菠萝蛋白酶
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不要用系列稀释的方法，系列稀释的 方法可能会使误差放大。
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简化的方法测定速度
只用不同底物浓度下反应的初速 度作为反应的速度，测定反应的 初速度只需要反应进行10分钟就 可以了。 所用的方法就是我们测定酶活力 的方法。
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8
测定Vmax和KM
以A275对时间做 图，用所得的斜 率计算反应速 度。 所得的速度是在 这个底物浓度下 的反应速度。 用相同的方法测 定其他底物浓度 下的反应速度。 A275 A275 vs Time
斜率
0'
10'
20'
30'
40' 50' 60'
Time
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9
余下的样品分装在几个透析袋中， 在0.002M pH6.0的磷酸缓冲液中透 析5小时，透析温度为4℃。 将透析过的上清液转入离心管； 离心：12 000rpm，20分，4 ℃ 离心后测量上清液的体积。 这一步得到的样品为样品2，反映了 样品在透析这一步的状态。 将样品2分装，-20℃保存备用。
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凝胶装柱
已经冲洗好的凝胶倒掉一些水， 用玻棒搅起，灌入层析柱中。后 面可以用滴管装柱。 装好的柱床应该均匀，不断裂， 没有气泡。
讲义中要求一次装好，并不是说要把所有的 凝胶一次倒入柱子中，而是说，在装柱的同 时，不要安排其他的工作，装好柱子以后， 再去做其他的工作。
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酶活力（U/ml）= A275/0.0145 ×稀释倍数 10分钟
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5
酶活力测定1
样品
2%酪蛋白 EDTA-Cys缓冲液 酶液 三氯乙酸 1.5ml 0.5ml 保温10分钟 0.1ml 反应10分钟 2.5ml
对照
1.5ml 0.5ml
2.5ml 酶液 0.1ml
静置30分钟后过滤
测定样品3的体积、蛋白质浓 度、酶活力，计算比活力， －20℃保存备用。
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米氏常数的测定
配制不同浓度的底物； 测定不同底物浓度下的反应 速度； 计算KM和Vmax 。
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7
配制底物
用0.025 M pH7.2的磷酸缓冲液配 制8个不同浓度的底物。 配制时要计算好需要的底物和缓 冲液的量，分别加入，混匀。
CAU.ZHAOWULING
果实菠萝蛋白酶 活力单位的规定
在35℃ pH7.2条件下，果实菠 萝蛋白酶水解酪蛋白所产生 的溶于三氯乙酸的小肽在 275nm的吸收为0.0145，定为 1个单位（unit U）。
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2
凝胶过滤的原理
葡聚糖凝胶是一些小珠，具有交联的网 状结构。 混合的蛋白质溶液通过这些小珠时，大 分子不能进入网格，直接从小珠的间隙 中流出。小分子可以进入网格，减慢了 流出的速度。 可以根据分子量把不同大小的蛋白质分 开。
3
分离纯化
称 取 果 实 菠 萝 蛋 白 酶 20g ， 用 0.002M pH6.0磷酸缓冲液100ml溶解，放置15分 钟后，离心。 离心：12 000rpm，20分， 4℃ 。 离心结束后，记录上清液的体积。 留一部分溶液作为样品1，-20℃保存备 用。样品1反映的是酶在溶解时的状态。
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果实菠萝蛋白酶 米氏常数的测定
CAU.ZHAOWULING
目的
学习凝胶过滤的方法 学习酶促动力学的测定
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1
测定果实菠萝蛋白酶 酶活力的原理
果实菠萝蛋白酶可以将蛋白质底物水解 成大小不同的片段。加入三氯乙酸后， 较大的片段形成不溶性沉淀，较小的片 段可以溶解在三氯乙酸中。 这些溶于三氯乙酸的小肽在275nm有吸 收，测定蛋白酶水解液在275nm的吸收就 可以计算出酶的活力。
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洗脱曲线
用所得到的数据作图，作出洗脱 曲线。
蛋白质的曲线和酶活力曲线要画 在一个图中。
横坐标是管号，纵坐标用双坐 标：一个纵坐标是Βιβλιοθήκη Baidu白质的含 量；一个纵坐标是酶的活力。
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6
合并洗脱液
根据洗脱曲线，合并具有酶活 力的洗脱液，这就是样品3。
样品3反映了酶纯化的情况。
4
上样、收集
柱子平衡好之后，放出缓冲液， 使缓冲液接近柱床的平面。 取3ml样品，用滴管沿管壁轻轻 加入，待样品完全进入柱床后， 再加缓冲液。开始洗脱。 加样后立即开始收集。
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蛋白质含量的计算公式
蛋白质含量（mg/ml） = 1.45×A280-0.74 ×A260
酶活力的计算公式
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简化的方法测定速度
只用不同底物浓度下反应的初速 度作为反应的速度，测定反应的 初速度只需要反应进行10分钟就 可以了。 所用的方法就是我们测定酶活力 的方法。
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测定Vmax和KM
以A275对时间做 图，用所得的斜 率计算反应速 度。 所得的速度是在 这个底物浓度下 的反应速度。 用相同的方法测 定其他底物浓度 下的反应速度。 A275 A275 vs Time
斜率
0'
10'
20'
30'
40' 50' 60'
Time
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余下的样品分装在几个透析袋中， 在0.002M pH6.0的磷酸缓冲液中透 析5小时，透析温度为4℃。 将透析过的上清液转入离心管； 离心：12 000rpm，20分，4 ℃ 离心后测量上清液的体积。 这一步得到的样品为样品2，反映了 样品在透析这一步的状态。 将样品2分装，-20℃保存备用。
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凝胶装柱
已经冲洗好的凝胶倒掉一些水， 用玻棒搅起，灌入层析柱中。后 面可以用滴管装柱。 装好的柱床应该均匀，不断裂， 没有气泡。
讲义中要求一次装好，并不是说要把所有的 凝胶一次倒入柱子中，而是说，在装柱的同 时，不要安排其他的工作，装好柱子以后， 再去做其他的工作。
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酶活力（U/ml）= A275/0.0145 ×稀释倍数 10分钟
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酶活力测定1
样品
2%酪蛋白 EDTA-Cys缓冲液 酶液 三氯乙酸 1.5ml 0.5ml 保温10分钟 0.1ml 反应10分钟 2.5ml
对照
1.5ml 0.5ml
2.5ml 酶液 0.1ml
静置30分钟后过滤
测定样品3的体积、蛋白质浓 度、酶活力，计算比活力， －20℃保存备用。
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米氏常数的测定
配制不同浓度的底物； 测定不同底物浓度下的反应 速度； 计算KM和Vmax 。
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配制底物
用0.025 M pH7.2的磷酸缓冲液配 制8个不同浓度的底物。 配制时要计算好需要的底物和缓 冲液的量，分别加入，混匀。
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果实菠萝蛋白酶 活力单位的规定
在35℃ pH7.2条件下，果实菠 萝蛋白酶水解酪蛋白所产生 的溶于三氯乙酸的小肽在 275nm的吸收为0.0145，定为 1个单位（unit U）。
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凝胶过滤的原理
葡聚糖凝胶是一些小珠，具有交联的网 状结构。 混合的蛋白质溶液通过这些小珠时，大 分子不能进入网格，直接从小珠的间隙 中流出。小分子可以进入网格，减慢了 流出的速度。 可以根据分子量把不同大小的蛋白质分 开。
3
分离纯化
称 取 果 实 菠 萝 蛋 白 酶 20g ， 用 0.002M pH6.0磷酸缓冲液100ml溶解，放置15分 钟后，离心。 离心：12 000rpm，20分， 4℃ 。 离心结束后，记录上清液的体积。 留一部分溶液作为样品1，-20℃保存备 用。样品1反映的是酶在溶解时的状态。
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果实菠萝蛋白酶 米氏常数的测定
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目的
学习凝胶过滤的方法 学习酶促动力学的测定
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1
测定果实菠萝蛋白酶 酶活力的原理
果实菠萝蛋白酶可以将蛋白质底物水解 成大小不同的片段。加入三氯乙酸后， 较大的片段形成不溶性沉淀，较小的片 段可以溶解在三氯乙酸中。 这些溶于三氯乙酸的小肽在275nm有吸 收，测定蛋白酶水解液在275nm的吸收就 可以计算出酶的活力。
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洗脱曲线
用所得到的数据作图，作出洗脱 曲线。
蛋白质的曲线和酶活力曲线要画 在一个图中。
横坐标是管号，纵坐标用双坐 标：一个纵坐标是Βιβλιοθήκη Baidu白质的含 量；一个纵坐标是酶的活力。
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6
合并洗脱液
根据洗脱曲线，合并具有酶活 力的洗脱液，这就是样品3。
样品3反映了酶纯化的情况。
4
上样、收集
柱子平衡好之后，放出缓冲液， 使缓冲液接近柱床的平面。 取3ml样品，用滴管沿管壁轻轻 加入，待样品完全进入柱床后， 再加缓冲液。开始洗脱。 加样后立即开始收集。
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蛋白质含量的计算公式
蛋白质含量（mg/ml） = 1.45×A280-0.74 ×A260
酶活力的计算公式