牛睾丸支持细胞分离、纯化及体外生长行为的研究

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）表１酶消化法分离牛胎儿睾丸支持细胞的结果ａ
件，牛睾丸支持细胞贴壁效果优于３７ ℃，但差异不显著Ｐ＞０．０５）。试验结果见表３。（
表３温度对原代支持细胞贴壁效果的研究
５（细胞数： × １０）（Ｍｅａｎ± ＳＤ）
Ｔａｂｌｅ３Ｅｆｆｅｃｔｉｏｎｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｏａｔｔａｃｈｉｎｇ
５ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｒｉｍａｒｙＳＣｓ（ｃｅｌｌｓ：× １０）
对比因素３７ ℃ ３８．５ ℃
接种密度１０１０
贴壁细胞数３．８３± ０．８５５．１５± ０．６６
贴壁率％
ａ３８．２９± ８．５４ａ５１．５３± ６．５７
睾丸支持细胞（ｓｅｒｔｏｌｉｃｅｌｌ，ＳＣ）及结构是Ｅｎｒｉｃａｌ在１８６５年首次描述的，因其在结构上为生精细胞分化提供支持，为生精过程提供能量及营养，因此称为生精细胞的“ 保姆细胞” 。在复杂动态生精过程中，支持细胞扮演重要角色，不但在向生精上皮传递促性腺激素过程中发挥中枢作用，控制生精细胞的有丝分裂、减数分裂及后续分化一系列动态过程，而且具有支持、营养、吞噬、释放、分泌等多种功能；同时，支持细胞之间形成的紧密连结构成血睾屏障，除阻止外来抗原进入睾丸，引发免疫应答外，还可防止自身抗原（生精细胞）与机
４细胞密度为１～２．０× １０个／ｍｌ，接种于２４孔培养板，
５ｈ后即可获得传代牛胎儿睾丸支持细胞单层。１．２．７牛胎儿睾丸支持细胞与胚胎共培养制备的牛胎儿睾丸支持细胞单层，使用前用胚胎培养液吹洗３次，以去除混杂于支持细胞间尚未贴壁的生殖细胞。加入５００ｌ胚胎培养液，移入受精卵，进行共培养，每隔４８ｈ μ 换液。观察受精卵发育情况及支持细胞生长情况。１．２．８数据处理与统计分析试验数据用ＳＰＳＳ１３．０处理，统计分析结果。
（细胞数： × １０）（Ｍｅａｎ± ＳＤ）Ｔａｂｌｅ１ＩｓｏｌａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｂｏｖｉｎｅｆｅｔａｌＳＣｓｂｙ
１］体接触引发的免疫应答［；支持细胞精细的协调作用，
（ＩＬ１，ＩＬ６）、生精生长因子（ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＳＧＦ）、神经营养素３（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３，ＮＴ３）、神经生长因子（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）、纤溶酶原激活等十多种营养和生长因子。同时，因为生物学特性及分泌因子的多样性，支持细胞的应用前景逐渐显露。目前支持细胞研究，已由起初的生精细胞共培养机制研究，延伸至器官移植、免疫豁免、克隆技术、细胞体外毒性研究等领域。已报道的睾丸支持细胞研究，主要集中在啮齿类动物，本试验以牛为研究对象，研究了牛睾丸支持细胞分离、纯化和体外的生物学特性，以期为相关研究提供依据。
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中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．２７Ｎｏ．５２００７
２．２酶消化法对支持细胞分离效果比较试验中对比了ＩＶ胶原酶（Ａ组）与胰蛋白酶＋ＥＤＴＡ（Ｂ组）对牛胎儿睾丸支持细胞的分离效果。结果显示，Ａ组细胞总数与细胞存活率均极显著高于Ｂ组（Ｐ＜０．０１），分离效果较好，见表１；但其细胞贴壁率Ｐ＞０．０５），见表２。略低于Ｂ组（
Ａ：５月龄牛胎儿睾丸织织ＨＥ染色（６００× ）；Ｂ：６月龄牛胎儿睾丸组织ＨＥ染色（６００× ）；Ｃ：新生牛睾丸组织ＨＥ染色（４００× ）
Ｆｉｇ．１ＢｏｖｉｎｅｔｅｓｔｉｓｔｉｓｓｕｅｓｔａｉｎｅｄｂｙＨＥ
源自文库
保证了精子发生正常有序地进行。近年来，随着对支持细胞研究的深入，其强大的内分泌调节功能引起越来越多的关注。研究表明支持细胞天然、稳定和高表
２］达ＦａｓＬ，是产生免疫耐受的功能细胞［，并能分泌雄
１材料与方法
１．１材料１．１．１材料来源４个５月龄牛胎儿睾丸、２个６月龄牛胎儿睾丸，采自乌鲁木齐天鹰屠宰场，月龄判断标准１个新生牛睾丸，由新参照秦鹏春《哺乳动物胚胎学》；疆乌鲁木齐种牛场一分厂提供。１．１．２试剂及器械Ｌ谷氨酸盐（Ｓｉｇｍａ）、谷胱甘肽（Ｓｉｇｍａ）、卡那霉素（Ｓｉｇｍａ）、胶原酶ＩＶ（ＣＬＳ，Ｓｉｇｍａ），胰蛋白酶（Ｓｉｇｍａ），新生牛血清（ＮＢＳ，Ｇｉｂｃｏ），ＤＭＥＭ培养基（Ｇｉｂｃｏ），瑞氏姬姆萨染色液（珠海贝索生物），其他化学试剂均为国产分析纯，实验用金属及玻璃器皿用前均清洗干净并高压灭菌处理。
２结果
２．１睾丸显微结构观察试验对５月龄、６月龄生殖器官发育明显的牛胎儿及新生牛睾丸组织，进行了组织学结构研究。显微观察表明，此期牛胎儿曲细精管中仅存在有位于曲细精管中央胞体较大、呈圆形的性原细胞和位于管周的支持细胞。结果见图１Ａ～Ｃ。
图１牛睾丸组织ＨＥ染色
收稿日期：２００７０１２３修回日期：２００７０３０８２００１３１１０２）新疆维吾尔自治区科技攻关项目（电子信箱：ｃｈｅｎｊｉｎｇｂｏ１２６＠１２６．ｃｏｍ通讯作者， — —兰州军区乌鲁木齐总医院实验科现工作单位—
摘要了解牛睾丸支持细胞体外培养的生物学特性，试验采用组合酶消化和选择贴壁法，将５月龄、６月龄牛胎儿及新生牛睾丸支持细胞分离纯化后进行体外培养。试验结果显示，这一阶段牛睾丸适宜支持细胞分离纯化用；采用０．２５％胰蛋白酶＋０．０２％ＥＤＴＡ二次消化法是一种经济有效的牛胎儿睾丸支持细胞分离方案；试验发现，牛胎儿睾丸支持细胞体外研究时间应控制在３～２０天内，处于对数生长期的牛胎儿睾丸支持细胞，对牛体外受精卵体外发育有明显的促进作用。关键词牛睾丸支持细胞体外培养生长行为中图分类号Ｑ９５４．４
２００７，２７（５）
１．２方法
赵云程等：牛睾丸支持细胞分离、纯化及体外生长行为的研究
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× １００％加入新培养１．２．５生长曲线测定取适量细胞悬液，
５液调整细胞密度为８× １０个／ｍｌ，接种于两块２４孔板
１．２．１取材与曲细精管离散取牛睾丸，一侧除去鞘膜及白膜，切取成约０．５～１．０ｃｍ的小块，立即置入多聚甲醛固定液中，按常规步骤制作石蜡切片，ＨＥ染色。另一侧或两侧连同阴囊置冰块中保存，２ｈ内带回实验５％的乙醇中浸泡室，剥离阴囊及鞘膜后，将睾丸置于７２ｍｉｎ，然后用加有双抗的无钙镁磷酸缓冲液（ＰＢＳ）冲洗３遍，在睾丸白膜上做Ｔ字形切口，取出睾丸实质组织，用添加双抗的ＰＢＳ漂洗３次，洗去血污后置平皿中。１．２．２支持细胞的酶解分离组织块离散后剪碎，采用两步酶消化法分离睾丸细胞。第一步消化时，Ａ组ｍｇ／ｍｌ胶原酶ＩＶ，Ｂ组（右侧睾丸）以（左侧睾丸）以１０．２５％胰蛋白酶和０．０２％ＥＤＴＡ室温下振荡消化１５ｍｉｎ，加入ＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ终止消化，５００ｒ／ｍｉｎ离ｍｉｎ弃上清。第二步消化均以０．２５％胰蛋白酶和心５０．０２％ＥＤＴＡ室温下消化１５ｍｉｎ，加入ＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ终止消化，１００目滤网过滤，１５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清。Ａ、Ｂ两组各取等体积睾丸细胞悬液，进行存活率测定，团块、碎片数测定，及贴壁率测定。１．２．３细胞计数取细胞悬液与０．５％台盼蓝１ ∶ １混匀后，在倒置显微镜下，用血球计数板计数圆形透明的活细胞数及染成蓝色的死细胞数，计算总数、存活率、细胞碎片及团块数。１．２．４细胞贴壁率取适量细胞悬液，加入新鲜培养１０个／ｍｌ接种，定时观察细胞液调整细胞密度为１× ｈ贴壁情况，当见到细胞开始贴壁时（体外培养约５后）小心倾斜培养皿，将尚未贴壁的生殖细胞随培养液一起吸去，用ＰＢＳＡ冲洗，加０．２５％胰蛋白酶和０．０２％ＥＤＴＡ消化已贴壁细胞５ｍｉｎ，加入等体积ＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ终止消化，取细胞悬液计数后，代入以下公式计算贴壁率：细胞贴壁率（％）＝（贴壁细胞数／接种细胞总数）
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（５）：９６～１００
牛睾丸支持细胞分离、纯化及体外生长行为的研究
，２，２赵云程１许琴刘赛１陈静波１（１新疆畜牧科学院乌鲁木齐８３００００２新疆农业大学动物科学学院乌鲁木齐８３００５２）
６
中，分别置于３７ ℃ 和３８．５ ℃、５％ＣＯ、饱和湿度条件下２培养，定时观察细胞贴壁情况，当见到细胞开始贴壁时（体外培养约５ｈ后）小心倾斜培养皿，将尚未贴壁的生殖细胞随培养液一起吸去，用ＰＢＳＡ冲洗后，重新加入培养液继续培养，即可获得贴壁牛胎儿睾丸支持细胞。试验自接种起，每隔２４ｈ各取３个孔，用血球计数板分别计数贴壁支持细胞数目，取平均值，连续进行７天。１．２．６支持细胞单层的制备选择接种７２ｈ后牛胎ＢＳＡ冲洗３儿睾丸支持细胞单层，吸除培养液并用Ｐ次，加入１ｍｌ０．２５％胰蛋白酶＋０．０２％ＥＤＴＡ消化至６０％细胞脱落，加入等量ＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ终止消化。１５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清。加入牛胚胎培养液调整
激素结合蛋白（ａｎｄｒｏｇｅｎｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＢＰ）、苗勒氏管抑制物质（ｍｕｌｌｅｒｉａｎｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｓｕｂｓｔａｎｃｅ，ＭＩＳ）、抑制素（ｉｎｈｉｂｉｎ）、激活素（ａｃｔｉｖｉｎ）、转化生长因子 β （ＴＧＦ）、胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ１）、白介素１和６ β