毛细管电泳法

毛细管电泳法分离水杨酸、苯甲酸及阿司匹林中的

含量测定

毛细管电泳法分离水杨酸、苯甲酸及阿司匹林中的含量测定

毛细管电泳又称高效毛细管电泳( High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 是一种仪器分析方法。通过施加10-40kV 的高电压于充有缓冲液的极细毛细管，对液体中离子或荷电粒子进行高效、快速的分离。现在，HPCE 已广泛应用于氨基酸、蛋白质、多肽、低聚核苷酸、DNA 等生物分子分离分析，药物分析，临床分析，无机离子分析，有机分子分析，糖和低聚糖分析及高聚物和粒子的分离分析。人类基因组工程中DNA 的分离是用毛细管电泳仪进行的。

毛细管电泳较高效液相色谱有较多的优点。其中之一是仪器结构 简单（见图1）。它包括一个高电压源，一根毛细管，紫外检测器及计算机处理数据装置。另有两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液池。 high-v oltage

power supply Buffer

V ial

Buffer V ial Detector Recording dev ice

capillary

Electrode Electrode

图1 CE 仪器组成示意图

毛细管中的带电粒子在电场的作用下，一方面发生定向移动的电泳迁移，另一方面，由于电泳过程伴随电渗现象，粒子的运动速度还明显受到溶液电渗流速度的影响。粒子的实际流速 V 是电泳流速度 Vep 和渗流速度 Veo 的矢量和。即:

V = Vep + Veo (1)

电渗流是一种液体相对于带电的管壁移动的现象。溶液的这一运动是由硅/水表面的Zeta 势引起的。 CE 通常采用的石英毛细管柱表面一般情况下(pH>3)带负电。当它和溶液接触时，双电层中产生了过剩的阳离子。高电压下这些水合阳离子向阴极迁移形成一个扁平的塞子流，如图2。毛细管管壁的带电状态可以进行修饰，管壁吸附阴离子表面活性剂增加电渗流， 管壁吸附阳离子表面活性

剂减少电渗流甚至改变电渗流的方向。

图2电椮流流速轮廓

毛细管区带电泳(CZE)也称自由溶液电泳, 是HPCE中最基本也是应用最广的一种模式,它是基于分析物表面电荷密度的差别进行分离的。实验中，在毛细管和电解池中充以相同的缓冲液，样品用电迁移或流体动力学法从毛细管一端导入，加入电压后，样品离子在电场力驱动下以不同的电泳速度迁移至检测器端，形成不连续的移动区带分离出来。图3是不同电荷密度的阳离子到达检测端的信号。操作电压、缓冲液的选择及其浓度和 pH 值、进样的电压和时间等都是CZE 操作的重要参量，合理优化选择柱温、分离时间、柱尺寸、进样和检测体积、溶质吸附和样品浓度等也将大大提高柱效。CZE中还可通过改变电渗流的方向来选择分析待测的离子。

图3 不同电荷带点阳离子的迁移速度

本仪器的检测器是UV/vis。UV/vis通用性好，是使用最广泛的一种检测器。由朗伯-比耳定律：

A=lg(I

/I)（2）

式中，A为吸光度，I0为入射光强度，I为经检测物吸收后的透射光强度。在固定的实验条件下，

A=K’c (3)

式(3)就是定量分析的基础。定量方法可用标准曲线法等。小内径毛细管限制了光吸收型检测器的灵敏度。一般检测限不低于10-6mol/L。

本实验测定阿司匹林(乙酰水杨酸)为一常用解热镇痛药,自问世以来的近百

年里，一直是世界上最广泛应用的药物之一。近年来，又被用于预防心血管疾病。游离水杨酸是阿司匹林在生产过程中由于乙酰化不完全而带入或在贮存期间阿司匹林水解产生的。水杨酸对人体有毒性，刺激肠胃道产生恶心、呕吐。

1 实验仪器与试剂

1.1 仪器

高效毛细管电泳（P/ACE MDQ）,配有二极管阵列检测器、毛细管总长度L ＝50cm，有效长度 l＝40.5cm、32 Karat软件控制仪器操作和数据采集(Beckman 公司,美国)、精密pH计（雷磁PHS-3C）、电子分析天平（AL204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司METTLER TOLEDO）。

1.2 试剂

水杨酸(100 ug/ml)、苯甲酸(100 ug/ml)、0.1mol/L氢氧化钠、10 mmol/L

磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(NaH

2PO

4

-Na

2

HPO

4

1:1缓冲溶液(NaH

2

PO

4

和 Na

2

HPO

4

各 5

mmol/L)pH 6.0)、乙醇、甲醇、阿司匹林肠溶片样品（规格：25mg，临汾宝珠制药有限公司）、二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1溶液配制

①20 ug/ml的水杨酸标准溶液：精密量取100 ug/ml水杨酸1ml至5ml容量瓶中，用蒸馏水定容；② 40 ug/ml的苯甲酸和20 ug/ml的水杨酸混合标准溶液：精密量取100 ug/ml水杨酸1ml和100 ug/ml苯甲酸2ml至5ml容量瓶中，用蒸馏水定容；③准确称取0.2001g样品，用乙醇溶解至25mL，用移液管取1ml 至5ml的容量瓶中，用二次水定容稀释5倍。

2.2 测定

将所有溶液（缓冲溶液，氢氧化钠，水，标准，样品）经微孔滤膜后装入小瓶中。毛细管柱在使用前分别用0.1mol/L的氢氧化钠溶液冲洗3min，二次蒸馏水冲洗3min，缓冲溶液冲洗6min，在运行电压平稳6min。以后每次进样前，均用氢氧化钠、水冲柱，在运行电压下平衡5min。本实验采用点迁移进样（25KV、0.5pis）。高端压进样，低端压检测，25KV的工作电压。214nm检测波长。

2.3 方法

2.3.1 标准曲线

配制一系列乙酰水杨酸标准溶液。在10mmol/L NaH

2PO

4

/Na

2

HPO

4

溶液（pH=6）

条件下运行各个溶液。每种溶液分别运行三次，取平均值。以谱图中峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得到的线性回归方程为（峰面积：y( mV·s), 浓度：x( mg/mL)）：y=A+Bx (r=0.9999)，并得到线性范围。

2.3.2 精密度试验

一种标准溶液连续运行五次，考察迁移时间和峰面积的重现性。迁移时间的相对标准偏差(RSD) <2%，校正峰面积的RSD 值为<5%。

2.4 结果记录分析

根据电泳的原理，苯甲酸的pKa=4.3水杨酸的pKa

1=2.98,pKa

2

=12.38缓冲溶

液的pH值为6.0，所以苯甲酸以分子形式存在的百分含量大于水杨酸的分子形式的百分含量，毛细管电泳的出峰顺序为带正电荷的大于中性分子大于带负电荷的，由表1可知单品水杨酸的出峰时间为12.6-12.8min，由表2可知混合标样中t=11.4min时的峰为苯甲酸的峰，t=12.6min时的峰为水杨酸的峰，用标准液出峰时间与未知浓度混合样品中出峰时间进行对比，从而确定混合样品中苯甲酸和水杨酸的峰。