一种低温_淀粉酶的酶学性质研究_闫祥洲
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温度(℃) 图 1 温度对酶活的影响
由图 1 可知，该低温α-淀粉酶最适作用温度为 50 ℃，在 35～60 ℃之间均有较高的酶活。 2.2.2 低温α-淀粉酶的最适作用 pH 值
在 40 ℃的酶活测定反应体系中，分别调节 pH 值 为 2.2、2.5、3.0、3.5、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、 5.6、5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，测定结果如图 2 所示。
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0 制粒前理论值
实测值
图 3 酶的热稳定性
制粒后实测值
由图3可知，制粒前低温α-淀粉酶理论值为624 U/g， 实际检测值为603 U/g，经过85 ℃制粒后酶活为531 U/g， 酶活存留率达到 88.1%，说明在高温制粒过程中低温 α-淀粉酶具有较好的耐受性能，适用于饲料制粒工艺。 2.2.4 低温α-淀粉酶的耐酸性评估
作者简介：闫祥洲，副研究员，研究方向为动物营养。 通讯作者：吴勃。 收稿日期：2014-02-03
度比中温淀粉酶要低 20~30 ℃，因此，研究开发低温 淀粉酶对饲料用酶而言具有重要意义。
饲用淀粉酶应具备以下几个条件：在动物体温 （37~42 ℃）的温度条件下能发挥高的活性；最适 pH 值与消化道内食糜的 pH 相一致；对淀粉有高的酶解 效率（内切酶）；具有良好的稳定性（在饲料高温制粒 过程中的稳定性、保存过程中的稳定性以及在动物消 化道中对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、金属离子等的耐 受性）[7]。本研究根据饲用α-淀粉酶的所需条件，对 低温α-淀粉酶的酶学性质进行了研究，为饲料专用淀 粉酶的开发提供参考。 1 材料和方法 1.1 菌种
淀粉是单胃动物能量的主要来源，其供能占总能 量需求的 60%～80%。幼龄动物消化系统发育不成 熟，淀粉酶分泌不足，限制了淀粉的消化吸收。随着 动物日粮配方的富营养化、饲养条件应激和环境污染 问题越来越突出，成年健康动物添加“外源性营养消 化酶”的作用也越来越明显，意义也越来越大。通过 添加外源性淀粉酶来提高饲料淀粉的消化吸收，对于 提高动物生产性能、节约饲料资源意义重大。
lase in the low temperature. Analyzing the enzyme products, the molecular focused on below 5 000,
which was to 70.26%.
Key words：cold-active α-amylase；enzyme characteristics；enzyme products
的体积(ml)；
酶活百分比(%)
T0——空白溶液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液 的体积(ml)；
f——0.05 mol硫代硫酸钠溶液浓度的校正系数； 1.62——换算系数； 1/10——该分析方法的常数（相当于 10 mg 葡萄
糖的还原糖）； n——样品的稀释倍数。 2 试验结果 2.1 产酶菌株的发酵培养与活力检测 在固体发酵培养基中添加不同的碳、氮源及微量 的无机盐，将经过筛选和育种得到的菌株接入固体发 酵培养基中，30 ℃培养 50 h。烘干、粉碎后测定低温 淀粉酶活力，发现固体发酵培养基为麸皮 50%、大豆 粉 25%、玉米粉 15%、玉米芯 7%、葡萄糖 2%、酵母膏 0.35% 、MgSO4 0.04% 、KH2PO4 0.1% 、CaCl2 0.01% 、 NH4Cl 0.5%时，酶活高达 3 820 U/g。 2.2 酶学性质的研究 2.2.1 低温α-淀粉酶作用温度的研究 在 pH 值 5.0 的酶活测定反应体系中，分别在 25、 30、35、40、45、50、55、60 ℃温度下测定酶活，温度对 酶活的影响如图 1。
的酶是一种内切型淀粉酶，最适作用温度为 50 ℃，最适作用 pH 值为 5.2。该酶具有较好的耐热性和
耐酸性，经 85 ℃高温制粒，酶活存留率达 88.1%；用 pH 值 4.0 的乙酸-乙酸钠缓冲液处理 4 h 后，酶活
存留率达 90%以上。体外模拟耐胃蛋白酶试验，证明胃蛋白酶对该低温α-淀粉酶无影响。对酶解产
Yan Xiangzhou, Liu Jin'ai, Wu Bo, Du Xiaoyang, Chen Minjie, He Junjia
Abstract：Strain producing cold-active α-amylase want to be isolated through spread platemethod and
模拟动物体内生理环境，在温度 40 ℃条件下，加 入 1 mg/ml 的新鲜胃蛋白酶盐溶液（0.1 N，pH 值 3.5）， 处理 5 h，每隔 1 h 测定淀粉酶活，见图 5。
由图 5 可知，在 pH 值 3.5、温度 40 ℃、用 1 mg/ml 的胃蛋白酶溶液处理淀粉酶 5 h 后，淀粉酶活力存留 仍在 80%以上。
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pH 值
图 2 pH 值对酶活的影响
酶活百分比(%)
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时间(h)
图 5 耐胃蛋白酶试验
酶活(U/g)
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line separation. Enzymatic properties of the strain will be determined. The enzyme has good heat resis⁃
tance and acid resistance, to granulate through 85 ℃ high temperature, the livability of the enzyme
将制得的酶液分别用 pH 值 3.5、4.0、4.5 的乙酸乙酸钠缓冲液处理 0、1、2、3、4 h，测定淀粉酶活力，结 果如图 4 所示。
酶活百分比(%)
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pH 值 3.5 pH 值 4.0
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图 4 低温淀粉酶的耐酸性
用 pH 值 3.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液处理 4 h 后，淀 粉酶活力存留 80%以上，经 pH 值 4.0 的乙酸-乙酸钠 缓冲液处理 4 h 后，淀粉酶活力存留 90%以上，说明该 淀粉酶耐酸性良好。 2.2.5 体外模拟耐胃蛋白酶试验
2.2.6 HPLC 对酶解产物的分析
取一定量 5%的淀粉溶液，预热保温 40 ℃，加入
一定量的低温淀粉酶，控制反应时间为 30 min，然后
沸水浴 5 min 使酶失活，微孔膜过滤后，利用 HPLC 分
析样品中各物质的分子量分布，图谱峰见图 6。
由图 2 可知，该低温淀粉酶最适作用 pH 值为 5.2， 在 pH 值 4.0～6.0 之间均有较高的酶活。 2.2.3 低温α-淀粉酶的热稳定性
为了准确评估低温淀粉酶经饲料高温制粒后的实 际存留率，本试验在饲料中添加 20%的低温α-淀粉酶， 然后进行 85 ℃高温制粒后进行评估，试验结果见图 3。
从采集到的样品中分离纯化并经诱变育种得到。 1.2 培养基
固体发酵培养基组成：麸皮 50%、大豆粉 25%、玉 米粉 15%、玉米芯 7%、葡萄糖 2%、酵母膏 0.35%、Mg⁃ SO4 0.04%、KH2PO4 0.1%、CaCl2 0.01%、NH4Cl 0.5%。 1.3 药品和试剂
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酶制剂
was 88.1%;Using buffer solution of cetic acid and sodium acetate with pH 4.0, the livability of the en⁃
zyme was more than 90%.The test of pepsin resistance proved that the pepsin has no effect to α-amy⁃
2014 年第 35 卷第 6 期 总第 459 期
SILIAO GONGYE
一种低温α-淀粉酶的酶学性质研究
■ 闫祥洲 1 刘金爱 2 吴 勃 2 杜晓阳 2 陈敏杰 2 何俊佳 2
( 1. 河南省农业科学院，河南郑州 450002；2. 杭州保安康生物技术有限公司，浙江杭州 311508）
摘 要：经分离纯化及诱变育种得到 1 株低温α-淀粉酶高产菌株。研究结果表明，该菌株产生
物进行分析，分子量集中在 5 000 以下，比例达到 70.26%。
关键词：低温α-淀粉酶；酶学性质；酶解产物
doi:10.13302/j.cnki.fi.2014.06.004
中图分类号：Q55
文献标识码：A
文章编号：1001-991X（2014）06-0015-03
Screening and identification of cold-active α- amylase and its amylase characterization
目前饲料专用淀粉酶的研究开发较少，一般均采 用食品加工、化纤、印染等工业用酶。中温α-淀粉酶 是饲料工业中应用最多的淀粉酶，其最适作用温度为 70~80 ℃，pH 值 5.0 以下失活严重。动物生理环境温 度一般为 37~42 ℃，胃内 pH 值较低，中温淀粉酶在动 物消化道内发挥作用甚微。低温淀粉酶最适作用温
2014 年第 35 卷第 6 期 总第 459 期
1.3.1 0.05 mol 硫代硫酸钠 将 13 g Na2S2O3·5H2O 和 0.1 g 无水碳酸钠溶解
定容至 1 000 ml。 1.3.2 费林试剂
铜溶液：硫酸铜34.66 g 溶解在水中，定容至500 ml。 酒石酸钾钠碱溶液：酒石酸钾钠 173 g 和氢氧化 钠 50 g 溶解在水中，定容至 500 ml。 使用前，精确地取等体积的铜溶液和碱液充分混合。 1.3.3 1 mol/l 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH 值 5.0） 1 mol/l 乙酸钠溶液：三水合乙酸钠溶解在水中， 定容至 250 ml；1 mol/l 乙酸溶液：冰乙酸 15 ml 溶解在 水中，定容至 250 ml；将 1 mol/l 乙酸钠溶液加入到 1 mol/l 的乙酸溶液中，调 pH 值至 5.0。 1.3.4 30%碘化钾溶液 将碘化钾 150 g 溶解于 350 ml 水中，保存在褐色 试剂瓶中，避免阳光直射。 1.3.5 25%硫酸溶液 硫酸 125 g 溶于 373 ml 水中。 1.3.6 可溶性淀粉溶液（pH 值 5.0） 将可溶性淀粉（试剂级）在 105 ℃干燥 4 h 后称量 计算含水量。然后，根据可溶性淀粉的含水量称取 0.5 g（折干）的可溶性淀粉，缓慢加入到 50 ml 水中，煮 沸 5 min，用自来水冷却后，加入 1 mol/l 乙酸-乙酸钠 缓冲溶液（pH 值 5.0）5 ml，用水定容至 100 ml。 1.4 低温淀粉酶活力的测定方法 将可溶性淀粉溶液加到 100 ml Erlenmyer 三角瓶 中，置于（40±0.5）℃恒温水浴中。预热10~15 min,加入样 品稀释酶液，准确加热 30 min 后。加入费林试剂使酶 失活。将三角烧瓶直接在煤气喷灯（或电炉）上加热 2 min 后，立即放在自来水中冷却。随后，加入 30%碘 化钾溶液和 25%硫酸溶液，用 0.05 mol/l 硫代硫酸钠溶 液滴定游离出的碘，以蓝色消失作为滴定终点 T3（0 ml）。 空白对照试验：以水取代酶液。在另一个三角烧 瓶中用上述同样的操作步骤测定空白对照值 T0，临近 终点时，加入 1%可溶性淀粉溶液 1~2 滴，以蓝色消失 作为滴定终点。 酶活力单位定义为：1 g 固体酶粉（或 1 ml 液体 酶），于 40 ℃、pH 值 5.0 条件下，反应 30 min，反应液中 产生相当于 10 mg 葡萄糖的还原糖所需的酶量为 1 个 酶活力单位。 淀粉酶活力（U/ml）=（T0-T30）×f×1.62×1/10×n 式中：T30——酶反应液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液
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温度(℃) 图 1 温度对酶活的影响
由图 1 可知，该低温α-淀粉酶最适作用温度为 50 ℃，在 35～60 ℃之间均有较高的酶活。 2.2.2 低温α-淀粉酶的最适作用 pH 值
在 40 ℃的酶活测定反应体系中，分别调节 pH 值 为 2.2、2.5、3.0、3.5、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、 5.6、5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，测定结果如图 2 所示。
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实测值
图 3 酶的热稳定性
制粒后实测值
由图3可知，制粒前低温α-淀粉酶理论值为624 U/g， 实际检测值为603 U/g，经过85 ℃制粒后酶活为531 U/g， 酶活存留率达到 88.1%，说明在高温制粒过程中低温 α-淀粉酶具有较好的耐受性能，适用于饲料制粒工艺。 2.2.4 低温α-淀粉酶的耐酸性评估
作者简介：闫祥洲，副研究员，研究方向为动物营养。 通讯作者：吴勃。 收稿日期：2014-02-03
度比中温淀粉酶要低 20~30 ℃，因此，研究开发低温 淀粉酶对饲料用酶而言具有重要意义。
饲用淀粉酶应具备以下几个条件：在动物体温 （37~42 ℃）的温度条件下能发挥高的活性；最适 pH 值与消化道内食糜的 pH 相一致；对淀粉有高的酶解 效率（内切酶）；具有良好的稳定性（在饲料高温制粒 过程中的稳定性、保存过程中的稳定性以及在动物消 化道中对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、金属离子等的耐 受性）[7]。本研究根据饲用α-淀粉酶的所需条件，对 低温α-淀粉酶的酶学性质进行了研究，为饲料专用淀 粉酶的开发提供参考。 1 材料和方法 1.1 菌种
淀粉是单胃动物能量的主要来源，其供能占总能 量需求的 60%～80%。幼龄动物消化系统发育不成 熟，淀粉酶分泌不足，限制了淀粉的消化吸收。随着 动物日粮配方的富营养化、饲养条件应激和环境污染 问题越来越突出，成年健康动物添加“外源性营养消 化酶”的作用也越来越明显，意义也越来越大。通过 添加外源性淀粉酶来提高饲料淀粉的消化吸收，对于 提高动物生产性能、节约饲料资源意义重大。
lase in the low temperature. Analyzing the enzyme products, the molecular focused on below 5 000,
which was to 70.26%.
Key words：cold-active α-amylase；enzyme characteristics；enzyme products
的体积(ml)；
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T0——空白溶液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液 的体积(ml)；
f——0.05 mol硫代硫酸钠溶液浓度的校正系数； 1.62——换算系数； 1/10——该分析方法的常数（相当于 10 mg 葡萄
糖的还原糖）； n——样品的稀释倍数。 2 试验结果 2.1 产酶菌株的发酵培养与活力检测 在固体发酵培养基中添加不同的碳、氮源及微量 的无机盐，将经过筛选和育种得到的菌株接入固体发 酵培养基中，30 ℃培养 50 h。烘干、粉碎后测定低温 淀粉酶活力，发现固体发酵培养基为麸皮 50%、大豆 粉 25%、玉米粉 15%、玉米芯 7%、葡萄糖 2%、酵母膏 0.35% 、MgSO4 0.04% 、KH2PO4 0.1% 、CaCl2 0.01% 、 NH4Cl 0.5%时，酶活高达 3 820 U/g。 2.2 酶学性质的研究 2.2.1 低温α-淀粉酶作用温度的研究 在 pH 值 5.0 的酶活测定反应体系中，分别在 25、 30、35、40、45、50、55、60 ℃温度下测定酶活，温度对 酶活的影响如图 1。
的酶是一种内切型淀粉酶，最适作用温度为 50 ℃，最适作用 pH 值为 5.2。该酶具有较好的耐热性和
耐酸性，经 85 ℃高温制粒，酶活存留率达 88.1%；用 pH 值 4.0 的乙酸-乙酸钠缓冲液处理 4 h 后，酶活
存留率达 90%以上。体外模拟耐胃蛋白酶试验，证明胃蛋白酶对该低温α-淀粉酶无影响。对酶解产
Yan Xiangzhou, Liu Jin'ai, Wu Bo, Du Xiaoyang, Chen Minjie, He Junjia
Abstract：Strain producing cold-active α-amylase want to be isolated through spread platemethod and
模拟动物体内生理环境，在温度 40 ℃条件下，加 入 1 mg/ml 的新鲜胃蛋白酶盐溶液（0.1 N，pH 值 3.5）， 处理 5 h，每隔 1 h 测定淀粉酶活，见图 5。
由图 5 可知，在 pH 值 3.5、温度 40 ℃、用 1 mg/ml 的胃蛋白酶溶液处理淀粉酶 5 h 后，淀粉酶活力存留 仍在 80%以上。
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酶活百分比(%)
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图 2 pH 值对酶活的影响
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图 5 耐胃蛋白酶试验
酶活(U/g)
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line separation. Enzymatic properties of the strain will be determined. The enzyme has good heat resis⁃
tance and acid resistance, to granulate through 85 ℃ high temperature, the livability of the enzyme
将制得的酶液分别用 pH 值 3.5、4.0、4.5 的乙酸乙酸钠缓冲液处理 0、1、2、3、4 h，测定淀粉酶活力，结 果如图 4 所示。
酶活百分比(%)
120
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pH 值 3.5 pH 值 4.0
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pH 值 4.5
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图 4 低温淀粉酶的耐酸性
用 pH 值 3.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液处理 4 h 后，淀 粉酶活力存留 80%以上，经 pH 值 4.0 的乙酸-乙酸钠 缓冲液处理 4 h 后，淀粉酶活力存留 90%以上，说明该 淀粉酶耐酸性良好。 2.2.5 体外模拟耐胃蛋白酶试验
2.2.6 HPLC 对酶解产物的分析
取一定量 5%的淀粉溶液，预热保温 40 ℃，加入
一定量的低温淀粉酶，控制反应时间为 30 min，然后
沸水浴 5 min 使酶失活，微孔膜过滤后，利用 HPLC 分
析样品中各物质的分子量分布，图谱峰见图 6。
由图 2 可知，该低温淀粉酶最适作用 pH 值为 5.2， 在 pH 值 4.0～6.0 之间均有较高的酶活。 2.2.3 低温α-淀粉酶的热稳定性
为了准确评估低温淀粉酶经饲料高温制粒后的实 际存留率，本试验在饲料中添加 20%的低温α-淀粉酶， 然后进行 85 ℃高温制粒后进行评估，试验结果见图 3。
从采集到的样品中分离纯化并经诱变育种得到。 1.2 培养基
固体发酵培养基组成：麸皮 50%、大豆粉 25%、玉 米粉 15%、玉米芯 7%、葡萄糖 2%、酵母膏 0.35%、Mg⁃ SO4 0.04%、KH2PO4 0.1%、CaCl2 0.01%、NH4Cl 0.5%。 1.3 药品和试剂
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酶制剂
was 88.1%;Using buffer solution of cetic acid and sodium acetate with pH 4.0, the livability of the en⁃
zyme was more than 90%.The test of pepsin resistance proved that the pepsin has no effect to α-amy⁃
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一种低温α-淀粉酶的酶学性质研究
■ 闫祥洲 1 刘金爱 2 吴 勃 2 杜晓阳 2 陈敏杰 2 何俊佳 2
( 1. 河南省农业科学院，河南郑州 450002；2. 杭州保安康生物技术有限公司，浙江杭州 311508）
摘 要：经分离纯化及诱变育种得到 1 株低温α-淀粉酶高产菌株。研究结果表明，该菌株产生
物进行分析，分子量集中在 5 000 以下，比例达到 70.26%。
关键词：低温α-淀粉酶；酶学性质；酶解产物
doi:10.13302/j.cnki.fi.2014.06.004
中图分类号：Q55
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文章编号：1001-991X（2014）06-0015-03
Screening and identification of cold-active α- amylase and its amylase characterization
目前饲料专用淀粉酶的研究开发较少，一般均采 用食品加工、化纤、印染等工业用酶。中温α-淀粉酶 是饲料工业中应用最多的淀粉酶，其最适作用温度为 70~80 ℃，pH 值 5.0 以下失活严重。动物生理环境温 度一般为 37~42 ℃，胃内 pH 值较低，中温淀粉酶在动 物消化道内发挥作用甚微。低温淀粉酶最适作用温
2014 年第 35 卷第 6 期 总第 459 期
1.3.1 0.05 mol 硫代硫酸钠 将 13 g Na2S2O3·5H2O 和 0.1 g 无水碳酸钠溶解
定容至 1 000 ml。 1.3.2 费林试剂
铜溶液：硫酸铜34.66 g 溶解在水中，定容至500 ml。 酒石酸钾钠碱溶液：酒石酸钾钠 173 g 和氢氧化 钠 50 g 溶解在水中，定容至 500 ml。 使用前，精确地取等体积的铜溶液和碱液充分混合。 1.3.3 1 mol/l 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH 值 5.0） 1 mol/l 乙酸钠溶液：三水合乙酸钠溶解在水中， 定容至 250 ml；1 mol/l 乙酸溶液：冰乙酸 15 ml 溶解在 水中，定容至 250 ml；将 1 mol/l 乙酸钠溶液加入到 1 mol/l 的乙酸溶液中，调 pH 值至 5.0。 1.3.4 30%碘化钾溶液 将碘化钾 150 g 溶解于 350 ml 水中，保存在褐色 试剂瓶中，避免阳光直射。 1.3.5 25%硫酸溶液 硫酸 125 g 溶于 373 ml 水中。 1.3.6 可溶性淀粉溶液（pH 值 5.0） 将可溶性淀粉（试剂级）在 105 ℃干燥 4 h 后称量 计算含水量。然后，根据可溶性淀粉的含水量称取 0.5 g（折干）的可溶性淀粉，缓慢加入到 50 ml 水中，煮 沸 5 min，用自来水冷却后，加入 1 mol/l 乙酸-乙酸钠 缓冲溶液（pH 值 5.0）5 ml，用水定容至 100 ml。 1.4 低温淀粉酶活力的测定方法 将可溶性淀粉溶液加到 100 ml Erlenmyer 三角瓶 中，置于（40±0.5）℃恒温水浴中。预热10~15 min,加入样 品稀释酶液，准确加热 30 min 后。加入费林试剂使酶 失活。将三角烧瓶直接在煤气喷灯（或电炉）上加热 2 min 后，立即放在自来水中冷却。随后，加入 30%碘 化钾溶液和 25%硫酸溶液，用 0.05 mol/l 硫代硫酸钠溶 液滴定游离出的碘，以蓝色消失作为滴定终点 T3（0 ml）。 空白对照试验：以水取代酶液。在另一个三角烧 瓶中用上述同样的操作步骤测定空白对照值 T0，临近 终点时，加入 1%可溶性淀粉溶液 1~2 滴，以蓝色消失 作为滴定终点。 酶活力单位定义为：1 g 固体酶粉（或 1 ml 液体 酶），于 40 ℃、pH 值 5.0 条件下，反应 30 min，反应液中 产生相当于 10 mg 葡萄糖的还原糖所需的酶量为 1 个 酶活力单位。 淀粉酶活力（U/ml）=（T0-T30）×f×1.62×1/10×n 式中：T30——酶反应液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液