激光扫描共聚焦显微镜技术

1 单张光学切片功能
• 是共聚焦显微镜最基本 的功能 • 可来自单标和多标样本 • 往往采用固定后的组织 或细胞标本；活细胞也 可进行特定时间点的单 张光学切片
vestigial apterous CiD (cyanine 5).
Not just the structure of a single cell, the relationship of adjacent cells at different plane can also be viewed clearly like below:
By collecting a series of images of the specimen at different distances from the lens (focal planes) a through-focus series or “Zseries” can be created.
Calcium Green
Fura Red
10 s
腹足纲一种淡 水螺 Biomphalaria glabrata 血细 胞的钙离子动 态变化 探针： Calcium Green Fura Red
Hertel L.A., Stricker S.A. and Loker E.S. 2000. Calcium dynamics of hemocytes of the gastropod Biomphalaria glabrata: effects of digenetic trematodes and selected bioactive compounds. Invertebrate Biology, v. 119(#1): 27-37.
Hela 细胞 内化 碳纳 米管 过程
Peroxisomes Microtubules DAPI
Peroxisomal aggregation in onion may be involved in membrane production and / or metabolism during cell division
Medicago（苜蓿） cross section of a stem showing lignin（木质素） autofluorescence in blue and chloroplast autofluorescence in red. This image was taken with the Leica AOBS confocal microscope
Basics of conventional fluorescence microscope
1 水银弧光灯 2 中密度滤片 3 光镧 4 场镧 5 激发滤片 6 分光镜（BSP) 7 物镜 8 样品 9,10 发射滤片 11 目镜
Arc Lamp
Fluorescent Microscope
Excitation Diaphragm Excitation Filter
肾上皮细胞有 丝分裂共聚焦 显微镜观察
mCherryH2B _mEmEB3
骨肉瘤细 胞内的内 质网 mEmerald _ER
负鼠肾上皮 细胞内体 EGFP_Endo somes
负鼠肾上皮 细胞内溶酶 体
HeLa细 胞的过 氧化物 酶体
3 光学切片功能
• （细胞CT)，实现三维重建
光点共聚焦
光源和探测器前方都各有一个针孔（照明 针孔和探测针孔）。直径约100-200nm；相对于焦平面上的 光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终同时 聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以 会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光 都被挡在探测孔之外而不能成像。
•
A confocal optical section demonstrates that during telophase, microtubules (red) form a phragmoplast(桶状纺缍体 ) array and peroxisomes (green) aggregate immediately inside these. The DNA in the nuclei is stained blue. Image from Collings et al. (2003).
Lodgepole pine (黑松)
Nature Cell Biology 5, 15 (2003)
Yellow and red fluorescence represents acridine orange-stained secondary cell walls and chloroplastic autofluorescence, respectively. The 3D image was reconstructed from optical sections obtained on a confocal microscope (FV500, Olympus). Scale bar represents 20 μm.
4. 荧光多标记
• 同时进行荧光多标记（物质共存、空间关系定位等）
motor nerve -Cy2 muscle bag fiber-Cy3 Nucleus-DAPI
细胞膜（ AlexaFluor 488）
AlexaFluor 594标记的 单壁碳纳米管 12h at 37°C
透射光通道
重叠图像
透明质酸
Leabharlann Baidu
• The role of hyaluronan in renal stone disease http://www.glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA29/HA29E.html
•
Hyaluronan is expressed by proliferating renal tubular cells in subconfluent cultures (2 days post-seeding). At cell-cell contact (4 days post-seeding) this staining starts to fade away to completely disappear when the tight junctions are assembled (5-6 days post-seeding). The hyaluronan receptor CD44 is also expressed at the luminal surface in subconfluent cultures (2 days post-seeding), at cell-cell contact CD44 is targeted to lateral spaces, whereas at confluence (6 days post-seeding), CD44 is exclusively expressed at basal domains of the plasma membrane.
A focus motor can move the stage in precise increments so that multiple images from consecutive planes can be individually scanned and saved.
步进电机 0.1μm
多重染色样品的观察
共聚焦显微镜的主要优点
• 高分辨率：图像与 对比度增强，使用 短波长的紫外光， 大大提高了分辩率。 • 是普通荧光显微镜 分辨率的1.4倍 （0.51/0.37)
普通荧光显微镜分辨率
共聚焦显微镜分辨率
共聚焦显微镜应用常见错误认识
• 在实际应用中尽管几乎所有标本都采用的 是荧光标记， 但决不能将LSCM认为就是一 种“高质量图像的荧光显微镜”. 共聚焦 显微镜并不总是荧光检测的最好工具。 • 共聚焦显微镜能同时或序贯检测多种荧光 通道，但不能将共聚焦显微镜简单地作为 一种共存研究的工具。
2 细胞显像
• 可用于活细胞或固定细胞的观察、分析
Criteria Limits of illumination Antifade reagent Mountant Highest NA lens Time per image Signal averaging Resolution Fixed Cells Fading of fluorophore Phenylenediamine, etc. Glycerol (n = 1.51) 1.4 Unlimited Yes Wave optics Living Cells Phototoxicity and fading of dye NONE! Water (n = 1.33) 1.2 Limited by speed of phenomenon; light sensitivity of specimen No Photon statistics
1
1
2
2
观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平 面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图 像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生 物学标本是层次区别的重叠结构）。
共聚焦显微镜一次只有样品的小部分区域 被照明，而普通荧光显微镜则有更宽的区 域被照明。
激光扫描共聚焦显微镜成像的基本原理 激光扫描共聚焦显微镜的基本结构 激光扫描共聚焦显微镜的应用 量子点技术及其在生命科学研究中的应用
• 激光扫描共聚焦显微镜技术（Laser scanning Confocal Microscopy，简称LSCM）是近代生物医学图象仪器的最重 要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫 描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机 进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光 图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位 等生理信号及细胞形态的变化。
共聚焦扫描显微镜的成像原理
激光作为光源
采用点光源照射标本，在焦平面上形成 一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜 收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分 光器将荧光直接送到探测器。
扫描方式成像
激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电 倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传 输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚 焦图像。
Ocular
Objective Emission Filter
Confocal Principle
Laser Excitation Pinhole
Excitation Filter
PMT
Objective Emission Pinhole
Emission Filter
Differences between conventional and confocal microscope
Confocal Principle
探测针孔
激光光源
二色镜或分光镜
照明针孔
激光光源
扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、
扫描镜、检测器）
自动显微镜
控制系统（数字信号处理器、计算机）
图象输出设备（显示器、打印机、存储器）
LSCM的基本特点
观察方式
以荧光为主 光源 激光（紫外、 可见光、近 红外） 照明方式 点照明、逐 点扫描 成像方式 共聚焦、逐 点成像 输出 实时观测,数 字化图像， 可以进行图 像处理和定 量分析
• 广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、组织 胚胎学、免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定 性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领 域新一代强有力的研究工具。
有关共聚焦显微镜的某些技术原理，早在1957年就已
提出，20年后由Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改 装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜，1985年Wijnaendts Van Resandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在 生物学中应用的文章，到了1987年，才发展成现在通常意 义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。
共聚焦显微镜真正的威力是依赖于其 强烈抑制焦平面外荧光信号的能力，有很 好的深度分辨能力或光学切片功能。基于 该性质的应用包括: • 样品的显微断层扫描 (microscopic CT) • Z扫描切片的3-D 重建 • 厚样品的分辨率
多通道同时检测，可实时检测细胞的 生理活动和形态变化: • 生理学研究：如细胞内各种离子浓度随时 间的变化情况. • 活细胞多种标记物同时进行成像，动态观 察不同形态学事件的发生。如分泌颗粒的 分泌过程。