米空白中，制得对应浓度分别为 5.0μg/kg、50.0μg/kg、100.0μg/kg的3个添加浓度水平，放置1h，按照方法1.3和1.4进行，1d之内样品重复3次，共重复3d。以峰面积定量，求回收率和变异系数。

仪器基本操作和维护保养

3.1色谱、质谱条件与工作指标

色谱条件:色谱柱为ZORBAXSB-C18Narrow-Bore2.1mm×150mm5-Micron，柱前使用1cm长C18预柱，流动相为乙腈∶水∶甲酸(体积比为50．0∶50.0∶0.1)，流速为0.4ml/min，进样量5μl。

质谱条件:电喷雾ESI源，雾化气为氮气，压力为172kPa;干燥气为氮气，流速为10L/min，温度为350℃;毛细管电压为4000V;质谱为多反应监测(Multiplereactionmonitoring，MRM)模式，碰撞气为高纯氮气，根据具体农药分子特性确定传输区电压和碰撞能量。离子传输毛细管温度：250℃。

3.2仪器基本操作

1开机

2质谱调谐窗口各项参数设定

3创建项目

4质量校正

5调谐（Turning）

6信号采集

7泵、进样器和检测器的条件设置