胡萝卜愈伤组织诱导

胡萝卜愈伤组织的诱导

摘要:以胡萝卜直根为外植体,进行植物组织培养，并探讨解决胡萝卜组织培养不易成功的因素。先后进行了两次实验,研究了不同的植物生长调节剂(2,4-D、6-BA)对胡萝卜脱分化形成愈伤组织速度的影响。实验结果表明在母液中加入2,4-D(2.2 mg/L)效果最好,优于加入6-BA(0.5mg/L)+ 2,4-D(1.0mg/L)。

关键词：胡萝卜；愈伤组织；激素

一、引言

19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物学家哈伯兰特在细胞学说的基础上，大胆提出要在试管中人工培育植物。他预言离体的植物细胞具有发育上的全能性，能够发育成为完整的植物体。这种细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。

植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。

植物组织培养新技术在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面有着良好的前景以及研究热点。在植物育种上的应用：单倍体育种，离体胚培养和体外受精，细胞融合，基因转化，培养细胞突变体、在植物脱毒和快速繁殖上、在人工种子和种质保存方面、在提取植物次生产物生产上、在植物免疫方面的皆能有其应用。

外植体在培养过程中切口产生的多酚类物质被氧化成褐色的醌类物质,这就是褐变现象。目前已在许多植物组织培养中发现有褐变现象,尤以木本植物组织培养中褐变严重。褐变现象主要发生在外植体,外植体的部位不同,取材时期不同,褐变程度亦不同,如油棕用幼嫩器官或组织,胚等作外植体进行培养,褐变较轻,而用高度分化的叶片作外植体,接种后很容易褐变。选择适当的外植体进行预处理之后,选择适宜的培养基,在黑暗或弱光下进行培养,并在培养基中加入活性碳可以防止细胞褐变的发生和发展;在外植体接种后1-2天既转移到新鲜培养基上,使细胞在褐化之前及时转移可以大大减轻或避免褐化。

胡萝卜营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培。从20世纪初到近几年，胡萝卜一直是科研人员的主要研究对象。同一基因型的不同外植体其愈伤组织的发生能力有明显差异，这与不同外植体的分化程度和脱分化能力不同有关。近年来的研究表明，以胡萝卜下胚轴为外植体出愈率要高于子叶和贮藏根。

植物组织培养首先不仅可以生产大量良性系，而且可以获得人类需要的多种代谢物质；其次，细胞融合可打破种属间的界限，客服远缘杂交不亲和性障碍，在植物新品种的培养和种性的改良中发挥着巨大的作用；再次，还可获得单倍体，三倍体及其他多倍体，非整倍体;最后，组织培养的植物细胞液成为在细胞水平上分析研究的理想材料。

二.材料和方法

（一）试剂器材

①实验材料: 胡萝卜直根。

②试剂：MS培养基，2,4-D，6-BA，无菌水，70%酒精，5%次氯酸钠溶液，吐温

③器材：耗材：培养皿，锥形瓶，棕色试剂瓶，滤纸，镊子，解剖刀，烧杯，量

筒，玻璃棒，酒精灯，移液管，移液枪，容量瓶，离心管。

仪器：超净台，高压灭菌锅，pH测定仪。

（二）方法

①MS培养基的配制（1L）

母液I ，MS扩大200倍定容于250ml容量瓶中，配1L培养基取5ml。

母液II，MS扩大200倍定容于250ml容量瓶中，配1L培养基取5ml。

母液Ⅲ，MS扩大200倍定容于250ml容量瓶中，用棕色试剂瓶装。配1L培养基取5ml。

母液Ⅳ，MS扩大40倍定容于250ml容量瓶中，配1L培养基取25ml。

母液Ⅴ，MS扩大40倍定容于250ml容量瓶中，配1L培养基取25ml。

母液Ⅵ，MS扩大40倍定容于250ml容量瓶中，配1L培养基取25ml。

其他有机物母液：

激素母液

配制：在1 L的搪瓷量杯中加入400ml左右蒸馏水，用移液枪或移液管从各种母液中分别取出所需的用量,放入搪瓷量杯中。分别称取琼脂粉8 g和蔗糖30 g，也放入搪瓷量杯中，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。

②调节MS培养基的pH

待培养基稍冷却后，用pH测定仪测量其pH，并用NaOH（1 mol/L）和HCL（1 mol/L）调节pH至5.8.

③培养基的分装

将培养基重新加热至半透明状，然后将培养基倒入锥形瓶中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。培养基分装完毕后，用棉塞塞紧，用牛皮纸封盖，并用线绳

捆扎。最后在锥形瓶外壁贴上标签。

④高压灭菌

将包扎好的装有培养基的锥形瓶，一个大号棕色试剂瓶，装有滤纸片并用报纸包好的培养皿，一瓶蒸馏水等放入高压灭菌锅中灭菌20min到30min。灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。

⑤在接种开始前将胡萝卜洗干净，在流水下冲洗1h后除去表皮以及木质部，将胡萝卜外植体切成4cm*1cm*1cm的段待用。

⑥消毒

将锥形瓶、酒精灯、手术刀、镊子等实验用具及试剂放入超净台，将切好的外植体装在培养皿内也放入超净台，关上门，紫外消毒半小时。

⑦接种

⑴操作超净台前，用装有70%酒精的喷壶消毒双手。

⑵酒精棉球消毒台面。

⑶点燃酒精灯。

⑷将一滴吐温加入到5%次氯酸钠溶液中，用玻璃棒搅拌均匀。

⑸取一烧杯，倒入70%乙醇，将器具放入消毒。

⑹取一棕色试剂瓶，用酒精灯消毒瓶口，将外植体放入瓶内。

⑺将70%乙醇倒入棕色瓶内，消毒15s（过程中要振荡）。

⑻用无菌水洗一次。

⑼用次氯酸钠消毒10-15min（振荡），此过程中将培养基上的牛皮纸拆下。

⑽倒去次氯酸钠，用无菌水洗三到五次。

⑾将培养皿置于倒置大烧杯上进行操作。在培养皿中的滤纸片上将胡萝卜外植体切成7mm*5mm*5mm的块，放入锥形瓶中。每瓶放5-6块。过程中要注意将镊子及手术刀蘸取酒精在酒精灯火焰上消毒，培养皿中的滤纸片也要及时更换。

⑿接种完毕后将所有锥形瓶放入恒温培养箱培养，设置为25℃，湿度70%，无光照。

三、实验结果