胡萝卜愈伤组织诱导

胡萝卜愈伤组织的诱导
摘要:以胡萝卜直根为外植体,进行植物组织培养，并探讨解决胡萝卜组织培养不易成功的因素。

先后进行了两次实验,研究了不同的植物生长调节剂(2,4-D、6-BA)对胡萝卜脱分化形成愈伤组织速度的影响。

实验结果表明在母液中加入2,4-D(2.2 mg/L)效果最好,优于加入6-BA(0.5mg/L)+ 2,4-D(1.0mg/L)。

关键词：胡萝卜；愈伤组织；激素
一、引言
19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。

1902年，德国植物学家哈伯兰特在细胞学说的基础上，大胆提出要在试管中人工培育植物。

他预言离体的植物细胞具有发育上的全能性，能够发育成为完整的植物体。

这种细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。

1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。

植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。

植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。

狭义是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。

植物组织培养新技术在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面有着良好的前景以及研究热点。

在植物育种上的应用：单倍体育种，离体胚培养和体外受精，细胞融合，基因转化，培养细胞突变体、在植物脱毒和快速繁殖上、在人工种子和种质保存方面、在提取植物次生产物生产上、在植物免疫方面的皆能有其应用。

外植体在培养过程中切口产生的多酚类物质被氧化成褐色的醌类物质,这就是褐变现象。

目前已在许多植物组织培养中发现有褐变现象,尤以木本植物组织培养中褐变严重。

褐变现象主要发生在外植体,外植体的部位不同,取材时期不同,褐变程度亦不同,如油棕用幼嫩器官或组织,胚等作外植体进行培养,褐变较轻,而用高度分化的叶片作外植体,接种后很容易褐变。

选择适当的外植体进行预处理之后,选择适宜的培养基,在黑暗或弱光下进行培养,并在培养基中加入活性碳可以防止细胞褐变的发生和发展;在外植体接种后1-2天既转移到新鲜培养基上,使细胞在褐化之前及时转移可以大大减轻或避免褐化。

胡萝卜营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培。

从20世纪初到近几年，胡萝卜一直是科研人员的主要研究对象。

同一基因型的不同外植体其愈伤组织的发生能力有明显差异，这与不同外植体的分化程度和脱分化能力不同有关。

近年来的研究表明，以胡萝卜下胚轴为外植体出愈率要高于子叶和贮藏根。

植物组织培养首先不仅可以生产大量良性系，而且可以获得人类需要的多种代谢物质；其次，细胞融合可打破种属间的界限，客服远缘杂交不亲和性障碍，在植物新品种的培养和种性的改良中发挥着巨大的作用；再次，还可获得单倍体，三倍体及其他多倍体，非整倍体;最后，组织培养的植物细胞液成为在细胞水平上分析研究的理想材料。

二.材料和方法
（一）试剂器材
①实验材料: 胡萝卜直根。

②试剂：MS培养基，2,4-D，6-BA，无菌水，70%酒精，5%次氯酸钠溶液，吐温
③器材：耗材：培养皿，锥形瓶，棕色试剂瓶，滤纸，镊子，解剖刀，烧杯，量
筒，玻璃棒，酒精灯，移液管，移液枪，容量瓶，离心管。

仪器：超净台，高压灭菌锅，pH测定仪。

（二）方法
①MS培养基的配制（1L）
母液I ，MS扩大200倍定容于250ml容量瓶中，配1L培养基取5ml。

母液II，MS扩大200倍定容于250ml容量瓶中，配1L培养基取5ml。

母液Ⅲ，MS扩大200倍定容于250ml容量瓶中，用棕色试剂瓶装。

配1L培养基取5ml。

母液Ⅳ，MS扩大40倍定容于250ml容量瓶中，配1L培养基取25ml。

母液Ⅴ，MS扩大40倍定容于250ml容量瓶中，配1L培养基取25ml。

母液Ⅵ，MS扩大40倍定容于250ml容量瓶中，配1L培养基取25ml。

其他有机物母液：
激素母液
配制：在1 L的搪瓷量杯中加入400ml左右蒸馏水，用移液枪或移液管从各种母液中分别取出所需的用量,放入搪瓷量杯中。

分别称取琼脂粉8 g和蔗糖30 g，也放入搪瓷量杯中，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。

最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。

②调节MS培养基的pH
待培养基稍冷却后，用pH测定仪测量其pH，并用NaOH（1 mol/L）和HCL（1 mol/L）调节pH至5.8.
③培养基的分装
将培养基重新加热至半透明状，然后将培养基倒入锥形瓶中。

注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。

培养基分装完毕后，用棉塞塞紧，用牛皮纸封盖，并用线绳
捆扎。

最后在锥形瓶外壁贴上标签。

④高压灭菌
将包扎好的装有培养基的锥形瓶，一个大号棕色试剂瓶，装有滤纸片并用报纸包好的培养皿，一瓶蒸馏水等放入高压灭菌锅中灭菌20min到30min。

灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。

⑤在接种开始前将胡萝卜洗干净，在流水下冲洗1h后除去表皮以及木质部，将胡萝卜外植体切成4cm*1cm*1cm的段待用。

⑥消毒
将锥形瓶、酒精灯、手术刀、镊子等实验用具及试剂放入超净台，将切好的外植体装在培养皿内也放入超净台，关上门，紫外消毒半小时。

⑦接种
⑴操作超净台前，用装有70%酒精的喷壶消毒双手。

⑵酒精棉球消毒台面。

⑶点燃酒精灯。

⑷将一滴吐温加入到5%次氯酸钠溶液中，用玻璃棒搅拌均匀。

⑸取一烧杯，倒入70%乙醇，将器具放入消毒。

⑹取一棕色试剂瓶，用酒精灯消毒瓶口，将外植体放入瓶内。

⑺将70%乙醇倒入棕色瓶内，消毒15s（过程中要振荡）。

⑻用无菌水洗一次。

⑼用次氯酸钠消毒10-15min（振荡），此过程中将培养基上的牛皮纸拆下。

⑽倒去次氯酸钠，用无菌水洗三到五次。

⑾将培养皿置于倒置大烧杯上进行操作。

在培养皿中的滤纸片上将胡萝卜外植体切成7mm*5mm*5mm的块，放入锥形瓶中。

每瓶放5-6块。

过程中要注意将镊子及手术刀蘸取酒精在酒精灯火焰上消毒，培养皿中的滤纸片也要及时更换。

⑿接种完毕后将所有锥形瓶放入恒温培养箱培养，设置为25℃，湿度70%，无光照。

三、实验结果
1．我们于2012年11月18日进行了第一次胡萝卜的愈伤组织培养，由于条件所限，一直放在实验室内，直到11月27号才放入恒温培养箱。

在11月30号我们去观看了培养状况。

图片如下（3d）：
由上图可以看出，实验过程中细菌污染严重，且主要在外植体上，培养基上基本没有，没能成功产生愈伤组织（上图左）。

但是我们发现还是有成功长出的，如（上图右），仔细观察还是有一些菌体滋生。

所以我们决定吸取教训进行第二次实验。

2.我们在12月4号完成第二次实验，在之前我们对外植体进行全面的消毒，并且一半的利用2,4-D（2.2mg/L）激素，另外一半用2,4-D(1.0 mg/L)+6-BA（0.5 mg/L）混合激素。

3d后观看是否染菌。

结果如下：
从图中可知，本次没有染菌，但是发现由于灭菌过程太过剧烈，以至于有些外植体的边缘已经被次氯酸和吐温杀死，我们三天后继续观察实验结果(2012年12月10号)，图片如下：
由上图可知，经过六天之后，我们的外植体都有较明显变化，从图中可以明显看出2,4-D （2.2mg/L）的情况好于2,4-D(1.0 mg/L)和6-BA（0.5 mg/L），并且丝毫没有长菌的趋势。

一周后（12月17号）观察图片如下：
由上图可知，外植体愈伤组织长势良好，且2,4-D（2.2mg/L）的情况好于2,4-D(1.0 mg/L)+6-BA（0.5 mg/L）混合的。

过了一周后（12月25号）继续观察，结果如下图：
由上图可知，胡萝卜愈伤组织成功诱导，总体来说，只用2,4-D（2.2mg/L）一种激素的效果好于2,4-D(1.0 mg/L)+6-BA（0.5 mg/L）的效果。

诱导成功瓶数未成功瓶数总数成功率
2,4-D(2.2 mg/L) 9 0 9 100%
2,4-D(1.0mg/L)
8 3 5 37.5%
+6-BA（0.5 mg/L）
（注：诱导成功的2,4-D(2.2 mg/L)比2,4-D(1.0 mg/L) +6-BA（0.5 mg/L）的长势好。

）
四、讨论
1．第一次做胡萝卜愈伤组织培养时，失败的主要原因是细菌感染，且这些光滑半透明的菌落主要集中于外植体上。

事后分析时发现，失败原因主要有：
①超净台在进行紫外灭菌时，日光灯、风机和紫外灯同时打开，由于光修复作
用导致灭菌失败。

②灭菌时使用的棕色试剂瓶不够大，导致用次氯酸钠进行外植体灭菌时振荡不
足，不能彻底灭菌。

③镊子和手术刀片等器具在使用过程中没有经常用酒精灯消毒。

④滤纸片没有及时更换。

2．第二次做胡萝卜愈伤组织培养时，吸取了第一次失败的教训，且查阅了相关资料，改进了灭菌步骤。

主要改进有以下内容：
①在接种开始前将胡萝卜洗干净，在流水下冲洗1h。

②将切好的外植体装在培养皿内也放入超净台紫外消毒半小时。

③在超净台紫外灭菌时，注意了关闭日光灯和风机。

④灭菌时改用了500ml棕色试剂瓶，更容易振荡。

⑤过程中将镊子及手术刀蘸取酒精在酒精灯火焰上消毒，培养皿中的滤纸片也
及时更换。

3．第二次做胡萝卜愈伤组织培养实验结果很成功。

结果讨论如下：
①使用的2,4-D（2.2mg/L）培养基诱导率接近100%，可见诱导效果比较好。

而
使用2,4-D(1.0 mg/L) +6-BA（0.5 mg/L）混合激素的培养基诱导率为37.5%，效果次于2,4-D(2.2 mg/L)。

整体上除一块外植体染菌外，其他均没有染菌。

②由于消毒过度，导致胡萝卜外植体裸露部分被杀死，呈现白色；同时，可以
从实验结果看出，切块较小的外植体由于消毒造成的死亡部分太多，活性不如切块较大的。

从中可以得到的是，消毒时次氯酸钠浓度可适当降低，可改用3%次氯酸钠，且消毒时间不宜过长；外植体上由于消毒死亡的部分可在接种前切去，且接种的外植体不宜过小， 1cm*1cm*5mm大小或许比较适宜，有待验证。

③由于种种原因，恒温培养箱内光照是打开的，导致诱导出的愈伤组织呈现黄
绿色。

根据相关文献，光照对愈伤组织的诱导没有影响,但却进一步阻碍了愈
伤组织的增殖生长[5]。

个人认为，在遇到同样情况时，改进措施可以是用锡纸包裹瓶壁后放入恒温培养箱。

参考文献
[1] 尹文兵, 李丽娟, 黄勤妮, 李艳红. 胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究[J]. 山西师范大学学报(自然科学版), 2004, 18(2): 72-76
[2] 胡蓉．胡萝卜愈伤组织建立中的几个问题探讨[J].川北教育学院学报：自然科学版，1995(2)：7，16．
[3] 杨宁，郭勇．胡萝卜细胞培养产生胡萝卜素的研究[J]．广西植物，1999，19(1)，84—88．
[4]周玲艳，秦华明．胡萝卜悬浮细胞系及高效再生系统的建立[J]．安徽农业科学，2006(16)：3929—3931．
[5]汪洪,夏鸿亮,李校堃等.胡萝卜愈伤组织诱导培养的研究[J].北方园艺,2012,(6):103-105.
[6] /view/6c76b71bc281e53a5802ff2b.html
[7] /view/8c703ba00029bd64783e2ca1.html。