糖化酶研究进展
糖化酶的研究进展
糖化酶的研究进展摘要:糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类,介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。
关键词: 糖化酶; 特性; 活力一、糖化酶的简介糖化酶是应用历史悠久的酶类,1 500年前,我国已用糖化曲酿酒。
本世纪2O年代,法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲,并用于酒精生产。
50年代投入工业化生产后,到现在除酒精行业,糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面,是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。
糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)](缩写GA或G), 糖化酶是一种习惯上的名称,学名为α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4-Glucanglucohydrolace).糖化酶是由曲霉优良菌种(Aspergilusniger)经深层发酵提炼而成。
(深层发酵是利用深层培养基的厌氧环境来培养厌氧细菌,但不能培养严格厌氧细菌,多用于兼性厌氧菌和微耗氧菌的培养)重要糖化酶生产菌有:雪白根霉,德氏根霉,河内根霉,爪哇根霉,台湾根霉,臭曲霉,黑曲霉等。
糖化酶是具有外切酶活性的胞外酶。
其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1,4糖苷键,切下一个个葡萄糖单元,并像B一淀粉酶一样,使水解下来的葡萄糖发生构型变化,形成B—D一葡萄糖。
对于支链淀粉,当遇到分支点时,它也可以水解a一1,6糖苷键,由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。
糖化酶也能微弱水解a一1,3连接的碳链,但水解a一1.4糖苷键的速度最快,它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。
二、糖化酶的结构组成及分类糖化酶在微生物中的分布很广,在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得,从细菌中也分离到热稳定的糖化酶,人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。
不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异,对生淀粉的水解作用的活力也不同,真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。
糖化酶的研究进展及趋势
27 Blair H.T.e t al.,Synaptic plasticity in the lateral a mygdala:a cellarhypothesis of fear conditioning.Learning and Me mory,2001;8:227 242 28 Miller R.R.,Matzel L.D.M e mory involves far more than cons olidation .Nature Re views neurosc ie nce,2000;1:214 21629 Kim J.J.,Fanselow M.S.Modality specific retrograde amnesia of fear.Science,1992;256:675 67730 Phillips,R.G.,LeDoux,J.E.Differential contributi on of amygdalaand hippocampus to cued and contextual fear conditioning.Behav.Ne u rosci.,1992;106:274 8531 Selden N.R.,Everi tt B.J.,Jarrard L.E.,Robbins plementary roles for the amygdala and hippocampus i n aversive condi ti oning to explicit and c onte xtual cues.Neuroscience,1991;42:335 5032 Abeliovich A.,Paylor R.,Chen C.,Kim J.J.,Wehner M.,Tonega waS.P KCg mutant mice exhibi t mild deficits in s patial i n spatial and con textual learni ng.Cell,1993;75:1263 7133 Maren S.,Aharonov G.,Fanselo w M.S.Neurotoxic lesi ons of the dorsalhi ppocampus and Pavlovian fear conditioning i n 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-1,3连接的碳链,它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖,因此被广泛地应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸、甘油、淀粉糖等工业中,是我国产量最大的酶制剂产品.一、糖化酶多型性的研究20世纪80年代,对于糖化酶的研究发展极快,主要集中于糖化酶菌株的分离及其纯化工作.长期研究证明,糖化酶广泛地分布在微生物中,主要存在于黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中,同时也存在于人的唾液、动物胰腺及细菌中.已报道的产糖化酶真菌微生物有23个属35个种;细菌有3属3种[1]. 真菌产糖化酶组分多型性是常见的,Rhizo pus nivenus 和Chalara paradoca[2,3]可分别产生5种和6种活性组分.陈冠军、罗贵民等人[4]采用硫酸铵分级沉淀,DEAE-纤维素离子交换层析、Sephadex G-150凝胶过滤等方法,从黑曲霉AS3.4309变异株B-11的发酵液中分离出三种电泳均一的糖化酶G 、G 、G ,其相对分子质量分别为27000、53000和67000;等电点分别为3.38、3.59和3.52;分子含糖量分别为8.7%、18.3%和13.6%;最适温度均为70 ,实验结果证明,三种同工酶都由一条多肽链组成.相对分子质量小的G 具有完整的催化部位结构,而G 和G 多于G 的那部分肽段,则可能起着稳定活性部位和增强结合底物能力的作用.G 比G 多一个约含100个残基的肽段,这个肽段可能是G 能被生淀粉吸附的原因所在.One等[5]利用固相Acarbose 柱从市售糖化酶(A.niger)中分离出六种活性组分,每种活性组分均可从可溶性淀粉中释放出单一的 -D-葡萄糖终产物.这六种组分的相对分子质量、沉降系数、化学组成、等电点、酶的动力学及其他性质上各异.但Ya suda[6]从Monascus s p.NO.3403中分离出两种组分,电泳和超离心结果证明有同质性、相对分子质量、碳氮含量、161自然杂志 25卷3期科技进展最适pH、最适温度及Km值都非常接近.管汉成、严自正、张树政[7]发现黑曲霉突变株T-21产生的葡萄糖淀粉酶也具有多型性,经凝胶电泳和酶活力显色得到5条以上具有淀粉酶活力的蛋白质带,并从中分离纯化出能被生淀粉吸附和水解生淀粉的G A 和既不被生淀粉吸附又不水解生淀粉的GA .方善康和周凤臻[8]对黑曲霉S4的生淀粉糖化酶进行分离,分离出3个均为酸性糖蛋白的G 、G 和G .糖化酶的多型性可能由下述原因引起:一是基因调控、转录的方式不同;二是蛋白质合成的修饰作用不同,即结合糖量不同;三是在发酵过程中受到自身蛋白水解酶和糖苷酶的作用,由糖化酶的原始形式衍变成糖化酶的.此外培养基的成分和生长条件也对糖化酶组分多型性有影响.二、提高糖化酶活力的研究几十年来我国科研工作者为提高糖化酶的活力进行了不懈的努力,常规的物理及化学诱变的方法仍然是方便有效的途径.谷海先等[9]对黑曲霉A N-149菌进行自然分离、紫外线和NTG的复合诱变处理,得到了一株高产糖化酶的菌株WG-93,经30L发酵罐试验,酶活力达29ku/ml(原糖化酶生产发酵水平为12ku/ml).1993年,李俊刚等[10]对生淀粉糖化菌黑曲霉S-1原生质体采用( 1=260nm, 2=266nm)能量为8mJ的激光直接照射,得到高酶活力的生淀粉糖化酶突变株,比出发株酶活力平均提高37.4%,最高突变株酶活力达到74.5 u/ml,比出发株提高91%.1998年,李俊刚等[11]又以黑曲霉523原生质体为对象,经激光、紫外线和亚硝基胍复合诱变,选育出生淀粉糖化酶高产突变株黑曲霉NL-3,其生淀粉酶活力为156u/ml.王海洪等[12]通过分离和筛选,得到一株分解小麦生淀粉能力较强的黑曲霉,其生淀粉糖化酶活力为171.5u/g, -淀粉酶活力为6.347 u/g.DN A重组技术发展以来,有人尝试将糖化酶基因克隆到埃希大肠杆菌和酵母菌中,构建了糖化酶高产工程菌.近几年来,罗进贤等人[13]将酵母Ty转座子的 序列,黑曲霉糖化酶cD NA及G418抗性基因neo重组进酵母整和型质粒Yiplac128获得含LEU2,ne o双标记基因,糖化酶c DNA的高整和型表达载体YI128D.17N,转化CRF18(YI128D.17N)糖化酶基因在该菌株获得高效表达,产物分泌到胞外.吴晓萍等人[14]将切除了5 端非编码区50碱基对片段的黑曲霉糖化酶GA c DNA与大麦 -淀粉酶基因重组进埃希大肠杆菌-酵母穿梭载体,构建重组表达质粒pMAG11,转化酿酒酵母GRF18,获得含 -淀粉酶和糖化酶双基因的酵母工程菌GRF18(p MAG11),在酵母P GK基因启动子和终止信号的调控下, -淀粉酶和糖化酶基因获得高效表达,99%的表达产物分泌至胞外.三、糖化酶的基因的研究对黑曲霉糖化酶基因的研究有了不断的进展,尤其是对其结构基因和调控序列.Boel等[15]首先从黑曲霉的染色体文库中分离出糖化酶的基因,它含有五个内含子,而泡盛曲霉中含有四个内含子.两种微生物都分泌糖化酶GA 、GA ,两种酶都由单一基因编码,有相类似的氨基末端氨基酸序列,在一级结构和C-端序列长度上稍有不同.唐国敏等克隆了突变株T21的糖化酶c DNA,并进行了测序[16],实现了糖化酶基因在酿酒酵母中的表达[17],并将糖化酶基因整合到酿酒酵母的基因组内,实现稳定表达[18],克隆并测定了糖化酶基因启动子区的功能[19],该课题组[20]在1996年以PCR合成的糖化酶高产菌株黑曲霉T21糖化酶基因5 近端非编码区588 bp(Eco-BamHI)的序列为探针,从T21染色体DNA中克隆到近2.0kb的糖化酶基因5 端非编码区序列,并以此序列为探针,从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T21的诱变出发株)的染色体DNA中克隆到1.5kb的糖化酶基因5 端非编码区序列,并从该二序列的分析测定中得到,黑曲霉糖化酶基因5 端非编码区被称为 核心启动子 (core promoter)的TA TA AAT框及GCAAT框,分别在翻译起始点的-109bp及-178bp处,高产和低产菌株糖化酶基因5 端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化.在1998年[21]又对糖化酶高产菌株A.niger T21和原始菌株Aniger3.795的gla A5'上游区的序列进行了分析,证明两者在1.5kb的区域内有九个部位的碱基不同.构建了以T21和3.795gla A基因转录调控区及A.nidulans trpC基因终止子为表达元件的E.colihph基因表达载体(pX H2和pG H1),用pXH2和pG H1分别转化A.niger T21,对两种转化子的HmB抗性水平测定和Southe rn杂交分析显示,在转化子X H2C和G H1C中,pX H2和pGH1以相同拷贝数(2拷贝串联)整合到染色体DNA的相同位置上,XH2C的HmB抗性水平(3000 g/ml)为GH1C(1500 g/ml)的2倍.诱变引起的调控区序列改变使T21黑曲霉糖化酶基因转录调控区的功能水平比3.795提高1倍.国内对糖化酶研究较多的还有关海山等人[22-24],主要研究不同真菌中糖化酶的基因克隆、表达和糖化酶的性质,在挖掘糖化酶资源方面做了大量工作.162 Ziran Zazhi Vol.25No.3科技进展四、扩大糖化酶的应用研究糖化酶是工业上应用最广泛的酶类之一.除了利用糖化酶水解淀粉为葡萄糖而用于制糖业外,现在人们越来越多地开发糖化酶的新型用途.糖化酶在酿酒工业中也有广泛的应用.传统白酒[24]生产用曲中的微生物是依靠自然界带入的,未经筛选,其糖化力较低,耐酸耐热性都较差.糖化酶作用的pH范围为3.0~5.5,最适作用范围为4.0~4.5,这使得白酒酿造过程中酸度不断增加,适宜发酵.糖化酶的应用,使粮醅入酵后发酵升温快,升温幅度大,提高原料的出酒率,缩短发酵周期,降低生产成本.在食用醋[25]生产中,应用TH-AATY和糖化酶,可以解决企业自制酒母质量不稳定和夏季高温等生产难题,使食用醋生产正常进行,它不仅降低了原材料的消耗,减轻了工人的劳动强度,而且显著提高了淀粉利用率和出醋率,得到较好的经济效益.固定化糖化酶应用于糖结晶过程,可以提高糖的出产率[26].今后糖化酶将会被应用于更为广阔的空间.五、糖化酶研究的展望虽然对糖化酶的研究已有多年,但是仍有许多问题尚待进一步探索[27].基础研究领域将主要集中在糖化酶的结构研究,如糖链在糖化酶活性、稳定性及构象状态中所起的作用,进一步阐明糖化酶的多型性原因及糖化酶的热稳定性机制.应用研究之一仍将是进一步提高糖化酶的活力,利用诱变、DNA重组技术或其他方法获得优良菌株,提高糖化酶基因在受体菌中的表达水平等,进一步优化糖化酶纯化工艺及保存条件;另一方面,诱变筛选耐热糖化酶产生菌或克隆耐热糖化酶基因,将是一个重要方向,因为耐热糖化酶在发酵业的应用将会大大降低能源消耗,从而降低生产成本,将给糖化酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景.(2002年10月20日收到)武金霞 在职博士生,副教授,河北大学生命科学学院生物技术系,071002王 沛 河北大学生命科学学院2000级生物技术专业学生李晓明 河北大学生命科学学院2000级生物技术专业学生1 陈启和,何国庆.糖化酶及其基因研究进展.微生物学杂志,2000;20(4):46 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6426 杨依军,李多川,沈崇尧.葡萄糖淀粉酶研究进展.微生物学通报,1996;23(5):312 315Progress and Trend of GlucoamylaseWu Jin xia ,Wang Pei ,Li Xiao mingMaste r,Ph.D.Candidate,Sssoc iate Pro fesso r,De partment o f Biote ch nology,Colle ge o f Li fe Sc ienc e,Hebei U nive rsity,Baoding,Hebe i071002 U nde rgraduate,Colle ge o f Li fe sc ie nce,Hebei U nive rsity,Baoding, He be i071002Key word s glucoamylase,enzyme ac tivity,mul titype,s truc tural gene163自然杂志 25卷3期科技进展。
糖化酶及糖化酶基因在酿酒酵母中表达的研究进展
r g si h ema t gtw rod r , kn o d u e o a e s vn h ea e , ra gn h ee u p n i tn iey a d p vd n h ea t n a e nt l i o e r e y ma i gg o s f p c , a i gt r a ar i gt q i me t n e sv l , n l s n n r i igt uo o mai o t , a d t c n c D r t n c n e in y h e f w d sg f twe y t m on i e t e p n il f b ly g o t , t c n r 1n e h i o e a i o v n e t .T o e in o o r s se c i cd s wi t r cp e o a e r w h c  ̄ l a 0 l l h h i r mea oim . em/a o . ee up n c e k st etc n lgc tg sb ii e r c u aey a d e s r st ep c d r tb l s md g r n t n T q i me t h me ma e h oo ia s e ed vd d mo ea c r tl, i h s h e l a n n ue r e u e h o
高效分泌到酿酒酵母胞 外的研究进展 ; 展望 了糖化酶今后 的研 究方 向以及应 用前景。
关键词: 糖化酶 ; 结构 ; 酒酵母 ; 因表达 酿 基
中图分类号 : S 6 .1 S6 .5 1 T 2 1 ; 2 11; 3 1T Q8 文献标识码: B
收稿 日期 :0 7 O — 2 20一32 作者简介 : 刘喜风 (9 【 )河 南安 阳人 , 18卜 , 中国科 学院微 生物所博 士
根霉固体发酵高产糖化酶发酵条件优化、酶学性质的研究以及应用
技术总结报告根霉固体发酵高产糖化酶发酵条件优化、酶学性质的研究以及应用糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类,根霉在自然界分布很广,用途广泛,其糖化酶活性很强,是酿造工业中常用糖化菌。
我国最早利用根霉糖化淀粉(即阿明诺法)生产酒精。
根霉能生产延胡索酸、乳酸等有机酸,还能产生芳香性的酯类物质。
根霉亦是转化甾族化合物的重要菌类。
现在一般采用的诱变技术来获得高产菌株,例如在酿酒工业中。
此过程中虽然操作简单,但是运用诱变之后的菌株不稳定,容易发生变异,从而产量下降。
从自然条件中筛选产稳定高产根霉,不易变异,更实用于生产。
根霉所产生的糖化酶在白酒酿造、啤酒酿造、冰冻食品生产、饲料生产、食醋酿造中都有较广的应用。
固体发酵培养基单纯,发酵原料成本较经济;基质前处理较液体发酵少,不需特殊机具;因水分少可减少杂菌污染,此种低灭菌步骤即可施行的发酵,适合低技术地区使用;固体发酵相当于使用相当高的培养基,且能用较小的反应器进行发酵,单位体积的产量较液体为高;下游的回收纯化过程及废弃物处理通常较简化或单纯,常是整个基质都被使用,无废弃物的问题;固体发酵可食品产生特殊风味,并提高营养价值。
固体发酵法目前主要用在传统的发酵工业中。
例如:酱油的生产,从菌种培养到制曲,再到发酵都采用固体法。
发酵条件相对比较开放,工艺简单,设备要求简单,成本相对比较低。
虽然最近有的厂家也采用深层液体发酵,但在口味上明显与固体发酵无法比拟。
又如在食醋的生产上有的厂家采用前液后固,目的在于提高食醋的风味。
随着社会的进步,环境问题、食品安全卫生以及能源问题越来越成为人们关注的问题,可持续发展已成为社会经济发展的必然趋势。
作为可再生资源综合利用最有希望的固体发酵技术,是有效解决上述问题的途径之一。
如今科学技术进步越来越快,而作为传统工艺的固体发酵技术却进步较小。
但固体发酵在酿酒等工业生产中的作用却越来越突显。
本项目通过对筛选出的根霉固体发酵高产糖化酶菌株进行条件优化和酶学性质的研究,从而对该高产菌株进行实际应用。
固态法白酒糖化过程中菌群交互作用的研究
固态法白酒糖化过程中菌群交互作用的研究白酒是一种重要的传统发酵食品,其中固态发酵是一种常用的生产工艺。
在固态发酵过程中,糖化是一个关键的步骤,它涉及到多种细菌的相互作用。
本文将探讨固态法白酒糖化过程中菌群交互作用的研究进展,并讨论其对白酒品质和生产效率的影响。
糖化是将淀粉转化为可发酵糖的过程,其具体包括淀粉的水解酶和糖化酶两个阶段。
在传统的固态发酵工艺中,使用的主要微生物包括曲霉和酵母菌。
曲霉产生的淀粉酶能够将淀粉分解为较短的糖链,进而产生可被酵母菌利用的可发酵糖。
酵母菌则使用这些糖来产生酒精和其他有机化合物。
在固态发酵过程中,曲霉和酵母菌之间的相互作用对糖化过程的效率和品质有着重要的影响。
首先,曲霉的生长和代谢产物会影响酵母菌的生长条件。
曲霉菌丝网结构可以提供酵母菌在发酵过程中的承载物,有效地利用了淀粉水解产物,从而提高了酵母菌的生长速度和产酒效率。
而曲霉菌的菌丝网也可以在一定程度上阻碍酵母菌从固态发酵物中分离出来,使得酵母菌能够在固态环境下持续地进行发酵过程。
其次,菌群交互作用还可以通过酶的协同作用来影响固态法白酒糖化过程。
除了曲霉提供的淀粉酶外,酵母菌也会产生一些糖化酶。
研究发现,曲霉和酵母菌之间存在协同的糖化酶活性,即两者相互促进,提高了糖化效率。
这种协同作用可以通过菌群调节相关的转录因子和代谢途径的互作来实现。
此外,不同种类的菌群组合也会对糖化过程产生不同的影响。
研究表明,选择适宜的菌群组合可以提高固态法白酒糖化过程的效率和品质。
例如,使用不同的曲霉品种和酵母菌株可以改变发酵过程中的代谢物组成,从而影响到最终白酒的风味和质量。
需要注意的是,菌群交互作用在固态发酵过程中具有一定的复杂性。
曲霉和酵母菌之间的相互作用会受到环境条件、发酵物基质和微生物的种类等多种因素的影响。
因此,研究人员需要通过深入的实验和数据分析来揭示这种交互作用的机制。
在研究固态法白酒糖化过程中菌群交互作用的同时,还可以借鉴其他领域的相关研究成果。
糖类的分子生物学研究进展
糖类的分子生物学研究进展糖类作为一种广泛存在于生命体中的分子,其生物学作用备受关注。
近年来,糖类的分子生物学研究进展迅速,不断揭示其复杂的生理和病理机制。
本文将从糖类的合成、识别和代谢等方面,综述糖类分子生物学的研究进展。
一、糖类的合成糖类的合成是生命体内一种基本的代谢过程。
糖类合成途径包括糖异生、糖原合成和糖化作用等。
其中,糖异生是通过非糖营养物质合成糖类,其主要途径为糖异生途径和光合作用。
糖异生途径通过糖异生酶催化将丙酮酸、乳酸、甘油等转化为糖类,参与糖异生途径的酶包括磷酸甘油脱氢酶、磷酸已酸酯酶等。
光合作用则通过光合色素在光能的作用下,将二氧化碳转化为葡萄糖。
糖原合成是指通过葡萄糖转化生成糖原,其主要途径为糖原合成酶的作用。
糖化作用是指非酶催化下糖类和胺基酸、核酸和脂肪酸等化合物的结合反应,产生糖基化产物。
目前,糖类合成途径的研究主要关注糖异生途径和糖原合成的调控机制,通过深入研究酶的结构和功能,揭示其在糖类合成中的作用机制,为糖类代谢异常性疾病的治疗提供理论基础。
二、糖类的识别糖类在生命活动中扮演着重要的角色,其作用主要通过与细胞表面的糖类受体相互作用实现。
细胞表面的糖类受体主要包括糖基化蛋白、蛋白质酶和凝集素等。
其中,糖基化蛋白是指由糖基化修饰的蛋白质,在生命体内广泛存在,其糖基化方式包括N-糖基化、O-糖基化和酰胺基酸糖基化等。
糖基化蛋白通过糖基化部位的不同,发挥着不同的生物学功能,包括发挥信号转导、调节细胞凋亡和调节细胞黏附作用等。
蛋白质酶是指具有糖类酶活性的酶,其主要作用是催化糖类水解反应。
凝集素是一种可以结合糖类的蛋白质,其主要作用是介导细胞黏附和相互作用。
当前,糖类识别领域的研究重点是糖基化蛋白的生物学功能和糖类受体的结构和功能,为糖类的药物靶点开发提供理论基础。
三、糖类的代谢糖类代谢是指生命体内糖类的利用和分解过程。
糖类代谢主要分为糖的吸收、利用和储存等三个方面。
糖的吸收是指糖类从肠道吸收到血液中,其主要途径为GLUT和SGLT。
黑曲霉固态发酵产糖化酶的研究
研究报告
中国酿造
2009 年 第 1 期
总第 202 期 ·27·
糖 化 酶(Glucoamylase,EC.3.2.1.3)又 名 葡 萄 糖 淀 粉 酶,是一种酸性糖苷水解酶,从淀粉或淀粉类似物的非还 原端按顺序切开 α-1,4 糖苷键,也能水解 α-1,6 糖苷键和 α-1,3 糖苷键,生成葡萄糖。糖化酶广泛地应用于酒精 、白 酒、抗生素、氨基酸、有机酸、甘油、淀粉糖等工业中,是我 国用量最大的酶制剂产品[1]。
2009 No.1
·26· Serial No.202
China Brewing
Research Report
黑曲霉固态发酵产糖化酶的研究
钟 浩 1,谭兴和 1,熊兴耀 2,苏小军 2,杨 泱 1
(1.湖南农业大学 食品科技学院,湖南 长沙 410128;2. 湖南农业大学 园艺园林学院,湖南 长沙 410128 )
11000 9800 13790 15670 14350 19000 11200 12350 12450
由表 2 极差分析可知,各因素对于酶活的影响依次为 A>B>C。最佳的摇瓶发酵产酶培养基配比为 A2B3C1,即 麦麸:豆饼粉=3:1,(NH4)2SO4 含量 3%,K2HPO40.1%。 2.2 原料粉碎度对糖化酶活力的影响(见图 1)
黑曲霉变异株:经紫外线和硫酸二乙酯复合诱变而成。 1.2 培养基
孢子培养基:察氏培养基。 产酶培养基:麸皮、豆饼粉、(NH4)2SO4、K2HPO4 等按 一定比例混合。 1.3 仪器 电子天平(ALC-2100.2 型):北京赛多利斯仪器系统 有限公司;pH 计(PHS-3C 型):上海雷磁仪器厂;数显式电 热恒温水浴锅:上海跃进医疗器械总厂;立式蒸气压力灭 菌 器(LDTX-30FB):上 海 申 安 医 疗 器 械 厂 ;霉 菌 培 养 箱 (MJ-25085-Ⅱ):上海新苗医疗器械有限公司;电热鼓风干 燥器(101A-3ET):上海实验仪器有限公司;单人单面净化 工作台(SW-CJ-1FD 型):苏州净化仪器设备有限公司。 1.4 孢子悬浮液的制备 将保存于冷藏柜中的菌株取出,连续活化 2 次。再将 长满成熟孢子的斜面培养基用无菌生理盐水洗涤,倒入 装有玻璃珠的无菌三角瓶中,再在 200r/min 的摇床中充分 振荡 30min,用灭菌后的脱脂棉滤去菌丝片段,制得单孢 子悬浮液。用血球计数板计数,将孢子数调整为 108 个/mL。
固态糖化在白酒酿造中的微生物领域研究进展
固态糖化在白酒酿造中的微生物领域研究进展固态糖化是一种在白酒酿造过程中广泛使用的技术,它通过微生物的作用将淀粉转化为可发酵的糖,进而促进酒精发酵的进行。
在这个过程中,微生物起着举足轻重的作用,因此对于固态糖化在白酒酿造中的微生物领域的研究进展,具有重要的意义。
固态糖化的本质是将含有淀粉的原料与适当的微生物菌种混合,经过水分和温度的调控,使菌种在固态环境中分泌淀粉酶来降解淀粉。
而淀粉酶的产生主要依赖于微生物的代谢机制和生理特性。
因此,对于微生物在固态糖化中的作用机制进行研究和探索,可以为白酒酿造过程的改进和优化提供理论依据。
近年来,固态糖化在白酒酿造中的微生物领域的研究进展主要集中在以下几个方面:首先,研究人员对参与固态糖化过程的微生物菌种进行了广泛的筛选和鉴定。
常见的微生物菌种包括温度较高的发酵菌、霉菌和酵母菌等。
这些微生物菌种具有不同的降解特性和代谢途径,对于淀粉的降解效率以及发酵产物的品质具有显著的影响。
因此,对微生物菌种的筛选和鉴定工作尤为重要。
其次,研究人员对固态糖化过程中的微生物代谢机制进行了深入的研究。
通过对微生物代谢产物的分析和酶活性的检测,可以揭示微生物在固态糖化过程中的代谢途径和调控机制。
同时,还可以通过基因工程技术对关键酶的基因进行改造,以提高降解淀粉的效率和产物的品质。
此外,研究人员还对固态糖化过程中微生物的生长条件和环境因素进行了探索。
水分、温度、pH值等因素对微生物的生长和代谢有着重要的影响。
因此,针对不同的微生物菌种,需要确定最适宜的生长条件,以获得最佳的降解效果和发酵产物的品质。
同时,还需要考虑添加剂和辅助材料对固态糖化的影响,以进一步优化酿造过程。
最后,研究人员还在固态糖化领域中探索了新的微生物资源和技术手段。
通过对自然界中的微生物资源进行筛选和鉴定,发现一些具有较高降解淀粉能力的微生物菌种,为固态糖化的改进和优化提供了新的思路和途径。
同时,利用生物工程和代谢工程的技术手段,在微生物的遗传背景和代谢途径上进行改造和优化,也能够提高固态糖化的效率和产物的品质。
啤酒酿造中的糖化酶使用
啤酒酿造中的糖化酶使用糖化酶是酿造过程中不可或缺的重要因素之一。
它能够将麦芽中的淀粉转化为发酵所需的糖分,为酵母提供能量和营养物质。
在啤酒酿造中,糖化酶的使用对于产出高品质的啤酒起到关键作用。
本文将着重探讨糖化酶在啤酒酿造中的使用及其对酿造工艺和品质的影响。
1. 糖化酶的类型和功能糖化酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。
它们分别负责淀粉的不同部分的降解过程。
α-淀粉酶能够将淀粉分解为小分子糖,β-淀粉酶则将这些小分子糖进一步分解为较简单的糖,最终葡萄糖淀粉酶将其转化为葡萄糖。
2. 糖化酶的添加时机糖化酶的添加时机对于酿造工艺和最终产品的品质有着重要的影响。
一般来说,糖化酶通常在糖化阶段的开始时添加。
此时,糖化酶能够有效地将淀粉转化为可发酵的糖。
在温度和pH值适宜的条件下,糖化酶的效果最佳。
3. 糖化酶的影响因素糖化酶的活性受到温度、pH值、酒花的使用以及麦芽中的抗酶物质等因素的影响。
温度过高或过低、极端的酸碱度和抗酶物质的存在都可能降低糖化酶的效果。
因此,在使用糖化酶时,需要根据具体条件进行调整,以保证糖化酶的最佳效果。
4. 糖化酶对啤酒品质的影响糖化酶的使用对于啤酒的品质有着重要的影响。
糖化酶能够提供酵母所需的糖分,从而促进发酵过程。
它还能够调整啤酒的口感和口感稳定性。
通过合理的糖化酶使用,可以使得啤酒口感更加柔和、口感更为丰富。
5. 糖化酶的使用技巧在实际的啤酒酿造中,对于糖化酶的使用需要掌握一些技巧。
首先,需要选择合适的糖化酶种类和剂量。
其次,需要注意糖化酶的温度和pH值的控制,以保证其最佳活性。
此外,还可以结合其他辅助剂,如酵母营养剂等,来提高糖化酶的效果。
结论在啤酒酿造中,糖化酶的使用对于酿造工艺和品质起到至关重要的作用。
通过选择合适的糖化酶种类、剂量和加酶时机,合理控制温度和pH值等因素,可以获得更高品质的啤酒。
糖化酶作为酿造过程中的关键因素之一,不容忽视其在啤酒质量控制中的重要性。
黑曲霉诱变产糖化酶
诱变黑曲霉提高糖化酶的生物合成摘要现今,筛选黑曲霉主要通过物理和化学突变。
用溴化乙錠和甲基磺酸乙脂(EMS)轮流处理亲代菌株。
这株突变菌株M4能产生更多的糖化酶。
简介糖化酶时淀粉工业中最重要的一种酶。
它能将淀粉水解成葡萄糖。
葡萄糖在各种食品行业中是一种必要的合成原料。
糖化酶广泛地应用于酿造,造纸,食品,制药,纺织行业中。
黑曲霉通过液态或固态发酵生产糖化酶中,食物残渣也能被利用到。
同时,食物残渣也能用于葡萄糖和啤酒行业中。
糖化酶是一种微生物的胞外酶,并且,它典型的性质是水解a-1,4和a-1,6糖苷键,通过其他酶作用于淀粉合成糖类。
糖化酶能水解非还原端的a-1,4葡萄糖苷键。
糖化酶能被成倍的生成,通过引起野生菌株突变。
据报道,黑曲霉的突变菌株能更好地生产糖化酶。
这种黑曲霉菌株能被紫外线照射或者化学的方法诸如N-甲基,N-硝基,N-亚硝基胍,硫酸二甲脂,甲基磺酸乙脂,溴化乙錠和亚硝酸来引诱突变,提高糖化酶产量。
突变菌株产糖化酶的特性能更好地影响对生淀粉的处理。
生产糖化酶的突变菌株在r-射线的处理下,亲代菌株的特性被改善并且产物乙醇的产量也被提高了。
这个突变黑曲霉是用联合诱变处理的,它产的糖化酶能将麦芽糊精转变为葡萄糖。
多重的轮流突变对葡萄糖的生成有着很好的影响。
糖化酶的比活度和它的热稳定性被提高。
并且,结果通常是提高葡萄糖产量。
对比几种黑曲霉突变株的酶产量和它们的特性,相比于野生株,突变株能更高水平地生产糖化酶。
但是,不管使用怎样的菌株,对所有糖化酶来说,酶的组成和特性都是类似的。
Britly进行本研究的目的是为了证明以小颗粒的形式增长有利于糖化酶生产,而大颗粒的形式则降低了糖化酶的生产量,导致结果不匹配。
现今研究这些的目的是为了激发菌株的潜能,通过化学或者无力突变来增加糖化酶的产量。
原料和方法改善菌株:黑曲霉能通过紫外线和诱变剂得以改善。
用溴化乙錠和甲基磺酸乙脂轮流处理亲代菌株。
两种诱变剂同时使用。
糖化酶的研究进展及趋势_武金霞
27 Blair H.T.et al.,Synaptic plasticity in the lateral amygdala:a cellar hypothesis of fear conditioning.Learning and Memory,2001;8:2272242 28 M iller R.R.,M atzel L.D.M em ory inv olves far m ore than’cons olida2 tion’.Nature Reviews neuroscience,2000;1:214221629 K im J.J.,Fanselow M.S.M odality2specific retrograde amnesia of fear.Science,1992;256:675267730 Phillips,R.G.,LeD oux,J.E.Differential contribution of amygdala and hippocam pus to cued and contextual fear conditioning.Behav.Neu2 rosci.,1992;106:27428531 Selden N.R.,Everitt B.J.,Jarrard L.E.,R obbins T.W.C om plemen2 tary roles for the amygdala and hippocam pus in aversive conditioning to explicit and contextual cues.Neuroscience,1991;42:33525032 Abeliovich A.,Paylor R.,Chen C.,K im J.J.,W ehner M.,T onegawa S.PK Cg mutant m ice exhibit m ild deficits in spatial in spatial and con2 textual learning.Cell,1993;75:126327133 M aren S.,Aharonov G.,Fanselow M.S.Neurotoxic lesions of the dorsal hippocam pus and Pavlovian fear 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20世纪80年代,对于糖化酶的研究发展极快,主要集中于糖化酶菌株的分离及其纯化工作.长期研究证明,糖化酶广泛地分布在微生物中,主要存在于黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中,同时也存在于人的唾液、动物胰腺及细菌中.已报道的产糖化酶真菌微生物有23个属35个种;细菌有3属3种[1]. 真菌产糖化酶组分多型性是常见的,Rhizopus nivenus 和Chalara paradoca[2,3]可分别产生5种和6种活性组分.陈冠军、罗贵民等人[4]采用硫酸铵分级沉淀,DEAE-纤维素离子交换层析、Sephadex G-150凝胶过滤等方法,从黑曲霉AS3.4309变异株B-11的发酵液中分离出三种电泳均一的糖化酶GⅠ、GⅡ、GⅢ,其相对分子质量分别为27000、53000和67000;等电点分别为3.38、3.59和3.52;分子含糖量分别为8.7%、18.3%和13.6%;最适温度均为70℃,实验结果证明,三种同工酶都由一条多肽链组成.相对分子质量小的GⅠ具有完整的催化部位结构,而GⅡ和GⅢ多于GⅠ的那部分肽段,则可能起着稳定活性部位和增强结合底物能力的作用.GⅢ比G Ⅱ多一个约含100个残基的肽段,这个肽段可能是GⅢ能被生淀粉吸附的原因所在.One等[5]利用固相Acarbose 柱从市售糖化酶(A.niger)中分离出六种活性组分,每种活性组分均可从可溶性淀粉中释放出单一的β-D-葡萄糖终产物.这六种组分的相对分子质量、沉降系数、化学组成、等电点、酶的动力学及其他性质上各异.但Y a2 suda[6]从Monascus sp.NO.3403中分离出两种组分,电泳和超离心结果证明有同质性、相对分子质量、碳氮含量、・161・自然杂志 25卷3期科技进展最适pH 、最适温度及Km 值都非常接近.管汉成、严自正、张树政[7]发现黑曲霉突变株T -21产生的葡萄糖淀粉酶也具有多型性,经凝胶电泳和酶活力显色得到5条以上具有淀粉酶活力的蛋白质带,并从中分离纯化出能被生淀粉吸附和水解生淀粉的G A Ⅰ和既不被生淀粉吸附又不水解生淀粉的G A Ⅱ.方善康和周凤臻[8]对黑曲霉S4的生淀粉糖化酶进行分离,分离出3个均为酸性糖蛋白的G Ⅰ、G Ⅱ和G Ⅲ.糖化酶的多型性可能由下述原因引起:一是基因调控、转录的方式不同;二是蛋白质合成的修饰作用不同,即结合糖量不同;三是在发酵过程中受到自身蛋白水解酶和糖苷酶的作用,由糖化酶的原始形式衍变成糖化酶的.此外培养基的成分和生长条件也对糖化酶组分多型性有影响.二、提高糖化酶活力的研究 几十年来我国科研工作者为提高糖化酶的活力进行了不懈的努力,常规的物理及化学诱变的方法仍然是方便有效的途径.谷海先等[9]对黑曲霉AN -149菌进行自然分离、紫外线和NTG 的复合诱变处理,得到了一株高产糖化酶的菌株WG-93,经30L 发酵罐试验,酶活力达29ku/ml (原糖化酶生产发酵水平为12ku/ml ).1993年,李俊刚等[10]对生淀粉糖化菌黑曲霉S -1原生质体采用(λ1=260nm ,λ2=266nm )能量为8m J 的激光直接照射,得到高酶活力的生淀粉糖化酶突变株,比出发株酶活力平均提高37.4%,最高突变株酶活力达到74.5u/ml ,比出发株提高91%.1998年,李俊刚等[11]又以黑曲霉523原生质体为对象,经激光、紫外线和亚硝基胍复合诱变,选育出生淀粉糖化酶高产突变株黑曲霉N L -3,其生淀粉酶活力为156u/ml.王海洪等[12]通过分离和筛选,得到一株分解小麦生淀粉能力较强的黑曲霉,其生淀粉糖化酶活力为171.5u/g ,α-淀粉酶活力为6.347u/g.DNA 重组技术发展以来,有人尝试将糖化酶基因克隆到埃希大肠杆菌和酵母菌中,构建了糖化酶高产工程菌.近几年来,罗进贤等人[13]将酵母T y 转座子的δ序列,黑曲霉糖化酶cDNA 及G 418抗性基因neo 重组进酵母整和型质粒Y iplac128获得含LEU2,neo 双标记基因,糖化酶cDNA 的高整和型表达载体Y I128D.17N ,转化CRF18(Y I128D.17N )糖化酶基因在该菌株获得高效表达,产物分泌到胞外.吴晓萍等人[14]将切除了5’端非编码区50碱基对片段的黑曲霉糖化酶G A ⅠcDNA 与大麦α-淀粉酶基因重组进埃希大肠杆菌-酵母穿梭载体,构建重组表达质粒pM AG 11,转化酿酒酵母G RF18,获得含α-淀粉酶和糖化酶双基因的酵母工程菌G RF18(pM AG 11),在酵母PGK 基因启动子和终止信号的调控下,α-淀粉酶和糖化酶基因获得高效表达,99%的表达产物分泌至胞外.三、糖化酶的基因的研究 对黑曲霉糖化酶基因的研究有了不断的进展,尤其是对其结构基因和调控序列.Boel 等[15]首先从黑曲霉的染色体文库中分离出糖化酶的基因,它含有五个内含子,而泡盛曲霉中含有四个内含子.两种微生物都分泌糖化酶G A Ⅰ、G A Ⅱ,两种酶都由单一基因编码,有相类似的氨基末端氨基酸序列,在一级结构和C -端序列长度上稍有不同.唐国敏等克隆了突变株T 21的糖化酶cDNA ,并进行了测序[16],实现了糖化酶基因在酿酒酵母中的表达[17],并将糖化酶基因整合到酿酒酵母的基因组内,实现稳定表达[18],克隆并测定了糖化酶基因启动子区的功能[19],该课题组[20]在1996年以PCR 合成的糖化酶高产菌株黑曲霉T 21糖化酶基因5’近端非编码区588bp (Eco -BamHI )的序列为探针,从T 21染色体DNA 中克隆到近2.0kb 的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针,从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T 21的诱变出发株)的染色体DNA 中克隆到1.5kb 的糖化酶基因5’端非编码区序列,并从该二序列的分析测定中得到,黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区被称为“核心启动子”(core prom oter )的T AT AAAT 框及G CAAT 框,分别在翻译起始点的-109bp 及-178bp 处,高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化.在1998年[21]又对糖化酶高产菌株A.niger T 21和原始菌株Aniger 3.795的glaA5’上游区的序列进行了分析,证明两者在1.5kb 的区域内有九个部位的碱基不同.构建了以T 21和3.795glaA 基因转录调控区及A.nidulans trpC 基因终止子为表达元件的E.colihph 基因表达载体(pXH2和p G H1),用pXH2和p G H1分别转化A.niger T 21,对两种转化子的Hm B 抗性水平测定和S outhern 杂交分析显示,在转化子XH2C 和G H1C 中,pXH2和p G H1以相同拷贝数(2拷贝串联)整合到染色体DNA 的相同位置上,XH2C 的Hm B 抗性水平(3000μg/ml )为G H1C (1500μg/ml )的2倍.诱变引起的调控区序列改变使T 21黑曲霉糖化酶基因转录调控区的功能水平比3.795提高1倍.国内对糖化酶研究较多的还有关海山等人[22-24],主要研究不同真菌中糖化酶的基因克隆、表达和糖化酶的性质,在挖掘糖化酶资源方面做了大量工作.・261・Ziran Zazhi V ol.25N o.3科技进展四、扩大糖化酶的应用研究 糖化酶是工业上应用最广泛的酶类之一.除了利用糖化酶水解淀粉为葡萄糖而用于制糖业外,现在人们越来越多地开发糖化酶的新型用途.糖化酶在酿酒工业中也有广泛的应用.传统白酒[24]生产用曲中的微生物是依靠自然界带入的,未经筛选,其糖化力较低,耐酸耐热性都较差.糖化酶作用的pH 范围为3.0~5.5,最适作用范围为4.0~4.5,这使得白酒酿造过程中酸度不断增加,适宜发酵.糖化酶的应用,使粮醅入酵后发酵升温快,升温幅度大,提高原料的出酒率,缩短发酵周期,降低生产成本.在食用醋[25]生产中,应用TH -AATY 和糖化酶,可以解决企业自制酒母质量不稳定和夏季高温等生产难题,使食用醋生产正常进行,它不仅降低了原材料的消耗,减轻了工人的劳动强度,而且显著提高了淀粉利用率和出醋率,得到较好的经济效益.固定化糖化酶应用于糖结晶过程,可以提高糖的出产率[26].今后糖化酶将会被应用于更为广阔的空间.五、糖化酶研究的展望 虽然对糖化酶的研究已有多年,但是仍有许多问题尚待进一步探索[27].基础研究领域将主要集中在糖化酶的结构研究,如糖链在糖化酶活性、稳定性及构象状态中所起的作用,进一步阐明糖化酶的多型性原因及糖化酶的热稳定性机制.应用研究之一仍将是进一步提高糖化酶的活力,利用诱变、DNA 重组技术或其他方法获得优良菌株,提高糖化酶基因在受体菌中的表达水平等,进一步优化糖化酶纯化工艺及保存条件;另一方面,诱变筛选耐热糖化酶产生菌或克隆耐热糖化酶基因,将是一个重要方向,因为耐热糖化酶在发酵业的应用将会大大降低能源消耗,从而降低生产成本,将给糖化酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景.(2002年10月20日收到)武金霞 在职博士生,副教授,河北大学生命科学学院生物技术系,071002王 沛 河北大学生命科学学院2000级生物技术专业学生李晓明 河北大学生命科学学院2000级生物技术专业学生1 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和糖化酶在食醋生产中的应用试验.中国酿造,2001;111(1):2322425 柴宝华.固定化糖化酶在结晶糖中的应用.淮海轻工学院学报,2000;9(1):6226426 杨依军,李多川,沈崇尧.葡萄糖淀粉酶研究进展.微生物学通报,1996;23(5):3122315Progress and T rend of G lucoamylaseWu Jin 2xia ①,Wang Pei ②,Li X iao 2ming ③①Master ,Ph.D.Candidate ,Sssociate Pro fessor ,Department o f Biotech 2nology ,College o f Life Science ,H ebei Univer sity ,Baoding ,H ebei 071002②③Undergraduate ,College o f Life science ,H ebei Univer sity ,Baoding ,H ebei 071002K ey w ords glucoamylase ,enzyme activity ,multitype ,structural gene・361・自然杂志 25卷3期科技进展。
淀粉的糖化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解淀粉糖化的基本原理和过程。
2. 掌握淀粉糖化实验的操作步骤。
3. 通过实验验证淀粉在酶的作用下糖化的效果。
4. 掌握还原糖的检测方法。
二、实验原理淀粉是由大量葡萄糖分子通过α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键连接而成的多糖。
在淀粉糖化过程中,淀粉首先在淀粉酶的作用下被水解成糊精和低聚糖,这一过程称为液化。
随后,在糖化酶的作用下,糊精和低聚糖进一步水解成葡萄糖,这一过程称为糖化。
实验中常用的淀粉酶包括α-淀粉酶和糖化酶。
α-淀粉酶作用于淀粉的α-1,4-糖苷键,将淀粉分解成糊精和低聚糖;糖化酶作用于糊精和低聚糖的α-1,4-糖苷键,将它们分解成葡萄糖。
还原糖是指具有还原性的糖类,如葡萄糖、果糖等。
在实验中,通过检测还原糖的含量来评价淀粉糖化的效果。
三、实验仪器与试剂1. 仪器:恒温水浴锅、锥形瓶、滴定管、移液管、玻璃棒、烧杯、漏斗、滤纸等。
2. 试剂:淀粉、α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖标准溶液、硫酸铜溶液、氢氧化钠溶液、硫酸锌溶液、苯酚溶液等。
四、实验步骤1. 配制淀粉溶液:称取一定量的淀粉,用蒸馏水溶解,配制成一定浓度的淀粉溶液。
2. 预处理淀粉溶液:将淀粉溶液在60℃下加热处理30分钟,以消除淀粉溶液中的杂质。
3. 液化:向淀粉溶液中加入适量的α-淀粉酶,调节pH值至最适值,在恒温水浴锅中反应一定时间,使淀粉液化。
4. 糖化:向液化后的淀粉溶液中加入适量的糖化酶,调节pH值至最适值,在恒温水浴锅中反应一定时间,使淀粉糖化。
5. 还原糖的检测:取一定量的糖化液,按照还原糖的检测方法进行检测。
五、实验结果与分析1. 液化过程:通过实验观察到,淀粉溶液在α-淀粉酶的作用下,逐渐由透明变为浑浊,说明淀粉已发生液化。
2. 糖化过程:通过实验观察到,液化后的淀粉溶液在糖化酶的作用下,浑浊度逐渐降低,说明淀粉已发生糖化。
3. 还原糖的检测:通过检测还原糖的含量,可以评价淀粉糖化的效果。
米根霉产糖化酶发酵条件的研究
enhance the
starch—hydrolying enzymatic activation.but Fe“,Mn2+and Zn“were opposite.
Key words:Rh五opus oryzae;glucoarnylase;fermentation conditions
1材料与方法 1.1原料及试剂
以菌株R.SCLG0319发酵产糖化酶的酶活力对培养 基初始pH值作图(图2C)可知,发酵培养基的初始pH值 为4~6,随着pH值的增大,酶活力逐渐增大;当pH值为 6.0时达到酶活力最大值,pH值为6.0以后,酶活力急剧 减小,在该研究条件发酵液的最适pH值为6.0。
万方数据
研究报告
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菌株发酵产糖化酶活力的影响。结果表明,R.SCLG 0319菌株摇瓶发酵产糖化酶40h为宜,最适发酵温度30℃,装液量100raL/
250mL,培养基初始pH值6.0;菌株对低浓度乙醇作用呈现依赖性,培养基中6%vol酒精度时酶活力达到135 U/mL,可耐12%vol
酒精度,在高浓度乙醇作用下酶活力迅速下降;Cu“、Ca“和Mg“呈现激活效应,其中Mg“的效应最明显,酶活力增强50%,
向250mL三角瓶中装入lOOmL液体发酵培养基,接 种19以R.SCLG0319菌株制备的霉曲,25%摇床培养 (200r/min)24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h测糖化酶酶 活力。 1.4.2发酵温度的影响
250mL三角瓶中装入lOOmL液体发酵培养基,接种 19霉曲,分别在25℃、30℃、35活力。 1.4.3装液量的影响
粗酶液中糖化酶酶活力的计算方法:
2———i面■一 20×”l(0.104x十0.0012)
糖化酶研究综述
糖化酶又称葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)],是淀粉分解酶的的一个分支。
糖化酶是一种习惯上的名称,学名为α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4-Glucan glucohydrolace)。
它能把淀粉从非还原性未端水介a-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖,也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键,转化为葡萄糖。
糖化酶是由曲霉优良菌种(Aspergilusniger)经深层发酵提炼而成。
(深层发酵是利用深层培养基的厌氧环境来培养厌氧细菌,但不能培养严格厌氧细菌,多用于兼性厌氧菌和微耗氧菌的培养)重要糖化酶生产菌有:雪白根霉,德氏根霉,河内根霉,爪哇根霉,台湾根霉,臭曲霉,黑曲霉等。
糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵;本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。
总之,凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上,都可适用。
最多应用于酒精、淀粉糖、味精、抗菌素、柠檬酸、啤酒等工业以及白酒、黄酒。
一特性:1.作用方式:糖化酶的底物专一性较低,它除了能从淀粉链的非还原性未端切开a-1.4键处,也能缓慢切开a-1.6。
因此,它能很快的把直链淀粉从非还原性未端依次切下葡萄单位,在遇到1.6键分割,先将a-1.6键分割,再将a-1.4键分割,从而使支链淀粉水解成葡萄糖2. 作用条件:糖化酶随作用的温度升高活力增大,超过65℃又随温度升高而活力急剧下降,本品是最适作用温度是60-62℃。
最适作用PH舒值在4.0-4.5左右3.活力检测:酶活力定义:1克酶粉或1毫升酶液在40℃,PH4.6条件下,1小时水解可溶性淀粉产生1毫克葡萄糖的酶量为1个酶活力单位(U)。
原理:糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有醛基,能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算酶活力。
试剂和溶液:(1)乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH为4.6)。
生物化学中酶催化反应的研究进展
生物化学中酶催化反应的研究进展酶催化反应是生物化学中一个重要的研究方向,其研究可以为我等人类解决许多生物化学问题提供理论依据。
酶是一种生物大分子,在许多代谢反应和生命活动中起着重要的催化作用。
酶的研究早在19世纪末期就有了初步的认识,但是直到20世纪60年代,由于生化技术及细胞学的进展,酶学得以迅速发展。
酶的分类酶按照化学特性可分为氧化酶、还原酶、肽酶、磷酸酶等。
其中,氧化酶促进氧化反应,还原酶促进还原反应,肽酶促进肽类物质的水解反应,磷酸酶则促进磷酸酯类物质的水解反应。
此外,酶还可以按作用机理分为两类:具有活性中心的酶,其催化机理是通过具有活性中心和底物之间结合的方式实现的。
而反应过程中涉及到酶与底物的结合和解离,形成临时性中间体,这些反应过程称为酶促反应。
另一类酶为核酸酶,其催化机理是专门结合并切割核酸物质。
酶的催化作用酶的催化作用来源于其本身的分子结构。
酶分子一般由蛋白质和一些辅助因子组成,这些辅助因子可以为酶的催化作用提供必须的条件。
酶催化反应的关键是其产生的临时性中间体,一些酶具有特异性,只对具有一定空间结构和电学性质的底物起反应。
酶催化反应的机理非常复杂,一般分为两个步骤:酶与底物的结合和解离。
酶与底物的结合需要一定的能量,称为结合能,同时也需要一定的时间。
这个过程称为化学加速,使得底物分子之间的化学反应发生更多的机会。
底物通过酶的催化反应,形成了一个反应中间体,这个中间体因为酶的特殊结构具有很高的反应活性。
酶有助于这个反应中间体的形成,同时还能改变这个中间体的结构,使得中间体更容易分解,从而迅速产生反应产物和酶分子。
酶催化反应的应用酶催化反应的研究和应用有着广泛的领域,包括生物科技、化学工业、食品加工等。
在生物科技方面,酶可以参与到细胞的代谢反应、DNA合成等各个过程中。
酶的研究还可以为生物医学提供指导意义,如酶抑制剂就可以作为一种治疗药物来控制某些病理状态。
在化学工业方面,酶也发挥着巨大的作用。
糖化酶研究进展
酶学糖化酶的研究进展2013年糖化酶的研究进展摘要:糖化酶是世界上生产量最大和应用范围最广的酶制剂,在工业中具有重要的应用价值。
本文从微观学角度出发,主要介绍了糖化酶的结构和催化作用机制;另外介绍了糖化酶的分离纯化手段及其功能应用;最后提出了研究中存在的问题以及解决办法,并对糖化酶应用研究的前景进行了展望。
关键词:糖化酶;结构;催化机制;分离纯化;功能STUDYING STRUCTURE AND FUNCTION OFGLUCOAMYLASEAbstract:Glucoamylase is the enzyme which has the most output and the vastest application in the world . From the perspective of microscopic science, This review introduces the structure and catalytic mechanism of glucoamylase; additionally introduced separation and purification methods and application of glucoamylase; In the end, put forward the application, the problems and solutions of glucoamylase research, provide future application prospect.Keywords: glucoamylase;structure ;Catalytic mechanism;Purification;function糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶(glucoamylase),全称是α-(1-4)-葡聚糖—葡萄糖水解酶,它的底物是葡萄糖分子通过α-(1-4)-糖苷键连成的高分子,水解产物是葡萄糖,酶学编号是E3.2.1.3[1]。
糖化酶固定化的研究进展 王永明
糖化酶固定化的研究进展姓名:王永明院系:食品化工系专业:食品生物技术班级:12食品生物技术学号:2012030119日期:2013年12月日糖化酶固定化的研究进展摘要:主要从包埋法、共价结合法、吸附法和交联法四个方面介绍了固定化糖化酶的研究进展情况,并提及其他固定化方法,论述了固定化糖化酶的稳定性的研究进展,指出了糖化酶的研究方向和发展趋势。
以及糖化酶的研究趋势。
关键词:白酒生产固定化固定化方法稳定性研究糖化酶是酶制剂工业中应用最广泛,用量传统白酒生产所使用的曲中微生物是依靠最大的一种淀粉酶,其主要作用是分解淀粉,产自然界带入的,未经筛选,其糖化力较低,生葡萄糖。
我国传统白酒的生产大多使用淀粉酸耐热性能都较差,这在客观上减弱了对杂雀质原料,一般以曲为糖化剂,成本高,出酒率危害的自卫能力。
随着白酒工业的发展,利用糖化酶代替部上的陈曲,以减少曲本身的杂菌含量,却又阶分曲,以提高出酒率,降低生产成本,已被众低了糖化力;传统白酒的制曲温度很高,如雀多白酒企业普遍采用,尤其近几年活性干酵母香型曲顶温高达65 C,有益微生物在高温下大的出现,更使糖化酶在白酒中的用量飞速增长,量死亡,必然导致糖化力的急剧下降,所以传即使一向在工艺技术上十分谨慎的名酒厂也都统白酒的用曲量很大,浓香型酒用曲量为原料在生产中使用了糖化酶,或者在丢糟中应用了的25%左右,酱香型酒高达80%左右。
然而,由于我国白酒企业的技术水平但是,用曲量也不能无限制地增加,用胜参差不齐,各种白酒的生产工艺千差万别,因量增加后,曲中杂菌数量也相应加大,不仅刘而糖化酶在我国传统白酒生产中的应用就很难出酒无益,而且对酒质有影响,行业有“曲大有一个科学规范的标准,有些企业应用时比较酒苦”之说。
所以,出于对传统白酒的香味、冈盲目,在使用的方法、用量、目的上显得很混格、质量考虑,在不彻底改变传统工艺的情次乱,最终的使用效果自然不够理想。
为了真正下,利用糖化酶改善传统白酒的糖化发酵状玩发挥科学技术第一生产力的作用,让糖化酶这提高出酒率是可行的,也是必要的。
糖化酶单抗的研制及其抗原识别位点的分析
糖化酶单抗的研制及其抗原识别位点的分析张丹;姜威;李双喜;汪惠泽;冯云飞;刘云迎;李东明;何祥来;王捍东【摘要】To develop a detection method for glucoamylase in honey, BALB/c mice were immunized with the glucoamylase from A.spergillus niger. Splenocytes of the immunized mice were fused with SP2/0 cells with PEG. 12 monoclonal antibodies (McAbs) against the glucoamylase were obtained and identified. 10 hybridoma cell lines represented subtypes IgG1 and the other were IgG2b, and their light chains were κ chain. Western blotting analysis showed that the 12 McAbs specifically recognized glucoamylase. Hybridoma2H4F9 ,6H9D8 ,8F2F11 .8F2E9,1A8G6 , 1C4D5 excreting anti-glucoamylase McAbs were used to be injected into abdominal cavity of mice(ICR). The titers of the McAbs were all above 1:1×104. Six strains of mo noclonal antibodies were confirmed to be specific for four different kinds of epitopes on glucoamylase competitive binding assay. Among them, McAb-6H9D8 and MeAb-8F2F11 might direct to the same antigenic determinant on the GA, McAb-lA8G6 and McAb-1C4D5 to the second antigenic site, McAb-8F2E9 to the third antigenic site, McAb 2H4F9 to the fourth antigenic site.%为建立掺糖造假蜂蜜中残留糖化酶的检测方法,用从黑曲霉中提取的糖化酶作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了12株稳定分泌针对糖化酶抗体的杂交瘤细胞株.单克隆抗体亚型鉴定结果显示,10株为IgG1,2株为IgG2b,轻链均为к轻链.Western blotting分析结果表明,12株抗体均可特异性结合糖化酶.其中6株单抗(McAb-2H4F9、6H9D8、8F2F11、8F2E9、1A8G6、1C4D5)细胞株采用体内诱生法制备的腹水效价均1:1×104以上.采用抗体叠加试验对这6株抗糖化酶单抗的抗原识别位点进行检测,反应增殖结果表明,6株单抗分别针对4类不同抗原位点,McAb-6H9D8和McAb-8F2F11针对第Ⅰ种抗原决定簇;McAb-1A8G6和McAb-1C4D5针对第Ⅱ种抗原决定簇;McAb-8F2E9针对第Ⅲ种抗原决定簇;McAb-2 H4F9针对第Ⅳ种抗原决定簇.制备的抗体针对不同的抗原表位,为双抗夹心ELISA方法的建立提供前提.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)011【总页数】4页(P39-42)【关键词】淀粉糖化酶;单克隆抗体;抗原识别位点【作者】张丹;姜威;李双喜;汪惠泽;冯云飞;刘云迎;李东明;何祥来;王捍东【作者单位】扬州大学兽医学院,江苏省普通高校重点学科内科实验室,江苏扬州225009;扬州大学兽医学院,江苏省普通高校重点学科内科实验室,江苏扬州225009;扬州大学兽医学院,江苏省普通高校重点学科内科实验室,江苏扬州225009;扬州大学兽医学院,江苏省普通高校重点学科内科实验室,江苏扬州225009;扬州大学兽医学院,江苏省普通高校重点学科内科实验室,江苏扬州225009;扬州大学兽医学院,江苏省普通高校重点学科内科实验室,江苏扬州225009;江苏省常州市出入境检验检疫局,江苏常州 213022;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州 225300;扬州大学兽医学院,江苏省普通高校重点学科内科实验室,江苏扬州 225009【正文语种】中文【中图分类】S852.4+3中国是养蜂大国,其出口的蜂蜜数量位居世界蜂蜜年贸易量的首位。
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酶学糖化酶的研究进展2013年糖化酶的研究进展摘要:糖化酶是世界上生产量最大和应用范围最广的酶制剂,在工业中具有重要的应用价值。
本文从微观学角度出发,主要介绍了糖化酶的结构和催化作用机制;另外介绍了糖化酶的分离纯化手段及其功能应用;最后提出了研究中存在的问题以及解决办法,并对糖化酶应用研究的前景进行了展望。
关键词:糖化酶;结构;催化机制;分离纯化;功能STUDYING STRUCTURE AND FUNCTION OFGLUCOAMYLASEAbstract:Glucoamylase is the enzyme which has the most output and the vastest application in the world . From the perspective of microscopic science, This review introduces the structure and catalytic mechanism of glucoamylase; additionally introduced separation and purification methods and application of glucoamylase; In the end, put forward the application, the problems and solutions of glucoamylase research, provide future application prospect.Keywords: glucoamylase;structure ;Catalytic mechanism;Purification;function糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶(glucoamylase),全称是α-(1-4)-葡聚糖—葡萄糖水解酶,它的底物是葡萄糖分子通过α-(1-4)-糖苷键连成的高分子,水解产物是葡萄糖,酶学编号是E3.2.1.3[1]。
糖化酶是淀粉转化为葡萄糖过程的主要酶类,早在1500年前,我国已用糖化曲酿酒,本世纪20年代法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲, 并用于酒精生产。
目前,糖化酶已涉及到食品、医学、发酵等多个行业,具有广泛的应用价值。
1.糖化酶的结构及其催化机制1.1糖化酶的结构糖化酶是由微生物分泌产生的,具有外切酶活性的胞外酶,催化淀粉从非还原端水解α-1,4糖苷键逐个释放出单个β-D-葡萄糖。
它是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白, 分子量在 60000~1000000间,含有一个催化域(CD)和一个淀粉结合域(SBD),两者之间通过O-糖基化连接域(L)连接起来[2]。
糖化酶的N末端催化区域通过( α/α)形成一个漏斗状活性中心,经高度糖基化的O-糖基化连接域与 C末端6通过β反平行折叠形成的两个淀粉亲和区相连接,在空间上具有相对紧密、稳定活性功能。
糖化酶催化域(CD)含有400多个氨基酸残基,富含Ser和Ala两种氨基酸,其中ser443和ser444之间热稳定性较差,易断裂。
来自不同真菌的糖化酶的催化域的二级结构有所差异。
泡盛曲霉X100的糖化酶CD中含有13股α一螺旋,除α一螺旋11外均参与结构,黑曲霉及子囊菌酵母糖化酶CD的构型与泡盛曲霉X100折叠成“桶”状(α/α)6的CD构型基本相似,但子囊菌酵母CD含有14股α一螺旋,其中的12股α一螺旋形成与泡盛曲霉、黑曲霉CD结构类似。
Sauer等人认为黑曲霉糖化酶水解α一1,4--糖苷键的机制是典型的酸碱催化,Glu179和Glu400分别为催化中心的质子供体和质子受体,Glu179提供的质子传递给淀粉链中易断裂键的糖苷键上,形成含氧碳正离子,在Glu400协助下接受水的亲核攻击而使糖苷键断裂,同时使水解产生的α—D(+)-葡萄糖异构化生成β一D(+)构型[3]。
淀粉结合域(SBD)的结构中,根据SBDs氨基酸序列的同源性,SBDs被划分为6族,分别为CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34和CBM41,黑曲霉和米根霉分泌的糖化酶分别属于CBM20和CBM21。
来源于黑曲霉的糖化酶(AnGA)的SBD位于AnGA的C一末端,而来源于米根霉的糖化酶(RoGA)不仅C 一末端含有一个SBD.且N一末端也含有一个SBD。
AnGACBM20和RoGACBM21约含100个氨基酸,其中富含苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)等芳香族氨基酸残基,不含半胱氨酸(Cys)。
AnGACBM20和RuGACBM21两者之间的氨基酸序列差异很大,同源性仅为13.5%,但芳香族氨基酸的同源性较高,主要为色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
虽然两者氨基酸序列同源性很低,但其二级结构和三级结构却惊人的相似。
两者均不含α一螺旋结构,仅含β一折链和无规卷曲结构,由7~8段β一折叠链反平行折叠形成β一卷筒,β一卷筒再折叠形成2个β一折叠结构,两个底物亲和位点(S l和SII)分别位于结构域的相向两侧。
S I和sⅡ中分别含有一个色氨酸(W)残基,AnGACBM20的SI含W590,S II含W563,Ro—GACBM21的SI含W70,SⅡ含W47;CBM表面分布着较丰富的酪氨酸残基(Y),RoGACBM21含有6个Y残基(Y32、Y58、Y67、Y83、Y93和Y94,AnGACBM20含2个Y残基Y527和Y556。
SBD不仅具有结合淀粉、多聚糖及寡聚糖等碳水化合物的功能还具有协同催化域水解底物的生物活性。
AnGACBM20和RoGACBM21的S I、SⅡ都能结合淀粉颗粒,但两者对底物的亲和性差异较大,sⅡ亲和力(Kd=6.4µM)远大于SI(Kd=28µM)。
S I主要是在催化反应起始阶段识别底物,它只能识别可溶性长链多聚糖,同时还具有促进SⅡ对底物的亲和作用;SⅡ则引起底物的构像改变,以淀粉类似物β一环糊精(BCD)为底物,发现β-CD的非极性面结合到SBD的特定氨基酸的芳香环上。
正常情况下,淀粉颗粒中的淀粉链之间是相互平行呈线性,而结合在SBD的2个位点上的2条淀粉链的方向几乎是相互垂直。
由此可以推断,SBD诱导淀粉链形成2个β转角,扭转了淀粉链的方向,使更多的底物向催化域中心靠近,产生底物‘定向效应’从而促进结合位点的亲和作用,提高酶的反应速率[4]。
O一糖基化连接域是一段约含70个氨基酸经高度糖基化的多肽链,糖质量分数约为70%,不同生物来源的糖化酶含O一糖基化连接域的比例不同,可变性较大。
该区域富含Ser和Thr残基,研究发现ser和Thr位点是寡聚糖O一糖基化的糖基化位点,且在生物活性条件下,甘露糖比半乳糖更容易以O一糖苷键连接到连接域的Ser和Thr 残基上,平均每个Ser和Thr残基上连有5个甘露糖。
在糖化酶结构中,O一糖基连接域起连接催化域(CD)和淀粉结合域(SBD)的作用。
O一糖基连接域与低聚糖以共价键结合,对蛋白质骨架起到固定化作用,从而避免糖化酶被蛋白酶水解,而它本身不具有增强糖化酶亲和力的作用。
此外,该结构域还具增强糖化酶热稳定性的作用。
1.2糖化酶的催化机制糖化酶催化域含有 400多个氨基酸残基,富含Ser和Ala两种氨基酸,其中Ser443和Ser444之间热稳定性较差,易断裂。
Sauer 等人研究了黑曲霉糖化酶,认为其催化水解α-1,4-糖苷键是典型的酸碱催化[3]。
Glu179和 Glu400分别为催化中心的质子供体和质子受体, Glu179提供的质子传递给淀粉链中易断裂键的糖苷键上,形成含氧碳正离子,在 Glu400协助下接受水的亲核攻击而使糖苷键断裂,同时使水解产生的α-D(+)-葡萄糖异构化生成β-D(+)构型。
糖化酶的底物具有特异性,糖化酶对底物的水解速率不仅取决于酶的分子结构, 同时也受到底物结构及大小的影响。
许多研究表明, 碳链越长, 亲和性越大。
它的最大反应速度随着碳链延长而增加, 呈线形变化。
糖化酶主要作用于α-1,4糖苷键, 对α-1,6 和β- 1,3 糖苷键也具有活性作用。
管汉成等[5]对黑曲霉变异株T-21葡萄糖淀粉酶的底物特异性进行了研究, 发现糖化酶 GAⅠ仅能水解多种淀粉及麦芽低聚糖生成唯一产物β-葡萄糖,不能水解甘露糖、木聚糖、地衣多糖、右旋糖苷及α- ,β- ,γ- 环状糊精,说明GAI对多糖中糖的组成及糖苷键具有较强的专一性。
2糖化酶的分离纯化研究史及工业化生产方法2.1糖化酶分离纯化研究史糖化酶的分离纯化是其进一步应用的基础,随着糖化酶的应用领域不断扩大和细化,开发筛选具有各种特性的糖化酶成为目前酶制剂研究领域的一个重要方向。
糖化酶的分离纯化主要包括细胞破碎、提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离和萃取分离等方法。
张贺迎等人[6]研究了耐热糖化酶的分离纯化,通过细胞破碎、过滤、离心得到粗酶液,再将粗酶液用 45 %~80 % 硫酸铵分级沉淀, 以去除部分色素和杂质蛋白。
沉淀先后用水、pH4.6 0.1 mol/L的 HAC- NaAC缓冲液透析平衡,上 DEAE-Cellulose-52离子交换柱层析。
再经过洗脱,收集对应于各洗脱峰的洗脱液得到了分离纯化后的耐热糖化酶,他们利用 DEAE- Cellulose- 52 柱层析和制备电泳纯化得到了 3 个耐热糖化酶组分,并测定了3个耐热糖化酶的最适温度和分子量。
李彧娜、石贵阳等人[7]从Rhizopus microsporus var.chinensis CICIM F0088菌株中分离纯化一种新的具有生淀粉降解能力的糖化酶,在分离纯化过程中,经过硫酸铵沉淀、双水相交换、DEAE-650M 阴离子层析、再经含0.100、200、300 mmol/L NaCl的醋酸–醋酸钠缓冲液(pH 6.0)梯度洗脱后,合并收集的活性组分,透析后冻干浓缩,冻干的酶粉用醋酸–醋酸钠缓冲液(pH 6.0)复溶,在Bio-Rad Model 491 Prep Cell上进一步分离,可收集的到得纯化后的样品。
李彧娜、石贵阳等人在KW-802.5 Shodex 凝胶过滤柱(300 mm×8 mm I.D.)上测定表观相对分子质量,其相对分子质量约为52×103。
潘丽军,张志英等人[8]对米根霉葡萄糖淀粉酶进行了分离纯化,经硫酸铵盐析、透析脱盐、Sephadex G-100柱层析等纯化步骤,葡萄糖淀粉酶比活力提高了23倍,,并用SDS-PAGE测得提纯后酶的相对分子量约为75.5kD。
此外,Michele Michelin等人[9]用离子交换层析和sephadx G-100对宛氏拟青霉产生的糖化酶进行了分离纯化,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定出了其分子量为86.5 kDa。