扫描共聚焦显微镜原理及应用
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LSCM的起源
LSCM的发展
1977 年,Wilson 在前人研究的基 础上,结合构成共聚焦成像的几何学 的基础理论，首次描述了光与被照 明物体的原子之间的非线性关系和 激光扫描器的拉曼光谱学。1978 年，Brankenhoff 等发明了一种有 着较高数值孔 径的透镜，并将这种 高数值孔径的透镜应用在激光 共聚 焦显微镜上。
——前言
目录
LSCM 的发展历史 LSCM 的原理和构造 LSCM 的优势及缺点
LSCM 的应用 结论与展望
1
那些
历史 伟大技术
被人忽视的
共聚焦显微镜的发明起源于 1957 年,Minsky Marvin 首次 在他的专利中阐明了激光扫描共 聚焦显微镜技术的某些基本工作 原理。1967 年,Egger 第一次成 功地用共聚焦显微镜产生了一个 光学横断面。它的成功源自尼普 科夫盘的发明和拉曼光谱学理论 的建立。
荧光与透射光通道的叠加。Bar = 100 μm、
LSCM 的优势 其他
LSCM
ZOOM 功能最大限度发挥物镜分辨率
共聚焦还可以在不改变物镜的情况下对标本进行放大扫描，只要数值孔径足够，就可以反映物镜的最 佳分辨率,且放大后的图像与用高放大率、低数值孔径物镜直接获取的无放大图像效果是一样的。
可做局部光操作
种子的激光共聚焦连续光学切片和三维重建图。
LSCM 的优势 可光学切片、三维重建
LSCM
可以将这些连续的光学切片扫描图,通过 LSCM 软件进行三维重建,得到其三维立体结构，从而能十分灵活 、直观地进行形态学观 察 ,并揭示亚细胞结构的空间关系 。种子的三维多视角旋转图中，不仅能看出种子侧面的形状和结构,还增加了三维的观赏性 。
LSCM 的缺点
LSCM
主要是常用激光激发谱线较少，激光谱线非常狭窄而且紫外区的激 光器非常贵。
激光照射的辐射强度过高，对活细胞或组织的杀伤严重。
在激光照射下许多荧光染料分子会产生单态氧或自由基等细胞毒素 作用。
原理及结构
探测针孔的作用示意图
LSCM
只有焦平面上的点所发出的光 才能透过出射小孔；焦平面以 外的点所发出的光线在出射小 孔平面是离焦的，绝大部分无 法通过中心的小孔。因此，焦 平面上的观察目标点呈现亮色 ，而非观察点则作为背景呈现 黑色，反差增加，图像清晰。 在成像过程中，出射小孔的位 置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭 conjugate）,因而被称为共聚 焦（con-focal）显微技术
LSCM 通过在激光整合器后部引入声光调制滤光片系统，可同时分别控制各个波段激光的照射强度 或 者同一波段激光在任意时间的照射强度。因此，可对图像上特定的区域进行扫描成像 。
检测过程快、效果更灵敏、定位更准确
LSCM 由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧 光淬灭作用很小。可将很微弱的荧光信号放，只要有信号 就能被检测到。不仅可以定位到细胞水 平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平。
3
那些 选择 我们应该 了解的
LSCM 的优势 抑制图像的模糊、获得清晰的图像
LSCM
葵科花粉普通荧光显微镜( a) 与激光共聚焦荧光显微镜( b) 成像的对比。Bar = 20 μm
LSCM 的优势 可光学切片、三维重建
LSCM
LSCM 可通过马达的载物台对样品沿着 Z 轴上下移动进行控制调节扫描，使样品能够在 Z 轴上的不同层面得到连续断层扫描图， 即光学切片。它可以逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的二维光学图像投影，从而得到一系列层面信息，即二维图像。
原理及结构
LSCM
光学成像系 统
扫描系统
计算机系统
激光器
显微成像系统
激发滤光片
扫描控制器
计算机
Z轴 X-Y调节 共聚焦针孔 光电倍增管 激光强度
存储 显示 三维构建 数据分析
LSCM 基本结构
LSCM 是在传统的光学显微镜 基础上加装了激光扫描装置， 利用激光扫描束通过针孔形成 点光源，在焦平面上逐点扫描 ，采集点的光信号通过探测针 孔聚集后，被光电倍增管( PMT) 探测收集,经过信号处理 ，输出到计算机上成像。
1987 年，White 等用免疫荧 光标记法使得胚胎的大分子物 质成功显示，这标志着 LSCM 已经成为进行科学研究的重要 工具
LSCM的成熟
2
那些 细微 技术背后 不为人知的
原理及结构
共聚焦显微镜简化原理图
LSCM
用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射 小孔(light source pinhole)被二向色镜 (Dichroic mirror)反射，通过显微物镜 (Objective lens)汇聚后入射于待观察的 标本(specimen)内部焦点(focal point) 处。激光照射所产生的荧光 (fluorescence light)和少量反射激光一 起，被物镜重新收集后送往二向色镜。 其中携带图像信息的荧光由于波长比较 长，直接通过二向色镜并透过出射小孔 (Detection pinhole)到达光电探测器 (Detector)（通常是光电倍增管（PMT ）或是雪崩光电二极管（APD）），变 成电信号后送入计算机。而由于二向色 镜的分光作用，残余的激光则被二向色 镜反射，不会被探测到。
激光共聚焦显微镜的原理及应用
张毅然 31159908
激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是目前应用最广泛和光学图像分辨率最高的分 子细胞生物学分析仪器，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用 计算机进行图像处理，使用紫外光或可见光区激发荧光探针，得到细胞或组织内部 微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察 pH 值、钙离子、膜电位等生理信息及 细胞形态的变化，是分子细胞生物学研究领域中的新工具 。
种子的三维多视角旋转图
LSCM 的优势 可光学切片、三维重建
LSCMBaidu Nhomakorabea
花粉三维多视角动态图
LSCM 的优势 实时多通道荧光,提供定位和定量分析
LSCM
LSCM 与传统场式显微镜不同，它可以同时获 取和显示多标记荧光,能一次观察不同信息,不同结构组 分定位及定量分析；并能获得荧光和透射光通道( diascoptic lighting channel,DIC) 叠加的图片。
LSCM的发展
1977 年,Wilson 在前人研究的基 础上,结合构成共聚焦成像的几何学 的基础理论，首次描述了光与被照 明物体的原子之间的非线性关系和 激光扫描器的拉曼光谱学。1978 年，Brankenhoff 等发明了一种有 着较高数值孔 径的透镜，并将这种 高数值孔径的透镜应用在激光 共聚 焦显微镜上。
——前言
目录
LSCM 的发展历史 LSCM 的原理和构造 LSCM 的优势及缺点
LSCM 的应用 结论与展望
1
那些
历史 伟大技术
被人忽视的
共聚焦显微镜的发明起源于 1957 年,Minsky Marvin 首次 在他的专利中阐明了激光扫描共 聚焦显微镜技术的某些基本工作 原理。1967 年,Egger 第一次成 功地用共聚焦显微镜产生了一个 光学横断面。它的成功源自尼普 科夫盘的发明和拉曼光谱学理论 的建立。
荧光与透射光通道的叠加。Bar = 100 μm、
LSCM 的优势 其他
LSCM
ZOOM 功能最大限度发挥物镜分辨率
共聚焦还可以在不改变物镜的情况下对标本进行放大扫描，只要数值孔径足够，就可以反映物镜的最 佳分辨率,且放大后的图像与用高放大率、低数值孔径物镜直接获取的无放大图像效果是一样的。
可做局部光操作
种子的激光共聚焦连续光学切片和三维重建图。
LSCM 的优势 可光学切片、三维重建
LSCM
可以将这些连续的光学切片扫描图,通过 LSCM 软件进行三维重建,得到其三维立体结构，从而能十分灵活 、直观地进行形态学观 察 ,并揭示亚细胞结构的空间关系 。种子的三维多视角旋转图中，不仅能看出种子侧面的形状和结构,还增加了三维的观赏性 。
LSCM 的缺点
LSCM
主要是常用激光激发谱线较少，激光谱线非常狭窄而且紫外区的激 光器非常贵。
激光照射的辐射强度过高，对活细胞或组织的杀伤严重。
在激光照射下许多荧光染料分子会产生单态氧或自由基等细胞毒素 作用。
原理及结构
探测针孔的作用示意图
LSCM
只有焦平面上的点所发出的光 才能透过出射小孔；焦平面以 外的点所发出的光线在出射小 孔平面是离焦的，绝大部分无 法通过中心的小孔。因此，焦 平面上的观察目标点呈现亮色 ，而非观察点则作为背景呈现 黑色，反差增加，图像清晰。 在成像过程中，出射小孔的位 置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭 conjugate）,因而被称为共聚 焦（con-focal）显微技术
LSCM 通过在激光整合器后部引入声光调制滤光片系统，可同时分别控制各个波段激光的照射强度 或 者同一波段激光在任意时间的照射强度。因此，可对图像上特定的区域进行扫描成像 。
检测过程快、效果更灵敏、定位更准确
LSCM 由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧 光淬灭作用很小。可将很微弱的荧光信号放，只要有信号 就能被检测到。不仅可以定位到细胞水 平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平。
3
那些 选择 我们应该 了解的
LSCM 的优势 抑制图像的模糊、获得清晰的图像
LSCM
葵科花粉普通荧光显微镜( a) 与激光共聚焦荧光显微镜( b) 成像的对比。Bar = 20 μm
LSCM 的优势 可光学切片、三维重建
LSCM
LSCM 可通过马达的载物台对样品沿着 Z 轴上下移动进行控制调节扫描，使样品能够在 Z 轴上的不同层面得到连续断层扫描图， 即光学切片。它可以逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的二维光学图像投影，从而得到一系列层面信息，即二维图像。
原理及结构
LSCM
光学成像系 统
扫描系统
计算机系统
激光器
显微成像系统
激发滤光片
扫描控制器
计算机
Z轴 X-Y调节 共聚焦针孔 光电倍增管 激光强度
存储 显示 三维构建 数据分析
LSCM 基本结构
LSCM 是在传统的光学显微镜 基础上加装了激光扫描装置， 利用激光扫描束通过针孔形成 点光源，在焦平面上逐点扫描 ，采集点的光信号通过探测针 孔聚集后，被光电倍增管( PMT) 探测收集,经过信号处理 ，输出到计算机上成像。
1987 年，White 等用免疫荧 光标记法使得胚胎的大分子物 质成功显示，这标志着 LSCM 已经成为进行科学研究的重要 工具
LSCM的成熟
2
那些 细微 技术背后 不为人知的
原理及结构
共聚焦显微镜简化原理图
LSCM
用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射 小孔(light source pinhole)被二向色镜 (Dichroic mirror)反射，通过显微物镜 (Objective lens)汇聚后入射于待观察的 标本(specimen)内部焦点(focal point) 处。激光照射所产生的荧光 (fluorescence light)和少量反射激光一 起，被物镜重新收集后送往二向色镜。 其中携带图像信息的荧光由于波长比较 长，直接通过二向色镜并透过出射小孔 (Detection pinhole)到达光电探测器 (Detector)（通常是光电倍增管（PMT ）或是雪崩光电二极管（APD）），变 成电信号后送入计算机。而由于二向色 镜的分光作用，残余的激光则被二向色 镜反射，不会被探测到。
激光共聚焦显微镜的原理及应用
张毅然 31159908
激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是目前应用最广泛和光学图像分辨率最高的分 子细胞生物学分析仪器，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用 计算机进行图像处理，使用紫外光或可见光区激发荧光探针，得到细胞或组织内部 微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察 pH 值、钙离子、膜电位等生理信息及 细胞形态的变化，是分子细胞生物学研究领域中的新工具 。
种子的三维多视角旋转图
LSCM 的优势 可光学切片、三维重建
LSCMBaidu Nhomakorabea
花粉三维多视角动态图
LSCM 的优势 实时多通道荧光,提供定位和定量分析
LSCM
LSCM 与传统场式显微镜不同，它可以同时获 取和显示多标记荧光,能一次观察不同信息,不同结构组 分定位及定量分析；并能获得荧光和透射光通道( diascoptic lighting channel,DIC) 叠加的图片。