DPPH自由基SOP
清除DPPH自由基能力检测方法
清除DPPH自由基能力检测方法清除DPPH自由基能力是用来评价化合物在体外是否具有抗氧化活性的一种常用方法。
DPPH自由基是一种常用的自由基模型，其具有紫色，可通过其吸收峰的变化来反映清除能力。
以下是常用的几种用于检测清除DPPH自由基能力的方法：1.分光光度法分光光度法是一种常用的检测方法，基本原理是通过测量化合物与DPPH反应后的溶液吸光度的变化来评估清除DPPH自由基能力。
实验过程如下：1）准备1mM的DPPH乙醇溶液。
2）将待测化合物按一定浓度体系添加到相应的试管中。
3）将相同体积的DPPH溶液加入到每个试管中，混匀。
4）放置在室温下，静置反应30分钟。
5）使用紫外可见分光光度计测量反应体系的吸光度，计算清除率。
2.电子顺磁共振法（EPR）电子顺磁共振法是另一种常用的方法，通过测量化合物对DPPH自由基的清除能力，进而评估其抗氧化活性。
实验过程如下：1）准备含有DPPH和待测化合物的溶液。
2）使用电子顺磁共振仪测量样品的EPR信号，同时测量含有DPPH和不含DPPH的样品作为参比。
3）通过比较样品与参比的EPR信号来计算清除率。
3.原子力显微镜方法（AFM）原子力显微镜方法是一种非常灵敏的方法，可以用于直接观察化合物对DPPH自由基的清除作用。
实验过程如下：1）制备DPPH自由基薄膜。
2）将待测化合物沉积到DPPH自由基薄膜上。
3）使用原子力显微镜观察样品的表面形态变化。
4）通过观察DPPH颜色的变化和表面形态的变化来评估清除率。
4.荧光法荧光法是一种快速、灵敏且简便的检测方法，利用化合物与DPPH反应后荧光上转换的变化来评估清除DPPH自由基能力。
实验过程如下：1）制备DPPH乙醇溶液。
2）将待测化合物与DPPH溶液混合。
3）使用荧光光谱仪测量样品的荧光强度的变化。
4）通过荧光强度的变化来计算清除率。
总结：以上所述是几种常用于检测清除DPPH自由基能力的方法，分别基于吸光度、EPR、AFM和荧光等原理。
DPPH自由基清除与普用自由基清除实验（水溶液）-实验流程图-操作..
DPPH·自由基清除法(修改版)李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.6）【原理】1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基, 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, 简称为DPPH·自由基。
由于分子中存在大π键，所以，该自由基能稳定存在。
且在519nm处，有最大吸收波长。
当DPPH·自由基被清除时，其在519nm处的吸光度（A519nm），会相应地减少。
因此，通过检测A519nm值，可以判断DPPH·是否被清除。
如果某个样品能清除DPPH·，就具有一定的自由基清除活性（或称“抗氧化活性”）。
【操作图解】【计算公式】【说明】1. 样品溶液的浓度，也是可以调整的。
不过，为了方便实验，宜配高浓度（如3mg/mL）。
2. 操作图解中的用量，都是可以调整的，需要自行摸索。
3. 当样品溶液的加入量为0 μL 时，所测得的A值即为A0。
4. 实验最好做三个平行样，以减少误差。
【实例】二氢杨梅素的DPPH清除实验的结果二氢杨梅素样品：浓度：0.1mg/ml 溶剂：95%乙醇数据整理：二氢杨梅素原始数据：水溶液中“普用”自由基清除的实验操作图2019.6 【参考文献】Xican Li. 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide (PT IO•) Radical-scavenging: A New and Simple Antioxidant. Journal of Agricultural & Food Chemistry. 2017, 65, 6288−6297.【简介】“普用”自由基，原名是PTIO自由基。
它是一种能溶于水的自由基，所以，可以在水溶液中进行自由基的清除实验。
这比DPPH自由基清除实验更合理；因为DPPH自由基清除只能是有机溶剂（如乙醇、甲醇）中进行。
完整版DPPH自由基清除试验教学详细版
DPPH 实验步骤 一、原理：DPPH 是一种很稳定的氮中央的自由基,它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍,使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用.作为一种稳定的自由基,DPPH 可以捕获〔"去除"〕其他的自由基.因此通过参加DPPH 后观察某一化 学反响的速率是否减慢,来作为这一反响是否具有自由基反响本质的指标.由于DPPH 自由基在以520nm 为中央处具有强烈的吸收,因此在溶液中呈现深紫色,并且在被中和之后会 变为无色或浅黄色.DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其醇溶液呈紫色,且需低温避光储藏,具有 单一电子,故能接受一个电子或氢离子,在波长为517nm 下具有最大吸收.有自由基去除剂存在时,DPPH 的单电子被捕捉而使其颜色变浅,在最大光吸收波长处的吸光值下降,且 下降程度呈线性关系,吸光度水平的降低说明抗氧化性的增加,从而以评价试验样品的抗氧化水平.此抗氧化水平用抑制率来表示,抑制率越大,抗氧化性越强. 二、实验步骤：1 .配制0.1mM 的DPPH 溶液：配两次,每次取0.002gDPPH 溶于50mL 乙醇,避光保存.2 .配制0.5mg/mL 的Vc 溶液,至少2mL 〔设为阳性对照,选择性做〕3 .配制一定浓度的样品溶液,至少2mL 母液〔也可以配制不同溶度梯度样品,计算IC50〕5 .检测并计算去除率测517nm 处的吸光度,取平均值,计算每个浓 度的DPPH 去除率,做出折线图.去除率=〔1 - 〔 A sample - A blank 〕 / A control 〕 X 100% 4.上板〔避光操作,上完板后,室温避光30分钟,测吸光度〕 96孔板,三组,每组设 3个复孔,每孔参加量及 96孔板分布如下： sample 〔样品组〕：样品溶液100uL+ DPPH 醇溶液100uL 〔每个浓度3个孔〕 blank 〔空白组〕：样品溶液100uL+无水乙醇100uL 〔每个浓度3个孔〕 control 〔对照组〕：DPPH 醇溶液100uL+水100uL 〔一块板可共用一个对照组 ,3个孔〕 消除氧%〞 〔1-j 二为吧〕x1帆。
格锐思生物科技DPPH自由基清除能力试剂盒说明书
DPPH自由基清除能力试剂盒说明书（货号：G0128F分光法48样）一、产品简介：DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。
广泛用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。
此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。
当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，呈现的颜色越浅，即A值越低，进而对样本中DPPH清除能力进行定量分析。
二、试剂盒的组成和配制：试剂名称规格保存要求备注工作液粉剂×1瓶4℃保存临用前甩几下使试剂落入底部，再加入38mL无水乙醇充分溶解备用；用不完的试剂4℃避光保存;标准品粉剂×1支4℃保存若重新做标曲，则用到该试剂三、所需的仪器和用品：可见分光光度计、1mL玻璃比色皿（光径1cm）、离心机、可调式移液器、研钵、冰、甲醇、无水乙醇和蒸馏水。
四、DPPH自由基清除能力测定：建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！1、样本制备：①组织样本：称取约0.1g新鲜组织或者称取约0.05g烘干样本（将样本在105℃下杀青3min，然后60℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛，得到烘干样本），加入1mL的80%甲醇提取液（若鲜样需研磨均质），于60℃，200-300W条件下超声提取30min（间隔5min振荡混匀一次），若有损失需用80%甲醇定容至1mL。
12000rpm室温离心10min，取上清测定。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取②细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL 80%甲醇提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm室温离心10min，取上清测定。
DPPH和ABTS、PTIO自由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xic
DPPH•和ABTS+•自由基清除实验（含PTIO•自由基清除实验)：详细说明与疑难解答李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.7）（以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH•) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evidence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-Oxide (PTIO•) Radical Scavenging: A New and Simple Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297【概述】DPPH•、ABTS+•、PTIO•自由基三者，都是常用的自由基。
概述如下表：ABTS•自由基ABTS·+再稀释得其工作液。
紫色墨绿色蓝紫色1(50 μg/mL) (50 μg/mL)（0.07mM (NH)ABTS+0.03mM K S O）2（2）其抗氧化活性，实际上是清除氮自由基的活性（而不是氧自由基）。
（3）虽然DPPH的清除主要是HAT抽制，但是在不同溶剂中，其抗氧化机制是不同的，还可能有ET等。
DPPH 自由基清除能力检测试剂盒说明书
DPPH 自由基清除能力检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：BC4750 规格：50T/24S产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 规格 保存条件 提取液 液体50 mL×1瓶 2-8℃保存 试剂一 液体60 mL×1瓶（自备）常温保存 试剂二 粉剂×1瓶 2-8℃保存 试剂三粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1、 试剂一：无水乙醇自备；2、 试剂二：粉剂置于瓶内EP 管中。
临用前加入6.08 mL 试剂一振荡溶解，用不完的试剂可于-20℃保存1个月，建议分装保存，避免反复冻融；临用前根据试验所需量按照试剂二：试剂一（V:V ）= 4：21的比例配制成工作液，现配现用，用不完的工作液可于2-8℃保存一周；3、 试剂三：10 mg 维生素C 。
临用前加入1 mL 提取液，充分振荡溶解，配成10 mg/mL 维生素C 溶液，2-8℃保存两周；用于阳性对照。
产品说明：DPPH 自由基一种很稳定的氮中心的自由基，是样本抗氧化能力的重要指标之一，广泛应用于抗氧化类食品、保健品及药品的研究中。
DPPH 自由基有单电子，其醇溶液呈紫色，在515 nm 处有强吸收。
当有抗氧化剂存在时，DPPH 自由基被清除，其溶液颜色变浅，515 nm 的吸光度下降，在一定范围内其吸光度的变化与自由基被清除的程度成正比。
本试剂盒中，通过吸光度下降的程度来反映样本清除DPPH 自由基的能力。
DPPH · DPPH ·H注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅、台式离心机、无水乙醇、研钵/粉碎机、烘干箱、30~50目筛和蒸馏水。
操作步骤：一、样本的制备（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）（1）植物样本的制备：将新鲜样本置于60℃烘箱烘干至恒重，研钵研碎（或粉碎机粉碎），过30~50目筛。
清除DPPH自由基能力检测方法
DPPH自由基清除法[文献] Xican Li, Jing Lin, Yaoxiang Gao, Weijuang Han, Dongfeng Chen. Antioxidant activity and mechanism of Rhizoma Cimicifugae. Chemistry Central Journal. 2012; 6(1):140.[原理] DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。
分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。
N22当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。
DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。
[实验步骤]1.1 DPPH测试液的配制取DPPH 1mg溶于约20mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。
取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A＝1.2-1.3之间最佳。
该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。
1.2 样品液的配制样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。
溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。
1.3 预试取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。
此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。
【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量。
其用量梯度宜设为40、80、120 、160、200μL。
1.4测量A0值的测量：取DPPH溶液2 mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加95乙醇（或无水乙醇）1mL，充分混合，测A值（519nm），此A值为A0（A0多在0.7-0.9之间）。
新版dpph自由基清除实验-实验流程图-操作图解-李熙灿-Xican Li
1 DPPH 自由基清除/PTIO 自由基清除实验：实验流程图2018.4【前言】体内（细胞内）的自由基，可以分为两类：活性氧（ROS ，Reactive oxygen species ）和活性氮（RNS ，Reactive nitrogen species ）。
ROS 主要有羟基自由基·OH ，过氧自由基(·O 2-)，脂质过氧自由基(LOO ·)等；RNS 主要有一氧化氮（·NO ）等。
这些ROS 和RNS 如果过量堆积，会引起氧化应激，发生各种病变，加速机体衰老。
许多植物（特别是中药），对ROS 和RNS 都有较强的清除作用，这种清除作用可以缓解氧化应激，故称为抗氧化。
为了评价抗氧化活性的强弱，生物化学家建立了一系列的评价方法。
最常见的是DPPH 自由基清除法。
DPPH 自由基结构如下： NH N O 2N O 2NNO 2.其全称有数个：（1）1,1-二苯基-2-三硝基苯肼基自由基；（2）1,1-二苯基-2-苦肼基自由基；（3）2,2-二苯基-1-苦肼基自由基；（4）2,2-二苯基-1-三硝基苯肼基自由基；（5）α,α-二苯基-β-苦肼基自由基。
尽管如此，其简称都是“DPPH 自由基”。
RNS 和ROS 都是不稳定的（如·OH ，·O 2-， LOO ·，·NO ），很难直接评价。
不过，DPPH 自由基较稳定，因为N 原子上那个成单电子，可以与苯环形成p-π共轭。
稳定的DPPH 自由基的甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在519 nm 范围有最大吸收峰。
当向DPPH 自由基溶液中加入自由基清除剂(抗氧化剂)时，成单被配对，深紫色的DPPH 自由基被还原成黄色DPPH-H 分子，其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系，因而可以通过吸光度的变化进行定量分析。
当DPPH 自由基与抗氧化剂反应后，519nm 波长处的吸收值降低，其降低的程度与接收的电子（抗氧化剂清除自由基活性）呈定量关系，可以用分光光度计测定。
dpph自由基
DPPH自由基自由基是一种具有未成对电子的高度活性分子或离子，它们在生物体内的氧化还原反应中扮演着重要角色。
DPPH自由基是一种被广泛应用于评估抗氧化性能的化学试剂。
本文将探讨DPPH自由基的特性、作用机制以及在科研领域中的应用。
DPPH自由基的特性DPPH自由基全称2,2-二苯基-1-苦味肼，是一种具有深紫色的自由基。
其核心结构中包含一个氮原子和一个苯环，使其与其他自由基发生反应产生有机物的变化。
DPPH自由基通常用于测定食品、植物提取物等样品的抗氧化性能，因其简便、可靠被广泛应用于生物化学研究领域。
DPPH自由基的作用机制DPPH自由基的作用机制是通过捕捉其未成对电子，从而形成稳定的双电子产物。
在反应中，DPPH自由基的深紫色逐渐消退，从而使得反应物溶液由紫色转变为无色。
该反应可通过光谱法进行监测，根据吸光度变化定量分析待测物中的抗氧化成分含量。
DPPH自由基的应用DPPH自由基在科研领域中具有广泛应用，主要包括以下几个方面：•评估抗氧化性能： DPPH自由基可以用作评估样品的抗氧化性能的指标。
通过与待测物样品发生反应后测定残留DPPH自由基的含量，可以间接反映样品中抗氧化物质的含量和活性。
•筛选抗氧化剂： DPPH自由基反应可直观地显示待测物对自由基的清除能力，可用于筛选具有较高抗氧化活性的抗氧化剂，并用于研究新型抗氧化剂的发现。
•研究氧化还原反应： DPPH自由基还可用于研究氧化还原反应机理和动力学过程，帮助深入了解自由基参与的生物化学反应。
结语DPPH自由基在抗氧化研究领域中扮演着不可或缺的角色，其作用机制简单、易操作，并被广泛应用于抗氧化物质的评估和筛选。
通过对DPPH自由基的深入研究，可以更好地认识自由基反应的特征和生物体内氧化还原反应的机理，为开发新型抗氧化剂和保健食品提供重要参考。
欢迎广大读者深入阅读DPPH自由基相关文献，更全面地了解其在科研领域中的重要价值和应用前景。
DPPH自由基清除法实验教学(详细版)以高香草酸为例
DPPH自由基清除实验教学(详细版) —以高香草酸为例【仪器与试剂】1.仪器可见分光光度计；SB3200D超声波清洗机；电子天平（BS110S）；BIOHIT单道手动可调移液器（10-100μL、100-1000μL、1000-5000μL）；微量比色皿。
2.试剂高香草酸（AR）、DPPH（AR）、无水乙醇（AR）；【原理】根据文献[1]可知，DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，别名1,1-二苯基-2-苦肼基自由基，是一种其溶液呈紫色的稳定氮自由基。
这是因为其分子中，存在多个吸电子的硝基-NO2，还有苯环的π66共轭大π键。
图1. DPPH结构式图2. DPPH自由基的比例模型(斯陶特模型)DPPH自由基在波长519nm处有最大吸收。
随着自由基减少，其溶液在519nm处吸收会减少，其溶液的颜色也会变浅。
因为DPPH溶液吸光度和自由基浓度之间存在着正比关系，所以可以通过吸光度来计算自由基清除率。
因此DPPH自由基清除实验常用来检测抗氧化剂在体外清除自由基能力的强弱。
【实验对象】高香草酸（Homovanillic acid），学名“4-羟基-3-甲氧基苯乙酸”，分子式为C9H9O4，为儿茶酚胺（肾上腺素、去甲肾上腺素）的代谢产物。
高香草酸作为酚酸类物质，理论上应具有不错抗氧化活性，我们选取它作为实例来进行DPPH自由基清除实验步骤的详细介绍。
图3.高香草酸结构式图4.高香草酸的比例模型(斯陶特模型)【实验操作】清除DPPH能力检测本实验采用文献[1]的方法，并视情况改动。
大致过程如下：1. DPPH测试液的配置取DPPH 0.5mg溶于约20mL溶剂（无水乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。
取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A 在0.9左右。
该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。
DPPH自由基清除测定
DPPH 法测定黄苓黄酮的抗氧化活性 抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质， 其作用机理可以 是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。
目前对自由基清除剂的研究方法主要有 2类，一类是体外模型，另一类是体内模型， 其 中DPPH 法是体外模型中最常用的方法。
DPPH 又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基， 他的稳定性主 要来自共振稳定作用的 3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥 其应有的电子成对作用。
它的无水乙醇溶液呈紫色，在 517nm 波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。
向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH •使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。
即通过在517nm 波长 处检测样品清除DPPH •的效果，来计算抗氧化能力。
实验研究表明，黄苓黄酮中清除 DPPH 自由基活性的主要成分是黄苓苷 [1]，黄苓苷中含 有羧羟基和酚羟基能与 DPPH 反应，反应式如下： DPPH 与抗氧化剂反应原理材料：DPPH （ 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）；无水乙醇;仪器：分光光度计1. DPPH 贮备液的制备准确称取DPPH 试剂3 . 5mg ，用无水乙醇溶解，并定量转入 10mL 容量瓶中，用无水 乙醇定容至刻度，取2mL 至100ml 容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol / L DPPH 贮备液， 置于冰箱中冷藏备用。
2. 试液的制备（只作参考）准确称取5.2mg 干燥的黄酮提取物 （32.75%）,用无水乙醇溶解，并定量转入50ml 容量 瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取 10ml 至100ml 容量瓶中，摇匀得浓度为 0.0233mmol /L 试液。
3. DPPH-清除率的测定在10mL 比色管中依次加入 4.0mLDPPH 溶液和黄酮提取液，再加入无水乙醇至刻度， 混匀立即用1cm 比色皿在517nm 波长处测吸光值（A ），吸光值记为 Ai ，再在温室避光保存 30min 后测吸光值，记为 Aj ，对照试验为只加 DPPH 的乙醇溶液，其吸光值记为Ac 。
DPPH自由基清除法以阿魏酸为例
DPPH法测定抗氧化原理—以阿魏酸为例【基本原理】根据文献[1]可知，DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种在体外较为稳定的氮自由基，其结构式如图所示。
图1.DPPH结构式此自由基在519nm处有着最大吸收，其溶液显紫色。
随着自由基被清除，其溶液在519nm 处的吸光度会减少，颜色变浅，所以可用这一特性来测定自由基清除剂的清除自由基能力。
DPPH分子模型如图2.图2.DPPH 分子模型【实例】我们选取了阿魏酸作为实例。
阿魏酸（Ferulic acid），学名“3-甲氧基-4-羟基肉桂酸”，分子式为C10H10O4，是桂皮酸（又称肉桂酸，3苯基2丙烯酸，分子结构）的衍生物之一，最初在植物的种子和叶子中发现，是一种广泛存在于植物中的酚酸，在细胞壁中与多糖和蛋白质结合成为细胞壁的骨架。
它的结构式如下。
阿魏酸作为酚酸类化合物具有良好的抗氧化活性，能够与DPPH发生供氢反应，清除DPPH自由基，具有良好的清除自由基能力。
图3.阿魏酸结构式图4.阿魏酸分子结构【仪器与试剂】1.仪器可见分光光度计；SB3200D超声波清洗机；电子天平（BS110S）；BIOHIT单道手动可调移液器（10-100μL、100-1000μL、1000-5000μL）；微量比色皿；。
2.试剂阿魏酸（AR）、DPPH（AR）、无水乙醇（AR）；【实验操作】清除DPPH能力检测本实验采用文献[1]的方法，并视情况改动。
大致过程如下测定A0值：取DPPH溶液100μL 加至小试管中，加95%乙醇50μL，稀释混合，测A519nm值，此A值为A0（A0多在0.8-0.9之间）。
测定A值：取DPPH溶液100μL 加至小试管中，加阿魏酸溶液（0.0005mol/L）xμL（x为5、10、15、20、25、30、35、40），补加95%乙醇（50 –x）μL，混合，静置30min后，测A519nm值。
DPPH自由基清除测定
DPPH法测定黄芩黄酮的抗氧化活性抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。
目前对自由基清除剂的研究方法主要有2类，一类是体外模型，另一类是体内模型，其中DPPH法是体外模型中最常用的方法。
DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。
它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。
向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH·，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。
即通过在517nm波长处检测样品清除DPPH·的效果，来计算抗氧化能力。
实验研究表明，黄芩黄酮中清除DPPH自由基活性的主要成分是黄芩苷[1]，黄芩苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPPH反应，反应式如下：N N+O2NO2NNO2H+N NHO2NO2NNO2 DPPH与抗氧化剂反应原理材料：DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）；无水乙醇；仪器：分光光度计1.DPPH贮备液的制备准确称取DPPH试剂3．5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol／L DPPH贮备液，置于冰箱中冷藏备用。
2.试液的制备(只作参考)准确称取5.2mg干燥的黄酮提取物（32.75%）,用无水乙醇溶解，并定量转入50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0233mmol／L 试液。
3.DPPH·清除率的测定在10mL比色管中依次加入4.0mLDPPH溶液和黄酮提取液，再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(A)，吸光值记为Ai，再在温室避光保存30min后测吸光值，记为Aj，对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，其吸光值记为Ac。
DPPH氮自由基清除能力测试试剂盒酶标板法
DPPH氮自由基清除能力测试试剂盒酶标板法氮自由基（DPPH）清除能力测试试剂盒---酶标板法一、测定原理DPPH自由基是一种较稳定的含氮自由基，有一个单电子，在517nm下有强吸收，如果有其他物质提供一个电子使此单电子配对，其吸收会消失褪色，褪色程度与接受电子的量呈正比。
即反应物清除氮自由基的能力与试剂在517nm的吸光值成反比。
二、试剂组成试剂一：DPPH试剂100μL支试剂二：100μg/mL 维生素C标准溶液 1ml×1支三、储存条件及有效期试剂盒-20℃可保存6个月。
四、试剂的配制试剂一：37℃平衡20min以上，待试剂融化后，在试剂瓶中加入10ml 95%乙醇或无水乙醇，剧烈震荡使试剂充分溶解。
注意：溶解一定要充分，如有条件可采用超声波助溶。
试剂二应用液：根据是否需要制作阳性对照标准曲线有两种配制方法。
1. 如仅需要将维生素C作为质控品，可取100μL 试剂二，加入900μL样品稀释液，充分混匀，配制成10μg/mL 维生素C；2. 如需测定维生素C的IC50，可分别移取0，2，5，10，15，20，25，30，40，50μL 试剂二于空离心管中，再依次加入100，98，95，90，85，80，75，70，60，50 μL样品稀释液，充分混匀。
配制成0，2，5，10，15，25，30，40，50 μg/mL 维生素C样品。
五、操作步骤空白孔1测定孔对照孔2质控孔试剂一（μL）1001000100样品溶液（μL）100100试剂二应用液（μL）100样品稀释液（μL）100充分混匀，室温避光静置30min使之充分反应。
517nm处采用酶标仪测定吸光值。
1空白管很重要，建议做3个以上平行；2如样品颜色较浅可不做对照管六、计算公式注：1 如未做对照孔，可以将其视作为0；2 质控孔求值时将其视作测定孔进行计算即可。
七、注意事项1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔；2. 如不确定样品的氮自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。
dpph自由基清除实验
DPPH自由基清除实验引言自由基是一类具有不成对电子的化学物质，它们高度活跃且能够引发细胞氧化损伤。
因此，寻找有效的抗氧化剂来清除自由基对细胞和健康的影响至关重要。
DPPH（2，2-二苯基-1-苦味肼）是一种常用的化学试剂，被广泛用于评估抗氧化剂的活性。
本实验旨在使用DPPH自由基清除实验来评估抗氧化剂的抗氧化性能。
实验步骤1.准备实验样品，可以选择不同的抗氧化剂，如维生素C、维生素E等。
2.准备DPPH溶液，将适量的DPPH溶解在乙醇中，摇匀使其充分溶解，最后得到0.1 mM的DPPH溶液。
3.取一定量的DPPH溶液（如2 mL），加入试管中。
4.分别将不同浓度的抗氧化剂溶液（如0.1 mM，0.2mM，0.3 mM等）加入不同的试管中。
5.快速摇匀试管，使DPPH和抗氧化剂充分接触。
6.将试管放置在室温下静置15分钟，使反应充分进行。
7.使用分光光度计测定每个试管中溶液的吸光度，记录下数值。
数据处理1.计算抗氧化剂的清除率，清除率的计算公式为：（A₀ - A₁）/ A₀ × 100%。
其中，A₀为对照组（只有DPPH 溶液）的吸光度，A₁为实验组的吸光度。
2.绘制抗氧化剂浓度与清除率之间的曲线图，以展示不同浓度下清除率的变化趋势。
结果与讨论根据实验数据绘制的曲线图，可以看出抗氧化剂的清除率随着浓度的增加而增加。
这说明抗氧化剂对DPPH自由基具有较好的清除能力。
其中，浓度为0.3 mM的抗氧化剂表现出最大的清除率，清除率超过90%。
而浓度较低的抗氧化剂，如0.1 mM的清除率较低，仅为50%左右。
通过本实验可以初步评估抗氧化剂的抗氧化性能。
然而，需要注意的是实验中使用的DPPH自由基只是模拟体内自由基的一种方式，实际中还需要进一步研究抗氧化剂在体内的表现和效果。
结论本实验使用DPPH自由基清除实验评估了不同浓度抗氧化剂的抗氧化性能。
结果表明抗氧化剂的清除率随浓度的增加而增加，0.3 mM浓度的抗氧化剂表现出最佳的清除能力。
DPPH自由基清除测定
DPPH 法测定黄芩黄酮的抗氧化活性抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。
目前对自由基清除剂的研究方法主要有2类，一类是体外模型，另一类是体内模型，其中DPPH 法是体外模型中最常用的方法。
DPPH 又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。
它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm 波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。
向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH ·，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。
即通过在517nm 波长处检测样品清除D P PH ·的效果，来计算抗氧化能力。
实验研究表明，黄芩黄酮中清除DPPH 自由基活性的主要成分是黄芩苷[1]，黄芩苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPP H 反应，反应式如下：N N +O 2NO 2NNO 2H +N NHO 2N O 2NNO 2 DPPH 与抗氧化剂反应原理材料：DPPH （1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）；无水乙醇； 仪器：分光光度计1.DPPH 贮备液的制备准确称取DP P H 试剂3．5mg ，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL 容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL 至100ml 容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mm ol ／L DPPH 贮备液，置于冰箱中冷藏备用。
2.试液的制备(只作参考)准确称取5.2mg 干燥的黄酮提取物（32.75%）,用无水乙醇溶解，并定量转入50ml 容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml 至100ml 容量瓶中，摇匀得浓度为0.0233mm o l ／L 试液。
dpph自由基是什么
dpph自由基是什么
名称:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-
trinitrophenyl)hydrazyl)。
分子式:C18H12N5O6。
分子量:394。
32。
暗紫色大棱柱形晶体。
mp127-129度（分解）。
一般试剂含量不小于98％该品具有刺激性。
吸入、口服或皮肤接触有害。
大量使用应穿适当的防护服和戴手套。
主要用途是阻聚剂。
也常用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价。
DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基,他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍,使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。
DPPH法:DPPH法于1958年被提出,广泛用于地量测定生物试样、分类物质好和食品的抗氧化能力。
此法是根据DPPH自由基有单电子,在517nm处有一强吸收,其醇溶液呈紫色的特性。
当有自由基清除剂存在时,由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失,其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系,因而可用分光光度计进行快速的定量分析。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
主要目的：
——为了测定样品清除DPPH自由基的能力。
主要原理：
——自由基清除剂与DPPH单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用酶标仪进行快速的定量分析。
实验室签章
一、试剂
——1 ,1-二苯基-1-苦味肼基自由基（DPPH）——甲醇（分析纯）
二、仪器设备
——96孔酶标板
——UV-Vis可见多功能酶标仪
——移液枪
——200 µL量程枪头
三、实验方法
◆前期准备
配置2 g/L 的DPPH甲醇标准溶液。
◆DPPH自由基清除能力
参照Brand-Williams (1995)[1]报道的方法，将其稍加改动后应用在96孔酶标板中[2]。
在酶标板的每孔中，依次加入不同体积（10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 µL）的样品溶液和200 μL的DPPH标准溶液（2 g/L），最后用甲醇溶液补齐至总体积300 µL。
室温反应30 min后，于515 nm下用UV-Vis可见多功能酶标仪测定其吸光度（EL 340, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA）。
番茄样品消除自由基的能力表示为EC50（清除1 µg DDPH至50 %所需的样品用量（µg干重））。
EC50越小，表示抗氧化活性越高。
平行测定三次，取平均值计算。
清除DPPH自由基能力用如下公式计算：
清除率%=（1-
Ac Aj
Ai
）×100%
其中：Ai为样品溶液加DPPH试剂混合液的吸光度，Aj为样品溶液加甲醇的吸光度，Ac为DPPH溶液加样品溶剂的吸光度。
[1] Brand-Williams W, Cuvelier M E. Berset C. Use of a free radical method to evaluate
antioxidant activity [J]. LWT - Food Science and Technology, 1995, 28(1): 25-30.
[2] Verma A R, Vijayakumar M, Rao C V. Mathela C S. In vitro and in vivo antioxidant properties
and DNA damage protective activity of green fruit of Ficus glomerata [J]. Food and Chemical Toxicology, 2010, 48(2): 704-709.。