常见皮肤癣菌的基因分型

常见皮肤癣菌的基因分型

【摘要】目的建立快速、简便鉴别4种常见皮肤癣菌(红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌和石膏样小孢子菌)的分子生物学基因分型方法。方法将我室分离培养得到的18株红色毛癣菌、12株须癣毛癣菌、8株絮状表皮癣菌和6株石膏样小孢子菌接种于PDA培养基上培养2周后,分别收集菌丝体并用氯化苄法提取DNA,运用随机扩增多态性DNA分析的方法，以单个引物(GACA)4进行随机扩增。检测聚合酶链反应产物，并根据电泳后指纹图谱的差异进行种属间鉴别。结果同种不同株的皮肤癣菌电泳后指纹图谱相同,不同种皮肤癣菌电泳后指纹图谱有显著差异。结论运用随机扩增多态性DNA分析的方法，可对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌和石膏样小孢子菌的基因型进行快速鉴别,能够协助临床早期诊断。

【关键词】表皮癣菌属基因型随机扩增多态DNA技术实验室技术和方法

［ABSTRACT］ObjectiveTo establish a rapid, reliable method to distinguish common species of dermatophytes. Methods Random amplification of polymorphic DNA (RAPD) and a simple repetitive oligonucleotide (GACA)4 were used to amplify the DNA of Trichophyton rubrum (n=18), Trichophyton mentagrophyte (n=12), Epidermophyton floccosum (n=8) and Microsporum gypseum (n=6)ResultsThe DNA of all the strains of dermatophytes was amplified successfully, producing species specific profiles.

Conclusion The random amplification of polymorphic DNA for identification of common species of dermatophytes is a stable, prompt and sensitive method.ConclusionEpidermophyton；genotype；random amplified polymorphic DNA technique; laboratory technics and procedures.

［KEY WORDS］ epidermophyton; genotype; random amplified polymorphic DNA technique; laboratory technics and procedures 皮肤癣菌是浅部真菌病的主要致病菌种，是一群浅在寄生性真菌，主要侵犯皮肤、毛发和指(趾)甲，寄生或腐生于表皮角质、毛发和甲板的角蛋白组织中。浅部真菌病简称癣，包括体癣、手足癣、头癣、甲癣等，是皮肤科常见病，其发病率、复发率均较高，所以对其主要致病菌种——皮肤癣菌的鉴定是非常必要的。传统的皮肤癣菌鉴定方法主要依据菌落形态、镜下结构特征，必要时辅以必需的鉴别试验。但皮肤癣菌菌落形态多样，容易变异，给鉴定带来了很多困难［1］。近年来，逐渐开展了多种真菌的分子生物学鉴定方法，PCR技术因具有特异性强、敏感性高的特点，很早就被用于深部真菌病的诊断。本文采用随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹图谱分析的方法,从基因型的角度对常见的皮肤癣菌的DNA进行鉴别，以快速稳定区分4种常见皮肤癣菌的基因型。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料及其来源

1.1.1 菌株红色毛癣菌18株，须癣毛癣菌12株，絮状表皮癣

菌8株，石膏样小孢子菌6株，从青岛大学医学院附属医院、青岛市人民医院等5家医院甲癣病人病甲标本中分离培养取得。

1.1.2 试剂 DNA抽提缓冲液按文献［2］方法配制，氯化苄为上海山蒲化工公司产品，TaqDNA聚合酶PCR反应缓冲液以及dNTPS为大连宝生物公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 真菌DNA制备实验菌株于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上28 ℃培养2周，用无菌生理盐水洗涤下菌丝体,研磨后离心得孢子沉淀，用氯化苄法［2］提取基因组DNA。

1.2.2 聚合酶链反应(PCR)扩增以寡核苷酸重复序列(GACA)4为单个引物，反应体系25 μL,其中包括:50 ng模板DNA，2 μL 10×PCR反应缓冲液(不含Mg2+)，0.5 μL dNTPs(10 mmol/L),2 U的TaqDNA聚合酶,2 μL合成引物(10 μmol/L),2 μL MgCl2(25 mmol/L)。反应条件:起始变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 1 min，退火47 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min,37个循环；延伸72 ℃ 6 min。产物于20 g/L琼脂糖凝胶电泳(4.5 V/cm) 1.5 h,紫外线灯下照相观察。

2 结果

从电泳凝胶上可观察到，4种菌株均得到有效扩增,不同种皮肤癣菌产生具有不同特征的电泳带型。其中红色毛癣菌的主要扩增条带有4条，大小分别约590、530、480、350 bp，特征主条带为590、350 bp；须癣毛癣菌主要扩增条带有7条,大小约690、590、540、500、450、390、350 bp,特征主条带为690、590、500 bp共3条；絮状表