蛋白质纯化实验指导书

电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书

（实验）课程名称：生物大分子纯化技术

电子科技大学教务处制表

目录

实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3 附：大肠杆菌感受态菌制备（CaCl2法） 4 质粒提取 5 实验二、IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达及纯化9 实验三、重组卤醇脱卤酶含量、纯度及活力检测17

实验二IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达及纯化

一、实验目的

1. 掌握重组蛋白体外表达的方法及原理，了解不同表达体系的各自特点;

2. 掌握蛋白质纯化技术及原理。

二、实验原理

卤醇脱卤酶是一类催化短链脂肪族邻卤醇化合物水解的酶，可以将卤醇底物转变为相应的环氧化物和卤离子。而这些被水解的卤素化合物大部分是应用于工业上的碳氢化合物被卤化而形成的环境污染物。因此，卤醇脱卤酶越来越受到研究者的重视。为了进一步研究卤醇脱卤酶的性质，我们将重组的卤醇脱卤酶HheC质粒转入大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中进行原核表达，经IPTG诱导进行重组蛋白体外表达。

（一）IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达

pGEF质粒是由pET和pGEM以及pBR322质粒的不同部分拼接得到。其全长约有4936bp左右，结构简单，含有一个Amp的抗性标记，和T7的高表达效率启动子。这种启动子不能被大肠杆菌的RNA聚合酶所识别，因此当宿主缺乏T7RNA聚合酶时，重组质粒中的外源基因片段是不能表达的。为了使外源基因表达，重组质粒必须转入携带有T7RNA聚合酶的宿主大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中。这种宿主菌的RNA聚合酶基因位于lacUV5启动子下游，受其调控。在没有诱导物时，阻遏物与lacUV5启动子结合，阻止RNA聚合酶转录；在添加了乳糖或乳糖类似物IPTG时，阻遏物与诱导物结合，解除了对lacUV5启动子的阻遏，RNA聚合酶得以表达并与T7启动子结合，从而启动了外源基因的转录和翻译。这种结构使pGEFHhes可以稳定的存在于宿主细胞中, 重组蛋白质在IPTG诱导下便可以高效表达。目的蛋白可以通过硫酸铵沉淀和离子交换层析技术与细胞中其他杂蛋白分离开来。

（二）离子交换层析

将阴离子交换树脂（本身带正电荷）颗粒填充在层析管内，当带负电荷的蛋白质(pH>pI)就被吸引，但由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。然后再用含阴离子（如Cl-)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加Cl-浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离。因而用高

浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白质一般不引起蛋白质变性，故常用于分离各种天然蛋白质。

（三）凝胶过滤层析

也称为凝胶层析(Gel chromatography)、排阻层析(eclusion chromatography)或分子筛层析(molecular sieve chromatography)。其分离分离机制是按分子大小不同进行分离的一种方法。在分离过程中，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，且在凝胶中经过的路程长，因而最后流出；而大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在凝胶中经过的路程短，在颗粒之间迅速通过，因而最先出峰。

10 mM Tris/SO4 buffer (pH 7.5) containing 1 mM -mercaptoethanol and 100 mM NaCl.

三、实验仪器和试剂

1．锥形瓶，烧杯，试管，恒温摇床，层析柱，超生破碎仪，铁架台，离心机，玻璃棒，比色杯，分光光度计。

2．试剂

1)LB液体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl10g溶于950ml双蒸水中，用

10mol/LNaOH调pH至7，补双蒸水至1000ml，高压湿热灭菌30分钟，然后4℃保存备用。

2)LB固体培养基：按上述方法配制液体培养基，每100ml加入1.5g琼脂粉，高压湿

热灭菌30分钟，当温度降至45-50℃，无菌操作加入Amp至终浓度100mg/ml。迅速倒入已灭菌的平皿，制成Amp平板。普通平板不加Amp，直接倒平板，凝固后用保鲜膜封好，4℃保存备用。

3)IPTG溶液：1g的IPTG溶于10ml双蒸水中，过滤除菌，分装在10个1.5ml的

离心管中。-20℃闭光保存备用。

4)抗生素溶液：氨卞青霉素（以下均简写为Amp）购自Sigma公司，以无菌双蒸水

配制成100mg/ml的储液，过滤除菌，-20℃保存。

5)平衡缓冲液A（pH7.5）：Tris碱1.21g，β－巯基乙醇70μl，甘油100ml，硫酸调pH

至7.5，水定至1000ml。

6)洗脱缓冲液B（pH7.5）：Tris碱1.21g，β－巯基乙醇70μl，甘油100ml，硫酸氨59.4g，

硫酸调pH至7.5，水定至1000ml。

7)SephadexG-100型凝胶。

四、实验操作

1．重组蛋白的高效诱导表达

1)将平皿(含Amp)生长的含有目的基因的pGEFHheC转化大肠杆菌E. coli

BL21(DE3)菌株，挑取阳性克隆。

2)接入3ml含Amp（100μg/ml）的LB培养基，37℃，180-200rpm震荡培养至OD600

为0.4左右。

3)取300μl菌液转入250ml含Amp（100μg/ml）的LB培养基中，20℃，180-200rpm

过夜培养16小时至OD600为1.0左右。

4)加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度为0.4mM，进行诱导3小时。

5)4000g离心15分钟收集上述诱导的菌液，弃上清。加入等体积的10 mM Tris-SO4

重新悬浮菌体，重复步骤5）1次。

6)沉淀重悬于5-10ml平衡缓冲液A中，轻轻摇动使菌体悬浮。

7)用超声破碎仪冰浴破碎菌液，30%振幅破碎8秒，暂停6秒，连续超声15-30个循

环，至溶液较清亮为止。

8)10000g离心40分，收集上清（粗提液）。

2．Q-Sepharose阴离子交换层析法纯化卤醇脱卤酶（分组操作）

1)装柱：（自己完善）

2)上样: （自己完善）

3)洗脱:采用阶段洗脱法。可以采用10%，20%，30%，40%，50% 缓冲液B进

行洗脱并收集组分（每管2-5ml）。并通过比色法检测酶活力确定目的蛋白洗脱峰的位置。

3．凝胶过滤层析法纯化卤醇脱卤酶（分组操作）

1)凝胶的处理：将称好的干粉倾入过量的洗脱液（一般多用水，盐溶液或缓冲溶液）

中，室温下放置，使之充分溶胀。注意不要过分搅抖，以防颗粒破碎。溶胀时间