土壤中砷的处理

土壤中砷的处理

1 引言

砷是一类广泛存在于土壤中的具有致癌作用的类金属元素，主要来源于含砷农药、化肥的施用及含砷污水灌溉等.据雷鸣等(2008)的调查，湖南郴州、衡阳等地稻田砷污染较严重，土壤砷含量最高达245 mg·kg-1，导致大米砷含量超标，造成严重的健康威胁和巨大的经济损失.同时，砷作为一种变价元素，不同价态毒性及生物有效性有较大差异，如三价砷生物毒性是五价砷的60~100倍.此外，水分可通过改变土壤氧化还原电位、铁锰氧化物等变价元素的价态而影响砷的生物有效性及其环境风险，如淹水导致As(Ⅴ)向As(Ⅲ)转化，提高了土壤中As(Ⅲ)的含量;同时，土壤水分会影响水稻籽粒中砷含量，灌浆期后湿润灌溉可显著降低糙米中砷含量.研究表明，稻田土壤水分含量可影响并改变土壤溶液及稻米中砷含量，而控制土壤水分含量是解决稻田土壤砷污染问题的有效途径之一，并揭示出水分是影响砷毒性的主要因素之一，尤其是在稻田土壤上.因此，需对二者作用关系进行系统探讨.

土壤酶是土壤的重要组成成分，土壤中所有生物化学过程的发生都得益于土壤酶的作用.酶促反应动力学是研究酶催化反应速度及各种因素(如污染物等)影响的方法，其结果不仅可显示土壤酶总量的高低，而且还可以反映酶与底物、重金属污染物等之间结合的紧密程度和作用过程，从而能深入探讨污染物与酶作用机理，故被认为是一种理想的研究手段.目前，国内外学者对砷的土壤酶效应进行了研究，发现有激活、抑制和无关3种作用，如As(Ⅴ)会抑制碱性磷酸酶及芳基硫酸酯酶活性，而As(Ⅲ)则不敏感;砷能激活土壤脲酶活性.对不同水分下土壤酶作用机理的研究也有零星报道，如Zhang等(2009a;2009b)发现，土壤脱氢酶活性及酶促最大反应速度均随水分含量升高而增加;高水分含量增强了磷酸酶与底物亲和力，提高了最大反应速度;淹水对土壤脲酶动力学参数无显著影响(隽英华等，2011).但目前对不同水分条件下砷与酶作用机理的研究则鲜见报道.因此，本文拟采用室内模拟培养试验的方法，从酶动力学角度研究水分对砷与土壤碱性磷酸酶关系的影响，揭示砷对碱性磷酸酶的作用受水分影响的机理，以期为稻田土壤砷污染的准确监测和保护修复提供依据.

2 材料与方法

2.1 供试土壤

供试土壤为采自江苏省中国科学院常熟农业生态试验站的水稻土(底潜铁聚水耕人为土，Endogleyic Fe-accumuli-Stagnic Anthrosols).采样时，先去除0~5 cm表层土，采用五点法取5~20 cm土样，混匀风干，过1 mm尼龙筛备用.常规方法测定土壤基本化学性质(鲍士旦，1997)，结果为有机质47.69 g·kg-1，pH=6.93(水土比2.5:1)，全氮3.1 g·kg-1，全磷0.61 g·kg-1，全钾18.02 g·kg-1，碱解氮10.66 mg·kg-1，速效磷11.74 mg·kg-1，速效钾112.90 mg·kg-1，阳离子交换量26.20 cmol·kg-1，游离氧化铁2.43 g·kg-1，总砷8.70 mg·kg-1，有效砷(0.5 mol·L-1 NaHCO3)0.32 mg·kg-1.

2.2 试验方案

向600 g土样中添加不同浓度的As(Ⅴ)(Na3AsO4·12H2O，AR)溶液，使As(Ⅴ)含量分别为0、25、50、100、200、400 mg·kg-1，并调节土壤含水量为最大持水量(WHC)的35%、65%、110%，

分别代表土壤水分条件为干燥、湿润及淹水.混匀后加盖密闭，于(25±1)℃的培养箱中暗培养，期间称重法控制土壤水分含量;定期(1、8、15、30 d)取样测定并计算酶动力学参数.

土壤碱性磷酸酶动力学测定：在3.00 g土壤中加入0.25 mL甲苯，15 min后添加20 mL采用缓冲液(pH=9.4)配制的不同浓度(0.0010、0.0025、0.0050、0.010 mol·L-1)的磷酸苯二钠溶液，37 ℃培养，定时取样，采用磷酸苯二钠比色法测定土壤磷酸酶活性(关松荫，1987).每个处理重复3次，并设无底物和无土壤处理为对照.

2.3 数据处理

土壤酶动力学参数Km、Vmax的计算参考文献，具体而言，米氏常数Km和最大反应速度Vmax 可用Michaelis方程的积分式计算：

经数学变换和整理得到：

式中，t为酶促反应时间(h)，S0、St分别是初始时刻和t时刻底物浓度(mmol·L-1).可见，上式是一条1/t×ln(S0/St)对1/t×(S0-St)的直线方程.在反应期间通过测定不同时间段利用的底物浓度(或生成的产物浓度)，并通过线性回归，即可求得Km和Vmax值.

土壤酶促反应速度常数k计算如下(和文祥等，2001)：

式中，t为酶促反应时间(h)，S0、St分别是初始时刻和t时刻底物浓度(mmol·L-1).

砷对土壤酶抑制常数Ki的计算见文献(朱铭莪，2011;谭向平，2014)，其中，竞争性抑制动力学方程为：

式中，Ki为抑制常数(mmol·L-1);Km*为抑制剂存在下表观米氏常数(mmol·L-1);C为外源砷剂量(mg·kg-1).

线性混合抑制动力学方程为：

式中，Vmax* 为抑制剂存在时酶表观最大速率(μg·g-1·h-1);KS*为酶-底物表观解离常数(mmol·L-1).对于线性混合型抑制，V*max=Vmax/β，Ks*=(α/β)Ks;其中：

式中，I为抑制剂浓度(mg·kg-1)，δKi为酶-底物-抑制剂解离常数(mmol·L-1)，δ可表示酶-抑制剂对底物的亲和力.

采用Microsoft Excel 2013和SPSS19.0软件对数据进行方差分析及模型拟合，LSD法对各处理间差异进行多重比较.

3 结果与分析

3.1 砷对碱性磷酸酶酶促反应动力学特征影响

3.1.1 米氏常数Km的变化

米氏常数Km表征酶与底物结合牢固程度，在数值上等于初速度达到最大反应速度1/2时的底物浓度.Km值越小，表明酶与底物结合越牢固，亲合力越大(和文祥等，1997).从表 1可以看出：①不同水分下碱性磷酸酶Km总体呈现35%WHC>65%WHC>110%WHC的变化规律，3个水分下Km 均值分别为6.08、4.78、3.66 mmol·L-1，表明随水分含量增加，土壤碱性磷酸酶与底物的亲和力增强，酶与底物更易结合.②除个别处理外，其余处理土壤碱性磷酸酶Km随砷含量增加而显著增大，表明砷污染导致碱性磷酸酶与底物亲和力减弱.③不同处理下Km值虽有差异，但处于同一数量级，整个试验处理中Km变幅为2.34~10.95 mmol·L-1.④不同培养时间的Km变化较小，如砷含量为100 mg·kg-1时，35%WHC、65%WHC、110%WHC下Km变化范围分别为5.12~6.44、4.23~5.54、2.35~4.41 mmol·L-1，表明培养时间对土壤酶与底物亲和力影响较弱.⑤相关分析显示，35%WHC、65%WHC下砷含量与Km呈显著相关(r>0.913*)，而110%WHC下则相关性较差，表明干燥条件下砷显著降低土壤酶与底物的亲和力.

表 1 供试土壤碱性磷酸酶米氏常数